本发明属于化学品毒性的生物检测
技术领域：
，具体来讲是涉及一种利用热带爪蟾胚胎测定化学品发育毒性的方法。
背景技术：
：热带爪蟾是负子蟾科下的一种青蛙。它们是爪蟾属下唯一拥有二倍体基因组的，且已被dna序列，补充了非洲爪蟾成为遗传学上的模式生物。特征是无舌,上叛有齿,耳咽管(欧氏管)汇合成一个,仅有一耳咽管口,开口在上瓢的后端。颤骨很原始,蝶筋骨和副蝶骨癫合在一起。上颖骨退化,具有瘤合的前锄骨。身体遍布粘液腺,因此很滑、后肢有五趾,趾简有蹼,其中三趾生有黑色趁利的爪,故名爪蟾躲,籍牛保留侧换器官,永远生活在水中,幼体从卵中孵出时已无外鳃。补充了非洲爪蟾成为遗传学上的模式生物。与非洲爪蟾相比，热带爪蟾个体更小、生长周期更短(3-6个月)、产卵量更大(2000-3000个)、基因组结构(2倍体)更简单和胚胎发育更快等优点。因此热带爪蟾是发育生物学、胚胎学和细胞生物学中重要的模式生物。与鱼类相比，热带爪蟾与人类的亲缘关系更近，更适合于进行健康风险评价。并且对于某些污染物，热带爪蟾更为敏感，热带爪蟾一年四季均可人工诱导排卵，并且产卵量大，保证了充足的实验材料。热带爪蟾胚胎非常适合进行分子操作，目前不仅发展了针对爪蟾早期胚胎发育的成熟的实验技术，如显微注射、转基因和荧光原位杂交等技术，而且大量针对热带爪蟾的特异性抗体甚至基因芯片等均可从商业途径获得。运用爪蟾胚胎畸形表型特征，结合分子标志物能够灵敏地表征微污染水体的毒理学效应。热带爪蟾在生态毒理学研究中具有广阔的应用前景。有研究表明，热带爪蟾蝌蚪可用于甲状腺激素干扰物的筛选，并且由于热带爪蟾性成熟快等特点，在生殖毒性的研究中有明显优势。在热带爪蟾作为模式生物发展日益成熟和毒理学体外测试方法需求强烈的双重背景下，胚胎期的热带爪蟾将在毒理学研究中发挥更重要的作用。胚胎致畸实验是检测污染物发育毒性的有效方法，用胚胎实验代替个体实验也是今后毒性检测和毒理学研究的趋势。爪蟾胚胎致畸实验(fetax)已被广泛应用于污染物和环境样品毒性效应的检测。热带爪蟾在胚胎致畸实验中可以取代非洲爪蟾，不同浓度的污染物引起的胚胎畸形特征不同，这为污染物致畸机制的解析提供了形态学依据。技术实现要素：本发明解决的技术问题是提供了一种利用热带爪蟾胚胎测定化学品发育毒性的方法，检测过程简单，适应性强，结果准确，可对化学品产生的毒性进行程度分级，直观方便。本发明的技术方案为：一种利用热带爪蟾胚胎测定化学品发育毒性的方法，主要包括以下步骤：(1)挑选合适的胚胎，然后用胚胎培养液清洗2-3次去除坏卵和杂质后，置于胚胎培养液中，在25℃，无光照的恒温培养箱中进行静置培养，在显微镜下挑选来自同一亲本、正常发育比率达80％以上且发育时期一致的热带爪蟾胚胎，备用；(2)化学品毒性对比暴露实验：a.将待测的化学品溶于标准稀释水中，分别配制成10mg/l、30mg/l、50mg/l的待测液装入试剂瓶中，每个试剂瓶中装待测液20ml，将试剂瓶用膜封口后置于2℃冰箱避光保存，备用；b.将挑选的热带爪蟾活体胚胎分为四组，每组10-20只，分别标记为试验组1、试验组2、试验组3、对照组，每组的热带爪蟾活体胚胎生理情况无明显差异，具有可比性；c.将试验组的胚胎进行活体培养，然后给三组试验组中分别加入10mg/l、30mg/l、50mg/l的待测液，对照组继续使用胚胎培养液培养，然后将所述的胚胎置于多功能培养箱中进行暴露实验，光照12h，黑暗12h，24h后观察每组是否有胚胎死亡，记录死亡数据，将未死亡的胚胎取出后使用100mg/lms-222麻醉处理后，然后固定在6％的甲醛溶液中，备用；(3)使用解剖镜观察不同化学品浓度下胚胎的发育情况，通过显微镜照相系统获取每只胚胎的特征图像，并将试验组于对照组进行比较，从而根据每组胚胎的畸形类型及表型特征体系对应的畸形系数来判断化学品的毒性程度。