一种产玫瑰香味真菌的培育方法与流程

本发明涉及真菌培养技术领域，尤其涉及一种产玫瑰香味真菌的培育方法。

背景技术：

微生物技术是目前最有前途的生产天然食品、化妆品等香料方法之一(Najla_Ben_Akachaa_etal2015；Gatfield_I.L.1999；赵丽青2006)，受到世界各国研究者和生产商的重视，进行产香微生物技术研究是顺应香料工业和生物技术发展的大趋势，与动植物提取法相比大大降低成本和生产周期，具有安全、环保的特点。

目前已报道的产香微生物主要包含真菌(酵母菌、绿色木霉、尖孢镰刀菌等)、细菌(芽孢杆菌、恶臭假单胞菌等)(李倩等，2009；罗建超，谢和，2012)，美国Ginkgo Bioworks公司完成B轮融资4500万美元，用于包括开发产香酵母提取香精香料。本发明提出的一株产生玫瑰香味的根串珠霉真菌，利用GC-MS联用技术鉴定其挥发性香气物质组成。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种产玫瑰香味真菌的培育方法。

一种产玫瑰香味的真菌，由本发明人员从七彩竹芋上分离得到，具有浓郁玫瑰香味的菌株，菌株编号为QCZY15，所述产玫瑰香味的真菌为根串珠霉Thielavioides thielavioides，Genebank注册号：KT963166.1，所述产玫瑰香味的真菌培育方法，包括以下步骤：

S1、将菌株QCZY15接种在PSA培养基上，并置于25℃下恒温培养14d；

S2、将步骤S1中的培养基切碎，装入固相微萃取瓶中，将平衡后的DVB/CAR/PDMS固相微萃取头插入萃取瓶中，压下活塞使纤维头伸出，暴露于样品上层空气中，40℃条件下固相微萃取1小时，提取香气成分。

优选的，所述步骤S1中的PSA培养基的配方为：马铃薯200g、琼脂粉17g、蔗糖20g和水1000ml。

优选的，所述产玫瑰香味的真菌挥发性物质组成包括：乙酸异丁酯含量47.57％；乙酸乙酯13.45％；苯乙烯4.55％；香茅醇2.50％；乙酸香茅酯1.10％。

本发明提出的一种产玫瑰香味真菌的培育方法，操作简单，操作成本低、周期短，安全环保的特点，本发明培育的产玫瑰香味的真菌为根串珠霉，Genebank注册号：KT963166.1，其产生的香气代谢产物中，乙酸乙酯具有类似于果香和酒香的味道，乙酸异丁酯有水果味道，苯乙烯、苯乙醇具有类似于玫瑰香的味道，香茅醇、乙酸香茅酯均具有花香的味道。

附图说明

图1为菌株QCZY15总离子流色谱图；

图2为菌株QCZY15真菌形态图。

具体实施方式

参照图1-2，下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

实施例一

本发明提出的一种产玫瑰香味的真菌，由本发明人员从七彩竹芋上分离得到，具有浓郁玫瑰香味的菌株，菌株编号为QCZY15，所述产玫瑰香味的真菌为根串珠霉Thielavioides thielavioides，Genebank注册号：KT963166.1，所述产玫瑰香味的真菌培育方法，包括以下步骤：

S1、将菌株QCZY15接种在PSA培养基上，并置于25℃下恒温培养14d，其中PSA培养基的配方为：马铃薯200g、琼脂粉17g、蔗糖20g和水1000ml；

S2、将步骤S1中的培养基切碎，装入固相微萃取瓶中，将平衡后的DVB/CAR/PDMS固相微萃取头插入萃取瓶中，压下活塞使纤维头伸出，暴露于样品上层空气中，40℃条件下固相微萃取1小时，提取香气成分。

产玫瑰香味的真菌挥发性物质GC-MS分析条件为：色谱条件：色谱柱为DB-wax石英毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)，程序升温，柱初温40℃，保持5min，以5℃的升温速率升至200℃，再以10℃的升温速率升至240℃，保持5min；载气为高纯氦气，流速1.0mL/min；进样模式为分流进样，分流比为10:1；质谱条件：EI离子源，电子能量70eV，扫描范围33-350amu(如图1)。

