本发明涉及一种纯化富集dha油脂的方法，主要涉及一种使用三次发酵法由藻发酵液中纯化富集dha油脂的方法。
背景技术：
dha，二十二碳六烯酸，俗称脑黄金，是一种对人体非常重要的多不饱和脂肪酸，属于omega-3不饱和脂肪酸家族中的重要成员。dha是神经系统细胞生长及维持的一种主要元素，是大脑和视网膜的重要构成成分，在人体大脑皮层中含量高达20%，在眼睛视网膜中所占比例最大，约占50%，因此对胎婴儿智力和视力发育至关重要。dha的主要作用包括：
1、影响胎儿大脑发育。孕期dha能优化胎儿大脑锥体细胞的磷脂的构成成分，尤其是胎儿满5个月后，如人为地对胎儿的听觉、视觉、触觉进行刺激，会引起胎儿大脑皮层感觉中枢的神经元增长更多的树突，这就需要母体同时供给胎儿更多的dha。
2、促进视网膜光感细胞的成熟。dha对视网膜光感细胞的成熟有重要作用，孕妇在孕期可通过摄入富含α-亚麻酸的食物来提高α-亚麻酸的含量，利用母血中的α-亚麻酸合成dha，然后输送到胎儿大脑和视网膜，使那里的神经细胞成熟度提高。而大部分的dha可不被胃液所消化，直接进入血液，经由血脑屏障进入脑细胞，被肝或脑等器官吸收。相比之下，同属不饱和脂肪酸的epa及次亚麻油酸却无法通过血脑屏障被脑吸收。
3、抑制发炎。dha会抑制发炎前驱物质的形成，所以具有消炎作用。
4、降低血脂、预防心脏血管疾病。dha可降低血液中甘油三脂、胆固醇及预防血栓的形成。
5、改善老人痴呆症状。由于随着年龄的增长，脑中的dha就会逐渐减少，也就是说容易引起脑部功能的退化。事实上，脑细胞在二至三岁前会不断的成长，长大成人后，则会逐渐减少，根据调查，在二十至三十岁时，脑细胞会以十万个的比率逐渐减少，虽然如此，dha仍具有使剩下的脑细胞活性化的力量，充分地提高记忆及学习能力。
目前市售dha制品有两种主要来源：一种是从深海鱼中提取的油脂制品，另一种是从藻类中提取的油脂制品。
从深海鱼中提取的鱼类脂肪，经现代工艺加工，产品品质得到了极大提升，比如加工成乙酯型的鱼油，其中epa/dha总含量可达到50%～75%，甚至80%以上。但该产品依然有缺陷：（1）鱼油中epa(二十碳五烯酸)的含量高，致使dha所占的比例相对较低，与母乳相差较大，不符合婴幼儿的生理需求；（2）鱼油由于其典型的鱼腥味及氧化稳定性较差的问题限制了鱼油dha的市场发展；（3）通过再加工得到的epa和dha甲乙酯型产品吸收效率低，而且可能存在安全隐患。
相比之下，藻类在食物链低端较为纯净，从藻类中提取dha，几乎不含epa。dha:epa的比例＞20:1，且均以甘油酯型和游离脂肪酸型存在，易被人体吸收，特别适合孕妇、产妇、婴幼儿。
现查询到国内涉及藻类发酵生产dha油脂的专利文献有数十篇，主要可以分为三方面内容：（1）菌种的选育；（2）培养基优化；（3）发酵过程补料及控制策略优化。这三方面文献的主要目的都是为了提高发酵效率，降低发酵成本。比如，申请号为200910061419.7、201210251850.x、201210380900.4、201210338013.0、200910130628.2等专利文献公开了利用裂殖壶菌发酵生产dha的工艺，培养基均使用葡萄糖、蛋白胨和酵母粉等传统碳氮源。为了降低生产成本，申请号为201010104774.0的专利文献公开了裂殖壶菌利用廉价的豆粕水解液作为氮源发酵生产dha的工艺。而申请号为201310571413.0的专利文献则介绍了通过处理废弃秸秆生成水解液，并以此作为碳源生产dha，有效降低了dha的生产成本，而裂殖壶菌利用廉价的菊芋水解液或果葡糖浆等。相比之下，涉及到藻类dha油脂纯化和富集方面的专利文献则较少。