进一步的，所述的挑选合适的胚胎是指挑选实验室养殖的性成熟的热带爪蟾多对，热带爪蟾的各项生命体征正常，采用人工注射hcg(人绒毛膜促性腺激素)的方法诱导产卵，每只爪蟾都进行两次注射，初次注射20iu，36小时后，再次注射给雌性爪蟾注射130-150iu单位，雄性爪蟾注射100-120iu，从热带爪蟾的背部注射，注射完成后将雌雄个体进行配对，待蛙抱对产卵结束后收集胚胎即可。进一步的，所述的胚胎培养液的制备方法为：给300ml的ph为7-8的弱碱性的人工合成输卵管液中加入100iu/ml的青霉素3-5ml、100μg/ml的链霉素1-3ml及10-15mg/ml的血清白蛋白20-30mg，震荡摇匀充分溶解后加入人工合成输卵管液定容至500ml，再给定容后的溶液中加入10mmnacl60ml、15mmkcl50ml、5-10μg/ml的植物多糖10ml，搅拌均匀，经0.22μm过滤器过滤除菌，3-5℃温度条件下储存，即得到所述的胚胎培养液。进一步的，所述的胚胎活体培养是指将每组的五只热带爪蟾活体胚胎和50ml的胚胎培养液置于玻璃培养皿中，放入恒温培养箱中，温度控制在20-25℃，24小时后更换胚胎培养液一次，连续培养48小时后，观察热带爪蟾胚胎的生理活性，取出死亡的胚胎，备用。进一步的，所述的畸形类型是指主要表现为：眼睛畸形、泄殖腔畸形、鳍畸形、尾巴畸形、皮肤色素畸形。进一步的，所述的畸形类型及表型特征体系是通过实验过程得到不同浓度的化学品污染的胚胎生育的畸形数据，并对畸形类型进行统计，主要表现为：眼睛畸形、泄殖腔畸形、鳍畸形、尾巴畸形、皮肤色素畸形；然后根据畸形表型特征统计建立对应的畸形程度分级(如表1所示)，从而根据对应的化学品浓度数据建立毒性分级体系对应不同毒性浓度的畸形系数(如表2所示)，确定所测化学品的对热带爪蟾的发育毒性强度。表1畸形程度分级表2毒性分级体系毒性程度轻度毒性中度毒性重度毒性畸形系数0-55-1010-15进一步的，所述的畸形系数是指每个热带爪蟾胚胎的所有畸形部位的畸形程度分级的总和。与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：通过挑选发育时期一致的热带爪蟾胚胎的胚胎，然后进行化学品毒性对比暴露实验，通过显微镜照相系统获取每只胚胎的特征图像，从而根据每组胚胎的畸形类型及表型特征体系对应的畸形系数来判断化学品的毒性程度，所建立的胚胎的畸形类型及表型特征体系覆盖全面，原理简单，数据易整理，结果直观。具体实施方式为便于对本发明的理解，下面将结合具体实施例为例做进一步的解释说明，实施例并不构成对本发明实施例的限定。实施例1：一种利用热带爪蟾胚胎测定化学品发育毒性的方法，主要包括以下步骤：(1)挑选合适的胚胎，然后用胚胎培养液清洗2次去除坏卵和杂质后，置于胚胎培养液中，在25℃，无光照的恒温培养箱中进行静置培养，在显微镜下挑选来自同一亲本、正常发育比率达80％以上且发育时期一致的热带爪蟾胚胎，备用；(2)化学品毒性对比暴露实验：a.将待测的化学品溶于标准稀释水中，分别配制成10mg/l、30mg/l、50mg/l的待测液装入试剂瓶中，每个试剂瓶中装待测液20ml，将试剂瓶用膜封口后置于2℃冰箱避光保存，备用；b.