本发明属于生物技术领域，涉及一种快速检测铜绿假单胞菌及喹诺酮类耐药基因的重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplification，rpa)的引物及其应用，具体涉及一种可同时检测出铜绿假单胞菌及喹诺酮类耐药基因(qnrs)的rpa快速检测的引物及其应用。
背景技术：
铜绿假单胞菌是医院内感染的主要病原菌之一。患血液病、代谢性疾病和恶性肿瘤的患者，以及术后或某些治疗后的患者易感染本菌。通过医护人员可将病菌传给病人，特别在灼伤和新生儿重症监护室，是重要的医院内病原菌。除医院内获得感染外，hiv感染者很容易在社区获得该菌的感染，而且一旦被铜绿假单胞菌感染，常可出现晚期hiv感染的体征。如今由于广谱抗生素、激素以及免疫抑制剂的广泛使用，铜绿假单胞菌对多种抗生素快速产生耐药性在临床抗感染的一线战场己是不争的事实，对庆大霉素、头孢噻甲羧肟、哌拉西林等亦早己产生不同程度的耐药性，这就使得临床的抗感染治疗显得越来越困难。而喹诺酮类药物由于其敏感性极强，作用范围广，毒性低，价格适中的特点被广泛的使用于铜绿假单胞感染病症的治疗中，然而近年来的研究发现其耐药菌发生率逐年增高，大量耐药菌株的存在和流行使得由铜绿假单胞所引起疾病的发病率和死亡率不断增加。这一现象引起世人的广泛关注，因此我们急需一种快速准确、特异性强、灵敏度高的的现代检测手段来检测耐药铜绿假单胞菌。
目前铜绿假单胞菌的检测主要包括培养皿法-酶法(β-葡萄糖苷酸酶分析)、免疫法(抗原搜寻)、基因法(基因搜寻)，但在操作程序、检测时间、特异性检测等方面尚不理想。在近些年来科学家的不断探究中，重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplification，rpa)检测方法应运而生，它在现有体外核酸扩增原理的基础上发展起来的恒温体外快速扩增核酸技术。研究人员只需根据所研究的样品在对应的生物靶标基因序列中设计rpa对应的特异性引物与探针(引物长度通常需要达到30-38个碱基)，利用单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶(recombinase)、单链结合蛋白(ssb)和链置换dna聚合酶(polynerase)等三种特定酶，只需在25～43℃的恒温条件下，便可实现特定核酸序列的扩增且能在5～20min观察到结果。对比我们常用的pcr技术，rpa的反应更加快速便捷，实现恒温无需不同的温度环节，对实验仪器的依赖性低，可降低实验成本，实现野外实时检测。rpa的结果可通过琼脂凝胶电泳检测来读取，也可以通过试纸条进行读取。
应用rpa技术对样品中铜绿假单胞菌中喹诺酮类耐药基因进行研究，在恒温条件下5-20分钟内对靶基因进行有效扩增，在检测铜绿假单胞菌的同时还可检验铜绿假单胞菌中的喹诺酮类耐药基因，对携带喹诺酮类耐药基因的铜绿假单胞菌的研究提供科学依据和理论基础，在医药卫生，公共卫生等方面有着重要的意义。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种可同时检测铜绿假单胞菌及喹诺酮类耐药基因(qnrs)的rpa快速检测的引物序列。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
为实现上述目的，本发明根据铜绿假单胞菌及喹诺酮类耐药基因(qnrs)的特征靶基因设计出2对特异性引物f1/r1、f2/r2，见表1。各特异性引物具有高度种内保守、种间特异性等优点。扩增后片段长度大小各异，铜绿假单胞菌扩增后产物大小为416bp，喹诺酮类耐药基因(qnrs)扩增后产物大小为202bp，可通过电泳进行分开辨别。
