利用乳腺生物反应器提高乳汁中褪黑素含量的方法与流程

文档序号:11722521阅读:347来源:国知局
利用乳腺生物反应器提高乳汁中褪黑素含量的方法与流程

本发明涉及基因工程及农业类畜牧兽医领域,具体地说,涉及一种利用乳腺生物反应器提高乳汁中褪黑素含量的方法。



背景技术:

褪黑素(n-acetyl-5-methoxytryptamine)是一种生物钟的调节激素,参与神经和外周组织细胞时钟基因的表达调控。褪黑素是两亲分子,容易进入所有的亚细胞结构空间,包括细胞膜膜结构、细胞质、细胞核和线粒体中。在各种各样复杂的生理活动中,褪黑素是一种强效的活性氧(ros)和活性氮(rns)的自由基清除剂。乙酰基转移酶(aanat)和羟基吲哚-o-甲基转移酶(hiomt)被证明是合成褪黑素的关键限速酶。血液褪黑素主要合成器官在松果体中,5-羟色胺(5-ht)来自血液中的色氨酸的脱羧反应,在aanat的催化下转变为n-乙酰基-五羟色胺(nas);在乙酰血清素-o-甲基转移酶(hiomt)的催化下,合成褪黑素。松果体中aanat酶的活力受光的抑制,表现出昼夜节律,其活力与血液及松果体褪黑素水平一致;hiomt在褪黑素周期中发挥重要作用,其活力与褪黑素的产生呈正相关。研究表明这两种酶是褪黑素合成途径中的重要催化剂,直接影响褪黑素的合成产量。

褪黑素在不同组织中具有多种生物活性。褪黑素的代谢产物n-acetyl-n-formyl-5-methoxykynuramine(afmk)和n-acetyl-5-methoxykynuramine(amk)也是高效的抗氧化剂。褪黑素与自由基发生的反应是一种不可逆的氧化反应,不能被循环利用,它在氧化过程中形成的各级中间代谢产物都具有显著的抗氧化能力,有的作用甚至超过褪黑素本身,形成褪黑素级联放大的抗氧化机制。褪黑素被认为是一种抗衰老的激素,它还具有提高睡眠质量和发展免疫的功能。其中,已知褪黑素可以影响胃肠道平滑肌,具有放松平滑肌和催眠的效果。它可能有助于婴儿更好的夜间睡眠,从而促进免疫系统的发展和早期的昼夜节律建立。外源低浓度的褪黑素可以迅速吸收,发挥抗氧化、抗炎症作用从而影响并调节免疫功能。例如,国外已有高褪黑素含量牛奶“nightmilk”等上市,有更好的促进睡眠效果和提高免疫力的功能。在绵羊乳腺中高表达褪黑素合成限速酶aanat和hiomt,催化5-羟色胺合成高水平褪黑素,使乳汁中褪黑素含量进一步提高,不仅可以使羔羊增强免疫力,提高成活率;同时对于褪黑素功能乳的开发奠定基础,提高东弗利生等乳用羊的产品附加值。



技术实现要素:

本发明的目的是提供一种利用乳腺生物反应器提高乳汁中褪黑素含量的方法。

为了实现本发明目的,本发明首先提供过表达褪黑素关键合成酶aanat和hiomt基因的原核胚的构建方法,包括以下步骤:

(1)分别将褪黑素关键合成酶aanat和hiomt的cdna插入表达载体中,构建得到重组表达载体;

(2)cas9cdna及sgrna的制备:将经过密码子优化后的cas9序列及sgrna序列分别构建到包含t7启动子的载体上,然后通过体外转录分别得到cas9cdna及sgrna产物并纯化;

其中,sgrna的作用位点位于羊mstn基因第三外显子区,sgrna作用位点的核苷酸序列为5’-gacatctttgtaggagtacagcaa-3’;

cas9cdna的核苷酸序列如seqidno:1所示;