将挑选的热带爪蟾活体胚胎分为四组，每组10只，分别标记为试验组1、试验组2、试验组3、对照组，每组的热带爪蟾活体胚胎生理情况无明显差异，具有可比性；c.将试验组的胚胎进行活体培养，然后给三组试验组中分别加入10mg/l、30mg/l、50mg/l的待测液，对照组继续使用胚胎培养液培养，然后将所述的胚胎置于多功能培养箱中进行暴露实验，光照12h，黑暗12h，24h后观察每组是否有胚胎死亡，记录死亡数据，将未死亡的胚胎取出后使用100mg/lms-222麻醉处理后，然后固定在6％的甲醛溶液中，备用；(3)使用解剖镜观察不同化学品浓度下胚胎的发育情况，通过显微镜照相系统获取每只胚胎的特征图像，并将试验组于对照组进行比较，从而根据每组胚胎的畸形类型及表型特征体系对应的畸形系数来判断化学品的毒性程度。其中，所述的挑选合适的胚胎是指挑选实验室养殖的性成熟的热带爪蟾多对，热带爪蟾的各项生命体征正常，采用人工注射hcg(人绒毛膜促性腺激素)的方法诱导产卵，每只爪蟾都进行两次注射，初次注射20iu，36小时后，再次注射给雌性爪蟾注射130iu单位，雄性爪蟾注射100iu，从热带爪蟾的背部注射，注射完成后将雌雄个体进行配对，待蛙抱对产卵结束后收集胚胎即可。所述的胚胎培养液的制备方法为：给300ml的ph为7的弱碱性的人工合成输卵管液中加入100iu/ml的青霉素3ml、100μg/ml的链霉素1ml及10mg/ml的血清白蛋白20mg，震荡摇匀充分溶解后加入人工合成输卵管液定容至500ml，再给定容后的溶液中加入10mmnacl60ml、15mmkcl50ml、5μg/ml的植物多糖10ml，搅拌均匀，经0.22μm过滤器过滤除菌，3℃温度条件下储存，即得到所述的胚胎培养液。所述的胚胎活体培养是指将每组的五只热带爪蟾活体胚胎和50ml的胚胎培养液置于玻璃培养皿中，放入恒温培养箱中，温度控制在20℃，24小时后更换胚胎培养液一次，连续培养48小时后，观察热带爪蟾胚胎的生理活性，取出死亡的胚胎，备用。所述的畸形类型是指主要表现为：眼睛畸形、泄殖腔畸形、鳍畸形、尾巴畸形、皮肤色素畸形。所述的畸形类型及表型特征体系是通过实验过程得到不同浓度的化学品污染的胚胎生育的畸形数据，并对畸形类型进行统计，主要表现为：眼睛畸形、泄殖腔畸形、鳍畸形、尾巴畸形、皮肤色素畸形；然后根据畸形表型特征统计建立对应的畸形程度分级(如表1所示)，从而根据对应的化学品浓度数据建立毒性分级体系对应不同毒性浓度的畸形系数(如表2所示)，确定所测化学品的对热带爪蟾的发育毒性强度。所述的畸形系数是指每个热带爪蟾胚胎的所有畸形部位的畸形程度分级的总和。实施例2：一种利用热带爪蟾胚胎测定化学品发育毒性的方法，主要包括以下步骤：(1)挑选合适的胚胎，然后用胚胎培养液清洗2次去除坏卵和杂质后，置于胚胎培养液中，在25℃，无光照的恒温培养箱中进行静置培养，在显微镜下挑选来自同一亲本、正常发育比率达80％以上且发育时期一致的热带爪蟾胚胎，备用；(2)化学品毒性对比暴露实验：a.将待测的化学品溶于标准稀释水中，分别配制成10mg/l、30mg/l、50mg/l的待测液装入试剂瓶中，每个试剂瓶中装待测液20ml，将试剂瓶用膜封口后置于2℃冰箱避光保存，备用；b.将挑选的热带爪蟾活体胚胎分为四组，每组15只，分别标记为试验组1、试验组2、试验组3、对照组，每组的热带爪蟾活体胚胎生理情况无明显差异，具有可比性；c.