表1、rpa快速检测特异性引物序列
具体检测方法包括以下步骤：
步骤(1).样品dna提取
取1ml培养好的菌液加入至1.5ml离心管，12000g离心1min，弃上清，在离心管内加入400μl裂解液，混匀后加600μl酚-氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入为该上清液0.8倍体积的异丙醇，12000g离心10min；取沉淀，用体积含量为70％的乙醇清洗1次，再在常温或50℃下晾干20min，然后加入80μlph值为8.0的te缓冲溶液溶解，得到dna提取物；该dna提取物即为模板dna；将dna提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板dna的浓度与纯度；
所述的酚-氯仿-异戊醇混合溶剂由酚、氯仿、异戊醇按照体积比25∶24∶1混合而成；
所述的氯仿-异戊醇混合溶剂由氯仿、异戊醇按照体积比24∶1混合而成；
所述的te缓冲液为1ml浓度为1m、ph值为8.0的tris-cl，0.2ml浓度为0.5m、ph值为8.0的edta，定容至100ml溶液；
所述的裂解液为tris-hcl、乙二胺四乙酸edta、nacl、蛋白酶k、十二烷基硫酸钠sds组成的混合液，其中tris-hcl的浓度为50mm、ph值为8.0，乙二胺四乙酸edta的浓度为25mm，nacl的浓度为100mm，蛋白酶k的浓度为20μg/μl，十二烷基硫酸钠sds的质量分数为10％；
步骤(2).rpa扩增
将rpa扩增反应体系振荡混匀后，进行rpa扩增，得到扩增产物。
所述的rpa扩增反应体系即rpa凝胶检测体系为50μl由含有冻干酶粉的0.2mltwistampbasic反应管中加入再水化缓冲液(rehydrationbuffer)29.5μl，去离子水11μl，混合引物6μl(10μmol/l)，提取的样品基因组dna1μl，醋酸镁溶液2.5μl(280mmol/l)组成。
将rpa扩增反应体系振荡混匀后，放入37℃恒温金属浴反应18min，得到扩增产物；
所述的加入的混合引物为2对特异性引物的混合引物，其中2对特异性引物的浓度比为f1∶r1∶f2∶r2＝1∶1∶1∶1。
步骤(3).扩增产物电泳检测
反应结束后，取扩增产物2～3μl，于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。如果在416bp处有特异性条带，说明该细菌是铜绿假单胞菌；如果在202bp处有特异性条带，说明该菌不是铜绿假单胞菌，但是该细菌存在喹诺酮类耐药基因(qnrs)；如果在202bp与416bp处都有特异性条带，说明该细菌为携带喹诺酮类耐药基因(qnrs)的铜绿假单胞菌。无条带则为阴性，说明该菌既不是铜绿假单胞菌又不携带喹诺酮类耐药基因(qnrs)。
本发明的有益效果：本发明设计的引物具有较好的种间特异性和种内保守性，该技术能在一次反应中检测出铜绿假单胞菌及喹诺酮类耐药基因(qnrs)，短时间内可判断该菌是否为携带喹诺酮类耐药基因(qnrs)的铜绿假单胞菌，因此更加便捷、高效。
附图说明
图1为携带喹诺酮类耐药基因的铜绿假单胞菌rpa检测图谱，其中m：marker；泳道1：铜绿假单胞菌扩增条带；泳道2：喹诺酮类耐药基因(qnrs)扩增条带；泳道3：携带喹诺酮类耐药基因(qnrs)的铜绿假单胞菌扩增条带；泳道4：阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的分析。
实施例1.