(3)将(1)构建的重组表达载体线性化,然后与cas9cdna及sgrna一起导入哺乳动物的原核期胚胎细胞中,即得。

本发明所述褪黑素关键合成酶aanat和hiomt的cdna来自羊松果体细胞。优选杜泊羊松果体细胞。

前述方法中,步骤(1)所述表达载体为pbc1(携带有酪蛋白启动子)。分别将aanat和hiomt的cdna插入载体pbc1的xhoi多克隆位点之间,得到重组表达载体pbc1-aanat和pbc1-hiomt(质粒结构见图9和图10,载体pbc1-aanat的全序列如seqidno:2所示,将seqidno:2中第8614~9240位碱基替换成seqidno:3所示序列即为载体pbc1-hiomt的全序列)。

前述的方法,步骤(3)是将重组表达载体pbc1-aanat、pbc1-hiomt分别用sali和noti限性内切酶进行线性化处理,分别回收大片段(长度分别为16391bp和16795bp),然后与cas9cdna及sgrna一起通过原核显微注射直接注入羊原核胚的细胞质中。

进行显微注射时,大片段的注射浓度为80ng/μl;cas9cdna的注射浓度为838ng/μl;sgrna的注射浓度为38.7ng/μl;单枚原核胚注射总体积为10pl。

本发明还提供按照上述方法制备的过表达褪黑素关键合成酶aanat和hiomt基因的原核胚。

本发明还提供所述原核胚在制备动物乳腺反应器、转基因动物以及转基因细胞系中的应用。

本发明还提供一种利用乳腺生物反应器提高乳汁中褪黑素含量的方法,其是将所述原核胚移入受体羊的输卵管中,经过妊娠、分娩,获得阳性转基因羊,获得的转基因羊的原代或后代母羊在泌乳期的乳汁中产生褪黑素,从而提高乳汁中褪黑素含量。

其中,用于鉴定阳性转基因羊的特异性pcr引物包括:

a8-f5’-gtccagcacttcctgaccct-3’

mlt-r5’-catcagaagttaaacagcacagttag-3’;

h4-f5’-atacgctgtttcctcatcttcc-3’

mlt-r5’-catcagaagttaaacagcacagttag-3’;

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pbc1-r5’-catcagaagttaaacagcacagttag-3’。

所述泌乳期包括人工诱导泌乳期和自然分泌泌乳期;所述人工诱导泌乳期和自然泌乳期包括泌乳前期、泌乳中期和泌乳后期。

本发明所述羊为绵羊。

本发明进一步提供按照上述方法制备的褪黑素功能乳。

本发明具有以下优点:

(一)本发明利用羊乳腺反应器合成褪黑素限速酶,从而生产天然褪黑素和褪黑素功能乳。在将羊自身的褪黑素合成酶cdna连接酪蛋白启动子整合到羊基因组中,最大程度地减少了转基因动物自身的外来蛋白的影响。转入的基因中无标记、无抗性基因、也无细菌载体片段,不仅避免了密码子偏好的问题,更符合转基因安全的要求。

(二)通过高效的crispr/cas9系统,制作褪黑素乳腺生物反应器,获得的羊aanat和hiomt基因拷贝数增加1个以上,aanat和hiomt蛋白表达上升。利用乳腺生产高水平天然褪黑素,不仅可以提高乳腺健康水平、生产高质量的乳汁,增强羔羊免疫力,提高羔羊成活率;还可以解决目前褪黑素主要依赖化学合成,造成微量杂质残留的问题,又可以规避生物提取潜在的病原物质感染的风险。而且羊乳腺反应器和产品均具有重要的研究价值和商业前景。

(三)实验表明,本发明的阳性转基因羊乳腺细胞褪黑素合成酶的表达量显著提高。在催乳素诱导下,阳性乳腺细胞可合成高水平褪黑素,并且阳性羊血液中的褪黑素水平也显著高于普通羊。转基因羊整个泌乳期阶段都具有分泌褪黑素合成酶的能力,并且通过育种选择,能进一步提高转基因羊的褪黑素表达量。

附图说明

图1为本发明实施例1中线性化pbc1-aanat/hiomt载体结构示意图。其中,线性化的pbc1-aanat为16391bp,pbc1-hiomt为16795bp;pβ-casein为羊β-casein启动子;e1为羊β-casein外显子1;ivs1为羊β-casein内含子1。