将试验组的胚胎进行活体培养，然后给三组试验组中分别加入10mg/l、30mg/l、50mg/l的待测液，对照组继续使用胚胎培养液培养，然后将所述的胚胎置于多功能培养箱中进行暴露实验，光照12h，黑暗12h，24h后观察每组是否有胚胎死亡，记录死亡数据，将未死亡的胚胎取出后使用100mg/lms-222麻醉处理后，然后固定在6％的甲醛溶液中，备用；(3)使用解剖镜观察不同化学品浓度下胚胎的发育情况，通过显微镜照相系统获取每只胚胎的特征图像，并将试验组于对照组进行比较，从而根据每组胚胎的畸形类型及表型特征体系对应的畸形系数来判断化学品的毒性程度。其中，所述的挑选合适的胚胎是指挑选实验室养殖的性成熟的热带爪蟾多对，热带爪蟾的各项生命体征正常，采用人工注射hcg(人绒毛膜促性腺激素)的方法诱导产卵，每只爪蟾都进行两次注射，初次注射20iu，36小时后，再次注射给雌性爪蟾注射140iu单位，雄性爪蟾注射110iu，从热带爪蟾的背部注射，注射完成后将雌雄个体进行配对，待蛙抱对产卵结束后收集胚胎即可。所述的胚胎培养液的制备方法为：给300ml的ph为7的弱碱性的人工合成输卵管液中加入100iu/ml的青霉素4ml、100μg/ml的链霉素2ml及12.5mg/ml的血清白蛋白25mg，震荡摇匀充分溶解后加入人工合成输卵管液定容至500ml，再给定容后的溶液中加入10mmnacl60ml、15mmkcl50ml、7.5μg/ml的植物多糖10ml，搅拌均匀，经0.22μm过滤器过滤除菌，4℃温度条件下储存，即得到所述的胚胎培养液。所述的胚胎活体培养是指将每组的五只热带爪蟾活体胚胎和50ml的胚胎培养液置于玻璃培养皿中，放入恒温培养箱中，温度控制在22.5℃，24小时后更换胚胎培养液一次，连续培养48小时后，观察热带爪蟾胚胎的生理活性，取出死亡的胚胎，备用。所述的畸形类型是指主要表现为：眼睛畸形、泄殖腔畸形、鳍畸形、尾巴畸形、皮肤色素畸形。所述的畸形类型及表型特征体系是通过实验过程得到不同浓度的化学品污染的胚胎生育的畸形数据，并对畸形类型进行统计，主要表现为：眼睛畸形、泄殖腔畸形、鳍畸形、尾巴畸形、皮肤色素畸形；然后根据畸形表型特征统计建立对应的畸形程度分级，从而根据对应的化学品浓度数据建立毒性分级体系对应不同毒性浓度的畸形系数，确定所测化学品的对热带爪蟾的发育毒性强度。所述的畸形系数是指每个热带爪蟾胚胎的所有畸形部位的畸形程度分级的总和。实施例3：一种利用热带爪蟾胚胎测定化学品发育毒性的方法，主要包括以下步骤：(1)挑选合适的胚胎，然后用胚胎培养液清洗3次去除坏卵和杂质后，置于胚胎培养液中，在25℃，无光照的恒温培养箱中进行静置培养，在显微镜下挑选来自同一亲本、正常发育比率达80％以上且发育时期一致的热带爪蟾胚胎，备用；(2)化学品毒性对比暴露实验：a.将待测的化学品溶于标准稀释水中，分别配制成10mg/l、30mg/l、50mg/l的待测液装入试剂瓶中，每个试剂瓶中装待测液20ml，将试剂瓶用膜封口后置于2℃冰箱避光保存，备用；b.将挑选的热带爪蟾活体胚胎分为四组，每组20只，分别标记为试验组1、试验组2、试验组3、对照组，每组的热带爪蟾活体胚胎生理情况无明显差异，具有可比性；c.