步骤(1).样品dna提取
取1ml培养好的菌液加入至1.5ml离心管，12000g离心1min，弃上清，在离心管内加入400μl裂解液，混匀后加600μl酚-氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入为该上清液0.8倍体积的异丙醇，12000g离心10min；取沉淀，用体积含量为70％的乙醇清洗1次，再在常温或50℃下晾干20min，然后加入80μlph值为8.0的te缓冲溶液溶解，得到dna提取物；该dna提取物即为模板dna；将dna提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板dna的浓度与纯度；
所述的酚-氯仿-异戊醇混合溶剂由酚、氯仿、异戊醇按照体积比25∶24∶1混合而成；
所述的氯仿-异戊醇混合溶剂由氯仿、异戊醇按照体积比24∶1混合而成；
所述的te缓冲液为1ml浓度为1m、ph值为8.0的tris-cl，0.2ml浓度为0.5m、ph值为8.0的edta，定容至100ml溶液；
所述的裂解液为tris-hcl、乙二胺四乙酸edta、nacl、蛋白酶k、十二烷基硫酸钠sds组成的混合液，其中tris-hcl的浓度为50mm、ph值为8.0，乙二胺四乙酸edta的浓度为25mm，nacl的浓度为100mm，蛋白酶k的浓度为20μg/μl，十二烷基硫酸钠sds的质量分数为10％；
步骤(2).rpa扩增
将rpa扩增反应体系振荡混匀后，进行rpa扩增，得到扩增产物。
所述的rpa扩增反应体系即rpa凝胶检测体系为50μl由含有冻干酶粉的0.2mltwistampbasic反应管中加入再水化缓冲液(rehydrationbuffer)29.5μl，去离子水11μl，混合引物6μl(10μmol/l)，提取的样品基因组dna1μl，醋酸镁溶液2.5μl(280mmol/l)组成。
将rpa扩增反应体系振荡混匀后，放入37℃恒温金属浴反应18min，得到扩增产物；
所述的加入的混合引物为2对特异性引物的混合引物，其中2对特异性引物的浓度比为f1∶r1∶f2∶r2＝1∶1∶1∶1。
步骤(3).扩增产物电泳检测
反应结束后，取扩增产物2～3μl，于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。结果显示，在416bp处有特异性条带，说明该细菌是铜绿假单胞菌。
实施例2.
步骤(1).样品dna提取
取1ml培养好的菌液加入至1.5ml离心管，12000g离心1min，弃上清，在离心管内加入400μl裂解液，混匀后加600μl酚-氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入为该上清液0.8倍体积的异丙醇，12000g离心10min；取沉淀，用体积含量为70％的乙醇清洗1次，再在常温或50℃下晾干20min，然后加入80μlph值为8.0的te缓冲溶液溶解，得到dna提取物；该dna提取物即为模板dna；将dna提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板dna的浓度与纯度；
所述的酚-氯仿-异戊醇混合溶剂由酚、氯仿、异戊醇按照体积比25∶24∶1混合而成；
所述的氯仿-异戊醇混合溶剂由氯仿、异戊醇按照体积比24∶1混合而成；
所述的te缓冲液为1ml浓度为1m、ph值为8.0的tris-cl，0.2ml浓度为0.5m、ph值为8.0的edta，定容至100ml溶液；
所述的裂解液为tris-hcl、乙二胺四乙酸edta、nacl、蛋白酶k、十二烷基硫酸钠sds组成的混合液，其中tris-hcl的浓度为50mm、ph值为8.0，乙二胺四乙酸edta的浓度为25mm，nacl的浓度为100mm，蛋白酶k的浓度为20μg/μl，十二烷基硫酸钠sds的质量分数为10％；
步骤(2).rpa扩增
将rpa扩增反应体系振荡混匀后，进行rpa扩增，得到扩增产物。
所述的rpa扩增反应体系即rpa凝胶检测体系为50μl由含有冻干酶粉的0.2mltwistampbasic反应管中加入再水化缓冲液(rehydrationbuffer)29.5μl，去离子水11μl，混合引物6μl(10μmol/l)，提取的样品基因组dna1μl，醋酸镁溶液2.5μl(280mmol/l)组成。
将rpa扩增反应体系振荡混匀后，放入37℃恒温金属浴反应18min，得到扩增产物；
所述的加入的混合引物为2对特异性引物的混合引物，其中2对特异性引物的浓度比为f1∶r1∶f2∶r2＝1∶1∶1∶1。
步骤(3).扩增产物电泳检测
反应结束后，取扩增产物2～3μl，于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。结果显示，在202bp处有特异性条带，说明该菌不是铜绿假单胞菌，但是该细菌存在喹诺酮类耐药基因(qnrs)。
实施例3.
