本发明涉及高通量测序领域，具体涉及一种外周血游离DNA深度测序结果的生物信息学分析方法。
背景技术：
ctDNA含量非常少，以10ml外周血为例，从中可以提取到cfDNA含量约30ng，占总DNA的1％，ctDNA在所有cfDNA中的比例非常少，按1％计算,只有约300pg，也就是大约45个细胞裂解的DNA量，实际情况下，如果是做早期筛查，ctDNA的含量可能更低到10ml外周血中只有1～2个细胞的，所以对检测方法的敏感性要求非常高。
目前用于液体活检中目标基因检测的方法主要分为四类：一代测序(Sanger)，二代高通量测序(NGS)，数字液滴PCR(ddPCR)，和ARMS(又称等位基因特异性PCR)。对于肿瘤基因的筛查来说，NGS检测在同类中的性价比远高过其他几种方法。
NGS方法会涉及到PCR扩增和测序，这两个过程都会出现一些系统错误，如illumina Hiseq平台的测序错误率在0.05％，在普通大量样本模板检测中问题并不大，但是，在肿瘤早期筛查中，由于本身模板类就是在万分之一到千分之一的范围之内，这些测序错误跟我们的检测下线在一个数量级，就会对结果造成非常严重的干扰，其次，由于PCR引入的错误也无法进行有效识别。
中国专利申请(申请号CN201510225771.5)公开了一种孕妇外周血中胎儿游离DNA比例的定量方法，该方法利用设计的引物将血浆中包含设计SNP的DNA提取出来，经过一系列处理后上机，将测序产物比对到人类基因组序列后确定每个SNP位点的碱基。通过分析SNP中各碱基的比例来定量胎儿游离DNA浓度。本发明还可通过多个SNP来校正引入的误差，用统计学的方法对多个SNP同时计算，提高计算出的胎儿游离DNA浓度准确性。
然而，纯粹通过改进单一的生物信息分析方法来提高测序准确度，只涉及检测数据后期处理，并不能在源头消除或有效降低PCR扩增和测序时引入的系统误差。
所以目前急需要开发一种新的方法，用于鉴别真正的基因突变和这些系统错误。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供了一种外周血游离DNA深度测序结果的生物信息学分析方法。
第一方面，本发明提供了一种外周血游离DNA深度测序结果的生物信息学分析方法，包括如下步骤：
1)设计引物标签；
2)给每个DNA分子接上引物标签；
3)进行PCR扩增、高通量测序；
4)通过生物信息学分析获得外周血游离DNA深度测序结果。
本发明所述的深度测序法，可做本领域技术人员常规理解，比如与高通量测序技术、NGS等概念在多数情况下可互换。
本发明所述的深度测序法采用的测序设备包括但不限于Roche/454、Illumina测序仪(NextSeq系列，Hiseq系列，MiSeq系列，XTen，以及后续测序仪系列)、BGI(华大公司，BGI500系列以及后续测序仪)的测序仪、LifeTech测序仪器(Ion，Proton以及后续测序仪器系列)、PacBio测序仪器(RSII，Sequel以及后续测序仪器)或基于Nanopore的测序仪器(Genia，Nanopore以及类似的第三代测序仪)。
第二方面，本发明提供了一种引物标签结合深度测序法从外周血游离DNA扩增癌症基因的标签设计方法，包括如下步骤：
1)设计引物标签；
2)给模板中的每个DNA分子都接上引物标签；
3)针对目标癌症基因设计PCR引物或PCR引物组；
4)进行PCR扩增和测序，筛选出合格的引物标签。
本发明提供的从外周血游离DNA中扩增癌症基因的分子标签设计的基本原则：通过给每个起始样品模板两边加标签的方式，给模板中的每个DNA分子都贴上分子标签，在经过PCR和测序以后，可以通过分子标签将样本中原始的DNA分子都鉴别分类。由于经过PCR扩增以后的分子都跟原始模板携带同样的分子标签，所以理论上来说，来源于同一个分子标签的某类DNA分子应该携带相同的序列，如果后期中间的产物在PCR过程中发生的突变，就可以通过标签去除这些突变序列，避免他们干扰最后的测序结果。同样的，测序错误也可以通过这个方法进行鉴别。
第三方面，本发明提供了一种用于深度测序法从外周血游离DNA扩增癌症基因的引物标签。
第四方面，本发明提供了一种如第一方面提供的引物组、如第二方面提供的引物标签设计方法、或如第三方面提供了的引物标签在从外周血游离DNA扩增癌症基因中的应用、或在高通量测序中的应用。
附图说明
图1是本发明实施例提供的一种外周血游离DNA深度测序结果的生物信息学分析方法流程示意图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。
本发明实施例中若特别说明，测序文库构建参照罗氏、illumina或ABI的高通量测序文库构建说明书。
在本发明第一实施例中，结合图1，本发明提供了一种外周血游离DNA深度测序结果的生物信息学分析方法，包括如下步骤：
1)设计引物标签；
2)给模板中的每个DNA分子都接上引物标签；
3)针对目标癌症基因设计PCR引物或PCR引物组；
4)进行PCR扩增、高通量测序；
5)通过生物信息学分析获得外周血游离DNA深度测序结果。
本发明所述的深度测序法采用的测序设备包括但不限于Roche/454、Illumina测序仪(NextSeq系列，Hiseq系列，MiSeq系列，XTen，以及后续测序仪系列)、BGI(华大公司，BGI500系列以及后续测序仪)的测序仪、LifeTech测序仪器(Ion，Proton以及后续测序仪器系列)、PacBio测序仪器(RSII，Sequel以及后续测序仪器)或基于Nanopore的测序仪器(Genia，Nanopore以及类似的第三代测序仪)。
在本发明第二实施例中，本发明提供了一种引物标签结合深度测序法从外周血游离DNA扩增癌症基因的标签设计方法，包括如下步骤：
1)设计引物标签；
2)给模板中的每个DNA分子都接上引物标签；
3)针对目标癌症基因设计PCR引物或PCR引物组；
4)进行PCR扩增和测序，筛选出合格的引物标签。
本发明提供的从外周血游离DNA中扩增癌症基因的分子标签设计的基本原则：通过给每个起始样品模板两边加标签的方式，给模板中的每个DNA分子都贴上分子标签，在经过PCR和测序以后，可以通过分子标签将样本中原始的DNA分子都鉴别分类。由于经过PCR扩增以后的分子都跟原始模板携带同样的分子标签，所以理论上来说，来源于同一个分子标签的某类DNA分子应该携带相同的序列，如果后期中间的产物在PCR过程中发生的突变，就可以通过标签去除这些突变序列，避免他们干扰最后的测序结果。同样的，测序错误也可以通过这个方法进行鉴别。
在本发明第三实施例中，本发明提供了一种用于深度测序法从外周血游离DNA扩增癌症基因的引物标签。
在本发明第四实施例中，本发明提供了一种如第一方面提供的引物组、如第二方面提供的引物标签设计方法、或如第三方面提供了的引物标签在从外周血游离DNA扩增癌症基因中的应用、或在高通量测序中的应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。