将试验组的胚胎进行活体培养，然后给三组试验组中分别加入10mg/l、30mg/l、50mg/l的待测液，对照组继续使用胚胎培养液培养，然后将所述的胚胎置于多功能培养箱中进行暴露实验，光照12h，黑暗12h，24h后观察每组是否有胚胎死亡，记录死亡数据，将未死亡的胚胎取出后使用100mg/lms-222麻醉处理后，然后固定在6％的甲醛溶液中，备用；(3)使用解剖镜观察不同化学品浓度下胚胎的发育情况，通过显微镜照相系统获取每只胚胎的特征图像，并将试验组于对照组进行比较，从而根据每组胚胎的畸形类型及表型特征体系对应的畸形系数来判断化学品的毒性程度。其中，所述的挑选合适的胚胎是指挑选实验室养殖的性成熟的热带爪蟾多对，热带爪蟾的各项生命体征正常，采用人工注射hcg(人绒毛膜促性腺激素)的方法诱导产卵，每只爪蟾都进行两次注射，初次注射20iu，36小时后，再次注射给雌性爪蟾注射150iu单位，雄性爪蟾注射120iu，从热带爪蟾的背部注射，注射完成后将雌雄个体进行配对，待蛙抱对产卵结束后收集胚胎即可。所述的胚胎培养液的制备方法为：给300ml的ph为8的弱碱性的人工合成输卵管液中加入100iu/ml的青霉素5ml、100μg/ml的链霉素3ml及15mg/ml的血清白蛋白30mg，震荡摇匀充分溶解后加入人工合成输卵管液定容至500ml，再给定容后的溶液中加入10mmnacl60ml、15mmkcl50ml、10μg/ml的植物多糖10ml，搅拌均匀，经0.22μm过滤器过滤除菌，5℃温度条件下储存，即得到所述的胚胎培养液。所述的胚胎活体培养是指将每组的五只热带爪蟾活体胚胎和50ml的胚胎培养液置于玻璃培养皿中，放入恒温培养箱中，温度控制在25℃，24小时后更换胚胎培养液一次，连续培养48小时后，观察热带爪蟾胚胎的生理活性，取出死亡的胚胎，备用。所述的畸形类型是指主要表现为：眼睛畸形、泄殖腔畸形、鳍畸形、尾巴畸形、皮肤色素畸形。所述的畸形类型及表型特征体系是通过实验过程得到不同浓度的化学品污染的胚胎生育的畸形数据，并对畸形类型进行统计，主要表现为：眼睛畸形、泄殖腔畸形、鳍畸形、尾巴畸形、皮肤色素畸形；然后根据畸形表型特征统计建立对应的畸形程度分级，从而根据对应的化学品浓度数据建立毒性分级体系对应不同毒性浓度的畸形系数，确定所测化学品的对热带爪蟾的发育毒性强度。所述的畸形系数是指每个热带爪蟾胚胎的所有畸形部位的畸形程度分级的总和。现根据以上三种实施例对含有不同毒性化学物质的水溶液进行检测，并测试其相同浓度下的毒性程度。1.水样制备：首先人工制备重金属汞、铅、镉、铜污染水样。在人工配制汞污染水样时，于双蒸水中分别加入氯化汞标准液，使水样中的汞含量分别为0.15mg/l。按上述方法分别利用硝酸铅、氯化镉、硫酸铜配制重金属铅、镉、铜的人工污染水样。单独或混合重金属污染水样的配制如下：①浓度0.03mg/l的汞污染水样；②浓度为0.05mg/l的铅污染水样；③浓度为0.05mg/l的镉污染水样；④浓度为0.05mg/l的铜污染水样；⑤自来水样。2.热带爪蟾发育毒性试验：将制备的水样分别使用实施例1、实施例2、实施例3进行本发明的发育毒性试验，将不同化学品的水溶液毒性进行试验并得出，得到的数据如下表：从上表可以得出，在热带爪蟾对化学品生育毒性检测中，汞的属于重度毒性，铅、镉属于中度毒性且铅的毒性要强于镉，铜属于轻度毒性。最后说明：采用上述技术方案是为了便于理解本发明的实施例，本发明还可以有其他实施例，本发明的保护范围并不限于此。在不背离本发明精神和实质的情况下，所属
技术领域：
的技术人员当可根据本发明做出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都属于本发明的权利要求的保护范围。当前第1页12