目前，藻类dha油脂的提取纯化多采用如下工艺：
1、离心：利用离心机提供的离心力将湿藻丝从藻发酵液中分离出来，发酵液直接排放；
2、酶解：利用蛋白酶和纤维素酶处理湿藻丝，实现细胞的破碎和分解，释放细胞中含有的细胞质和富含dha的油脂；
3、破乳：酶解所得含有油脂的液体处于稳定的乳化状态，为释放其中的脂类物质，使用乙醇进行破乳，破乳需进行4～5次，乙醇用量可达到酶解液的45～50倍；
4、萃取：破乳得到的醇-酯相液中加入石油醚进行油脂萃取，萃取需进行6~7次，石油醚用量可达到醇-酯相液的160～190倍；
5、回收溶剂：回收石油醚萃取液中的溶剂，得到dha毛油；
6、精炼：毛油经碱炼、脱色和脱臭得到精炼dha油脂。
上述工艺存在的问题和缺陷包括：
1、破乳困难。由于湿藻丝含水90%，加上酶解破碎藻后释放的油脂，体系形成了复杂的乳化状态，为保障后续萃取的效果，必须破坏该乳化系统的稳定性。
2、溶剂消耗量大。破乳需消耗大量的乙醇，萃取需消耗大量的石油醚，目前的技术水平，生产1tdha油约需50t乙醇，180t石油醚。
3、毛油成分复杂。细胞膜结构中的磷脂70%转入了毛油，酸价≥16mg/g(以koh计)，过氧化值≥23meq/kg，此外还含有藻红素等杂质。
4、dha浓度不足。由于没有使用任何dha富集工艺，产品中的dha依然为甘油三酯型，总脂肪酸中dha只能占到40～45%。
技术实现要素：
为了克服上述工艺存在的问题和缺陷，本发明提供一种使用三次发酵法由藻发酵液中纯化富集dha油脂的方法。
本发明所使用的技术方案通过如下步骤实现：
a、胶体磨破碎：使用胶体磨处理dha发酵完成后的隐甲藻或裂殖壶藻发酵液，实现对藻体细胞的破碎及胞内油脂的释放；
b、第一次采用酵母菌发酵：在胶体磨处理过的液体中加入糖蜜，使液体中的糖度值达到18～22°bx，添加占发酵液质量0.05～0.2‰的活性干酵母，开动搅拌器，通入无菌空气进行培养，控制温度在28～30℃培养18～20h，至糖度降低到8～12°bx以下，酒精度达到8°以上为准；
c、第二次采用醋酸菌发酵：酵母菌发酵完成后在发酵液中补加占发酵液质量0.01%的复合b族维生素，添加占发酵液质量0.1～0.4‰的醋酸菌，开动搅拌器，通入无菌空气进行培养，控制温度在30~32℃培养22～24h，至ph降低到4.5～5.5为止；
d、卧螺离心：醋酸菌发酵完成后，利用卧螺离心去除菌丝体，得到菌液；
e、第三次采用保加利亚杆菌发酵：在离心得到的菌液中，使用碳酸钙调节ph值至5.5～6.5，添加占菌液质量0.2～0.8‰的保加利亚杆菌，开动搅拌器进行培养，控制温度在48～50℃培养3～6天，利用其中的酯解酶和发酵液中存留的乙醇完成对dha甘油三酯sn-1位上非dha脂肪酸的酯解，其中在第1～2天的时候补加一定量的糖蜜，使液体中的糖度控制在3～6°bx；
f、碟片离心：保加利亚杆菌发酵完成后，利用碟片式离心机离心，分离得到毛油和浑浊液；