步骤(1).样品dna提取
取1ml培养好的菌液加入至1.5ml离心管，12000g离心1min，弃上清，在离心管内加入400μl裂解液，混匀后加600μl酚-氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入为该上清液0.8倍体积的异丙醇，12000g离心10min；取沉淀，用体积含量为70％的乙醇清洗1次，再在常温或50℃下晾干20min，然后加入80μlph值为8.0的te缓冲溶液溶解，得到dna提取物；该dna提取物即为模板dna；将dna提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板dna的浓度与纯度；
所述的酚-氯仿-异戊醇混合溶剂由酚、氯仿、异戊醇按照体积比25∶24∶1混合而成；
所述的氯仿-异戊醇混合溶剂由氯仿、异戊醇按照体积比24∶1混合而成；
所述的te缓冲液为1ml浓度为1m、ph值为8.0的tris-cl，0.2ml浓度为0.5m、ph值为8.0的edta，定容至100ml溶液；
所述的裂解液为tris-hcl、乙二胺四乙酸edta、nacl、蛋白酶k、十二烷基硫酸钠sds组成的混合液，其中tris-hcl的浓度为50mm、ph值为8.0，乙二胺四乙酸edta的浓度为25mm，nacl的浓度为100mm，蛋白酶k的浓度为20μg/μl，十二烷基硫酸钠sds的质量分数为10％；
步骤(2).rpa扩增
将rpa扩增反应体系振荡混匀后，进行rpa扩增，得到扩增产物。
所述的rpa扩增反应体系即rpa凝胶检测体系为50μl由含有冻干酶粉的0.2mltwistampbasic反应管中加入再水化缓冲液(rehydrationbuffer)29.5μl，去离子水11μl，混合引物6μl(10μmol/l)，提取的样品基因组dna1μl，醋酸镁溶液2.5μl(280mmol/l)组成。
将rpa扩增反应体系振荡混匀后，放入37℃恒温金属浴反应18min，得到扩增产物；
所述的加入的混合引物为2对特异性引物的混合引物，其中2对特异性引物的浓度比为f1∶r1∶f2∶r2＝1∶1∶1∶1。
步骤(3).扩增产物电泳检测
反应结束后，取扩增产物2～3μl，于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。结果显示，在202bp与416bp处都有特异性条带，说明该细菌为携带喹诺酮类耐药基因(qnrs)的铜绿假单胞菌。
实施例4.
步骤(1).样品dna提取
取1ml培养好的菌液加入至1.5ml离心管，12000g离心1min，弃上清，在离心管内加入400μl裂解液，混匀后加600μl酚-氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入为该上清液0.8倍体积的异丙醇，12000g离心10min；取沉淀，用体积含量为70％的乙醇清洗1次，再在常温或50℃下晾干20min，然后加入80μlph值为8.0的te缓冲溶液溶解，得到dna提取物；该dna提取物即为模板dna；将dna提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板dna的浓度与纯度；
所述的酚-氯仿-异戊醇混合溶剂由酚、氯仿、异戊醇按照体积比25∶24∶1混合而成；
所述的氯仿-异戊醇混合溶剂由氯仿、异戊醇按照体积比24∶1混合而成；
所述的te缓冲液为1ml浓度为1m、ph值为8.0的tris-cl，0.2ml浓度为0.5m、ph值为8.0的edta，定容至100ml溶液；
所述的裂解液为tris-hcl、乙二胺四乙酸edta、nacl、蛋白酶k、十二烷基硫酸钠sds组成的混合液，其中tris-hcl的浓度为50mm、ph值为8.0，乙二胺四乙酸edta的浓度为25mm，nacl的浓度为100mm，蛋白酶k的浓度为20μg/μl，十二烷基硫酸钠sds的质量分数为10％；
步骤(2).rpa扩增
将rpa扩增反应体系振荡混匀后，进行rpa扩增，得到扩增产物。
所述的rpa扩增反应体系即rpa凝胶检测体系为50μl由含有冻干酶粉的0.2mltwistampbasic反应管中加入再水化缓冲液(rehydrationbuffer)29.5μl，去离子水11μl，混合引物6μl(10μmol/l)，提取的样品基因组dna1μl，醋酸镁溶液2.5μl(280mmol/l)组成。
将rpa扩增反应体系振荡混匀后，放入37℃恒温金属浴反应18min，得到扩增产物；
所述的加入的混合引物为2对特异性引物的混合引物，其中2对特异性引物的浓度比为f1∶r1∶f2∶r2＝1∶1∶1∶1。
步骤(3).扩增产物电泳检测
反应结束后，取扩增产物2～3μl，于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。结果显示，无特异性条带，说明该菌既不是铜绿假单胞菌又不携带喹诺酮类耐药基因(qnrs)。