产香真菌挥发性物质GC-MS分析结果：产香真菌在PSA培养基上第5天开始产香，14天左右香气浓度达到最大；利用GC-MS技术，从该菌挥发性成分中鉴定出14种主要化合物；分别为乙酸异丁酯含量47.57％；乙酸乙酯13.45％；苯乙烯4.55％；香茅醇2.50％；乙酸香茅酯1.10％。乙酸乙酯(Ethyl Acetate)与乙酸异丁酯(Isobutyl acetate)二者之和占挥发性物质总量61.02％；其中乙酸乙酯具有类似于果香和酒香的味道，乙酸异丁酯有水果味道。苯乙烯、苯乙醇具有类似于玫瑰香的味道，香茅醇、乙酸香茅酯均具有花香的味道。

菌株QCZY15定性分析结果如下：

菌株QCZY15香气成分表如下：

实施例二

本发明提出的一种产玫瑰香味的真菌，由本发明人员从七彩竹芋上分离得到，具有浓郁玫瑰香味的菌株，菌株编号为QCZY15，所述产玫瑰香味的真菌为根串珠霉Thielavioides thielavioides，Genebank注册号：KT963166.1，其分子鉴定实验，包括以下步骤：

S1、病原菌DNA的提取：基因组DNA提取采用chelex-100法快速提取真菌DNA，并置于-20℃冰箱保存备用；

S2、核糖体rDNA-ITS区段扩增：以病菌基因组rDNA为模板进行PCR扩增，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，扩增循环反应条件为：94℃预变性95s；94℃变性35s，52℃退火60s，72℃延伸60s；35个循环；最终72℃延伸15min，4℃保存，ITS-PCR扩增反应在25μL反应体系中进行(见下表)：

引物：ITS1F 5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′

ITS4 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′

S3、取2μL PCR扩增产物和3μL核酸染料混合，于1.2％的琼脂糖凝胶上电泳检测，电泳缓冲液为0.5x TBE，在120V电压下进行45min，置于UPV紫外成像系统上观察成像，并拍照；

S4、PCR产物测序和序列分析：将PCR扩增产物送华大基因公司进行正反双向测序，测序结果在GenBank(http://www.ncbi.nih.gov)中进行BLAST比对分析。

rDNA-ITS产物测序结果：基因转录间隔区引物对(ITS1F和ITS4)扩增到600bp左右的基因转录间隔区及核糖体RNA基因片段。由北京三博远志生物技术有限公司对rDNA–ITS扩增产物进行了双向测序。结果在NCBI上进行对比，结果表明所扩增的片段与GenBank中已发表的根串珠霉Thielavioides thielavioides基因AF275486、AF275487的同源性达到了100％。从分子水平证明该真菌就是根串珠霉Thielavioides thielavioides。Genebank注册号：KT963166.1。

实施例三

本发明提出的一种产玫瑰香味的真菌，由本发明人员从七彩竹芋上分离得到，具有浓郁玫瑰香味的菌株，菌株编号为QCZY15，所述产玫瑰香味的真菌为根串珠霉Thielavioides thielavioides，Genebank注册号：KT963166.1，其形态学鉴定结果为：在PSA培养基上恒温培养14d后，直径为64mm，菌丝初为白色，后变为淡绿色，最后白化为菌落表面白色；圆柱状分生孢子(25.5-54.1)μm×(4.3-5.5)μm，圆筒状分生孢子直径为(5.1-6.4)μm；厚垣孢子为厚壁椭圆形棕褐色，其大小为(13.6-15.8)μm×(10.7-12.3)μm(如图2)。

本发明提出的一种产玫瑰香味真菌的培育方法，操作简单，操作成本低、周期短，安全环保的特点，本发明培育的产玫瑰香味的真菌为根串珠霉Thielavioides thielavioides，Genebank注册号：KT963166.1，其产生的香气代谢产物中，乙酸乙酯具有类似于果香和酒香的味道，乙酸异丁酯有水果味道，苯乙烯、苯乙醇具有类似于玫瑰香的味道，香茅醇、乙酸香茅酯均具有花香的味道。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。