g、分子蒸馏：毛油经过脱气和脱除乙醇后，再经150℃、真空度1.0pa的条件下进行醇解产物的短程蒸馏分离，收集剩下的毛油；
h、纯化：将剩下的毛油碱炼、脱色和脱臭后即为精炼dha油，其中dha的比例可达到50～60%。
本发明提供的技术方案，使用三次发酵法对藻发酵液进行处理，极大减少了破乳难度，同时利用天然dha相对富集于甘油酯sn-2位的特点，通过生物酯解反应去除甘油三酯中sn-1位上的非dha脂肪酸，实现对dha的富集，无需添加有机溶剂进行破乳和纯化，并可得到dha含量达到50~60%的产品，能够明显降低生产成本，提高产品中dha的含量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明：
实施案例1：
使用胶体磨处理dha发酵完成后的隐甲藻发酵液，实现对藻体细胞的破碎及胞内油脂的释放；在胶体磨处理过的液体中加入糖蜜，使液体中的糖度值达到18°bx；添加占发酵液质量0.2‰的活性干酵母，开动搅拌器，通入无菌空气进行培养；控制温度在28～30℃培养20h，至糖度降低到10°bx以下，酒精度达到8°以上为准；酵母菌发酵完成后在发酵液中补加占发酵液质量0.01%的复合b族维生素，添加占发酵液质量0.2‰的醋酸菌，开动搅拌器，通入无菌空气进行培养，控制温度在30～32℃培养22h，至ph降低至5.5为止；醋酸菌发酵完成后，利用卧螺离心去除菌丝体，得到菌液；在离心得到的菌液中，使用碳酸钙调节ph值至5.5，添加占菌液质量0.4‰的保加利亚杆菌，开动搅拌器进行培养，控制温度在48～50℃培养6天，利用其中的酯解酶和发酵液中存留的乙醇完成对dha甘油三酯sn-1位上非dha脂肪酸的酯解，其中在第2天的时候补加一定量的糖蜜，使液体中的糖度控制在4°bx；保加利亚杆菌发酵完成后，利用碟片式离心机离心，分离得到毛油和浑浊液；毛油经过脱气和脱除乙醇后，再经150℃、真空度1.0pa的条件下进行醇解产物的短程蒸馏分离，收集剩下的毛油，进行碱炼、脱色和脱臭后即为精炼dha油，其中dha的比例可达到58.3%。
实施案例2：
使用胶体磨处理dha发酵完成后的裂殖壶藻发酵液，实现对藻体细胞的破碎及胞内油脂的释放；在胶体磨处理过的液体中加入糖蜜，使液体中的糖度值达到22°bx；添加占发酵液质量0.1‰的活性干酵母，开动搅拌器，通入无菌空气进行培养；控制温度在28～30℃培养18h，至糖度降低到12°bx以下，酒精度达到8°以上为准；酵母菌发酵完成后在发酵液中补加占发酵液质量0.01%的复合b族维生素，添加占发酵液质量0.3‰的醋酸菌，开动搅拌器，通入无菌空气进行培养，控制温度在30～32℃培养22h，至ph降低至5.0为止；醋酸菌发酵完成后，利用卧螺离心去除菌丝体，得到菌液；在离心得到的菌液中，使用碳酸钙调节ph值至6.0，添加菌液质量0.8‰的保加利亚杆菌，开动搅拌器进行培养，控制温度在48～50℃培养3天，利用其中的酯解酶和发酵液中存留的乙醇完成对dha甘油三酯sn-1位上非dha脂肪酸的酯解，其中在第1天的时候补加一定量的糖蜜，使液体中的糖度控制在5°bx；保加利亚杆菌发酵完成后，利用碟片式离心机离心，分离得到毛油和浑浊液；毛油经过脱气和脱除乙醇后，再经150℃、真空度1.0pa的条件下进行醇解产物的短程蒸馏分离，收集剩下的毛油，进行碱炼、脱色和脱臭后即为精炼dha油，其中dha的比例可达到51.6%。