图2为本发明实施例1中转基因后代的aanat、hiomt基因southern检测结果。其中,aanat基因阳性条带约为5.2kb,1-5为pcr阳性个体,wt为阴性对照,p为表达载体质粒。hiomt基因阳性条带约为700bp,内源条带约为11kb,1-10为pcr阳性个体,wt为阴性对照。

图3为本发明实施例1中转染乳腺上皮细胞系中aanat和hiomt基因相对表达量。其中,*表示差异显著,p<0.05,**表示差异极显著,p<0.01,n=4。图4为本发明实施例1中转染乳腺上皮细胞匀浆中褪黑素含量。其中,*表示差异显著,p<0.05,n=4。

图5为本发明实施例1中转基因阳性羊早晚血清中褪黑素浓度。其中,*表示差异显著,p<0.05,**表示差异极显著,p<0.01,n=14。

图6为本发明实施例1中转染乳腺上皮细胞系的细胞培养基中添加5-ht(10-4mol/l)后,随时间变化的褪黑素合成量。

图7为本发明实施例1中转基因后代乳腺上皮细胞aanat和hiomt相对表达量。其中,**表示差异极显著,p<0.01,n=4。

图8为本发明实施例1中乳腺细胞合成酶表达量及奶中褪黑素的浓度。其中,a中1-4为转基因阳性个体,5-8为野生型个体;b中**表示差异极显著,p<0.01,n=4。

图9为本发明实施例1中重组表达载体pbc1-aanat的结构示意图。

图10为本发明实施例1中重组表达载体pbc1-hiomt的结构示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例均按照常规实验条件,如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001),或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1利用羊乳腺生物反应器提高乳汁中褪黑素含量的方法

1.基因克隆和表达载体构建

从杜泊羊松果体中提取总rna(ovisaries),合成cdna第一链。分别扩增出aanat和hiomt完整的开放阅读框(orf)和部分上下游非编码区(引物见表1)。aanat和hiomt的pcr产物单酶切后连接到pmdtm19-t载体中测序,基因片段的大小分别为634bp和1048bp。测序验证后的cdna片段连接到乳腺特异性表达载体pbc1(invitrogen)上。重组载体命名为pbc1-aanat和pbc1-hiomt(seqidno:1和2,质粒结构见图9和图10)。两者均由β-酪蛋白启动子驱动生产重组蛋白。线性化pbc1-aanat/hiomt载体结构见图1。

表1基因克隆引物

2.cas9cdna及sgrna的制备

将经过密码子优化后的cas9序列及sgrna序列分别构建到包含t7启动子的载体pcdna3.1(+)(invitrogen)上,然后通过体外转录分别得到cas9cdna及sgrna产物并纯化。

其中,sgrna的作用位点位于羊mstn基因第三外显子区,sgrna作用位点的核苷酸序列为5’-gacatctttgtaggagtacagcaa-3’。

cas9cdna的核苷酸序列如seqidno:1所示。

3.原核胚细胞质内显微注射生产转基因羊

乳腺表达载体pbc1-aanat和pbc1-hiomt进行线性化处理。利用sali和noti限性内切酶可以释放5.9kb的细菌质粒部分与线性dna大片段,dna大片段长度分别为16391bp和16795bp。线性dna为表达构件、包含调控元件和插入的目的基因cdna。

以杜泊羊为供体进行超数排卵。通过等量混合pbc1-aanat和pbc1-hiomt两个表达载体,以及cas9cdna和sgrna,采用原核显微注射直接注入羊原核胚的细胞质中,生产过表达褪黑素合成基因的绵羊后代。

大片段的注射浓度为80ng/μl;cas9cdna的注射浓度为838ng/μl;sgrna的注射浓度为38.7ng/μl;单枚原核胚注射总体积为10pl。

从62只供体羊中共获得593枚原核注射胚胎,移植到所有150个受体母羊输卵管内,21天超声检查后77只妊娠,妊娠率为51.33%(表2)。我们共获得98只胚胎移植绵羊后代,其中包括经测序鉴定的34只转基因阳性羔羊,产羔率和转基因pcr测序鉴定阳性率分别为65.33%和34.69%(表2)。其中,有7只携带外源aanat基因,2只携带外源hiomt基因,其余25羔羊同时携带aanat和hiomt两种基因。

表2原核注射生产转基因绵羊统计

表3转基因后代鉴定引物

*a8-f、h4-f分别鉴定转入的aanat、hiomt基因,与mlt-r共同使用;利用pbc1-f/r鉴定转aanat基因后代,扩增产物大小为765bp,利用pbc1-f/r鉴定转hiomt基因后代,扩增产物大小为1169bp。

通过southern印迹杂交法进一步验证pcr测序结果(图2)。使用dig标记aanat基因的探针分别与个体基因组及载体质粒杂交。基因组与载体质粒均用hindⅲ单酶切彻底消化,获得阳性条带约为5.2kb。wt为野生型个体,p为表达载体。重复验证个体共5个,标号分别为1-5号阳性个体。

4.细胞系中aanat和hiomt基因表达水平

从整合外源aanat和hiomt基因的母羊乳腺处取得上皮细胞,经催乳素诱导培养基培养,以便通过β-酪蛋白启动子启动外源基因的表达。q-pcr检测发现在阳性转染细胞系中,与转染空白载体和对照组细胞系相比,24h至48h范围内aanat和hiomt基因在mrna水平表达差异极显著(n=4,p<0.01;图3)。

转染乳腺上皮细胞匀浆中褪黑素含量见图4。

5.转基因后代aanat和hiomt基因表达水平

获得转aanat和hiomt双基因群体后,分别在早晨4:00和下午16:00对其血清中褪黑素水平进行了测定。转基因组与野生型组羊相比4:00和16:00褪黑素浓度差异不显著(n=10,p>0.05)(图5)。

取泌乳期转基因和野生型羊乳腺上皮细胞,原代培养下并检测基因表达情况。褪黑素的测定表明,通过培养基添加底物5-ht(10-4mol/l),2小时后发现野生型和转基因细胞之间差异显著(n=4,p<0.01。图6)。q-pcr显示转基因个体与阴性或是野生型个体相比,mrna转录水平的差异极显著(n=4,p<0.01),高出约10倍(图7)。western印记杂交法测定活性受调控的合成限速酶aanat表达水平。转基因合成限速酶aanat(23kd)表达水平明显高于野生型(1-4为转基因个体,4-8为野生型个体。内参actin-β43kd,图8a)。分别在4:00和16:00对转基因组羊奶中褪黑素水平进行了测定。转基因组羊奶中夜间褪黑素含量极显著地高于野生型组(n=4,p<0.01,图8b),提高3倍左右。

本发明利用原核注射技术生产转基因羊,快速引入新的基因——褪黑素合成限速酶基因,产生期望的生产性状——乳中高含量天然褪黑素。并在此基础上建立育种群体,进一步选育表达性状优良的个体,为家畜新品种培育打下良好基础。同时能提高羔羊的健康状况、提高存活率,为羊养殖产业服务。在新品种培育的基础上,该技术用于开发褪黑素功能乳产品,发挥其保健功能的作用以便人类利用,具有积极的社会效益。

羊奶营养价值优良,经济效益高,随着国内消费水平的提高,羊奶的市场前景非常广阔。通过乳腺特异表达载体实现褪黑素合成酶在绵羊乳腺中高效表达,使乳腺分泌高水平褪黑素,改善母羊乳腺功能和羊奶品质,进一步获得具有商业开发价值的褪黑素功能乳转基因羊,可带来巨大的经济效益。

与传统的原核显微注射生产转基因动物的方法(转基因小鼠阳性率约10%,转基因羊阳性率约2~10%)相比,本发明具有很高的阳性率达到34.69%。同时,相比传统的原核注射技术,本方法可实现外源基因的定点整合,可控性和安全性高。

虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之做一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业大学

<120>利用乳腺生物反应器提高乳汁中褪黑素含量的方法

<130>khp171110979.6

<160>9

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>4263

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

aagcttgccaccatggactataaggaccacgacggcgactacaaggatcacgacattgat60

tataaagacgacgacgataagcccaagaaaaaacggaaggtcgataaaaaatatagcatc120

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