本领域涉及天然产物深加工技术领域，尤其是涉及一种羟丙基葡聚糖和甲酸钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法。
背景技术：
螺旋藻是一种丝状多细胞藻类生物，无细胞核，由于富含藻蓝素而呈现蓝绿色。现已发现的螺旋藻共有36种，而能用于工业生产的仅有2种，即钝顶螺旋藻与极大螺旋藻。螺旋藻是一种富含蛋白质、维生素、必需氨基酸、矿物质和必需脂肪酸的丝状微藻，细胞壁有多糖类物质构成，易于消化吸收，研究表明螺旋藻在生物体内利用率达到68％。
藻蓝蛋白(又称藻蓝素，简称pc)是从螺旋藻中分离出来的一种深蓝色粉末，色泽美观。它是一类稀有的光合作用色素蛋白，氨基酸组成齐全，是藻类中特有的捕光色素蛋白。pc具有抗辐射、抗氧化、抗肿瘤以及无毒副作用等优势，在食品保健、药物治疗、化妆品以及荧光探针方面具有广泛的应用。
当两种亲水性聚合物在水中以适当的浓度混合时，由于聚合物憎水程度有所差异，分子之间存在斥力或空间阻碍，使两者不能相互渗透，进而发生分相，形成聚合物/聚合物双相体系。当聚合物和某些盐以一定浓度在水中混合时，由于盐的盐析作用，形成聚合物/盐双水相体系。
目前，缺乏一种回收率高的羟丙基葡聚糖和甲酸钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种回收率高的羟丙基葡聚糖和甲酸钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：本发明的一种羟丙基葡聚糖和甲酸钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)制备藻蓝蛋白粗提取液：用去离子水清洗新鲜的螺旋藻2-4次，洗涤干净的螺旋藻，经压力为150-350kg/cm2的高压细胞匀浆机，破碎时间为5-6min，超声波处理时间为12-14min，将破碎的螺旋藻悬浊液于离心机中，离心时间为10-15min，离心收集上清液，制得含藻蓝蛋白的粗提液于4-5℃下储存；
(2)双水相萃取：向步骤(1)所得螺旋藻破壁的粗提液中加入羟丙基葡聚糖和甲酸钠，震荡混合时间为1-2h，静置分相，藻蓝蛋白富集于上相；
(3)采用膜孔径为3-5um的滤膜对藻蓝蛋白粗提液进行粗过滤，处理时间为20-25小时，再于-10--12℃冷冻干燥10-12小时，制得双水相萃取藻蓝蛋白。
进一步地，在步骤(1)中，所述的压力为150-350kg/cm2。
进一步地，在步骤(1)中，所述离心速率为800-1000r/min。
更进一步地，在步骤(2)中，所述羟丙基葡聚糖:甲酸钠:破壁的粗提液的重量比为0.25-0.6:0.35-0.5:1。
进一步地，在步骤(3)中，所述滤膜的流速为150ml/min，渗透通量为55-65l/(h·m2)。
有益效果：本发明分离效果好，过滤分离回收率高，产品质量高，体系粘度较低，运行成本低，分相所需时间短，节约了时间又减小了能耗，无污染。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明的双水相体系用于萃取螺旋藻细胞破碎液中藻蓝蛋白,经一次萃取藻蓝蛋白收率可达92.6％，分配系数达到8.03，分离因数达到6.5。结果证实螺旋藻藻蓝蛋白在该体系中的分配系数和分离因数均较高。
(2)多次双水相萃取有利于c-pc纯度提高，三次双水萃取后，c-pc纯度为3.82，回收率为91％。继续增加萃取的次数，纯度不断增加。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，这些实施例是本发明的阐释和举例，并不以任何形式限制本发明的范围。
实施例1
本发明的一种羟丙基葡聚糖和甲酸钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)制备藻蓝蛋白粗提取液：用去离子水清洗新鲜的螺旋藻2次，洗涤干净的螺旋藻，经压力为350kg/cm2的高压细胞匀浆机，破碎时间为6min，超声波处理时间为12min，将破碎的螺旋藻悬浊液于离心机中，离心时间为15min，离心收集上清液，制得含藻蓝蛋白的粗提液于4℃下储存；所述离心速率为1000r/min。
(2)双水相萃取：向步骤(1)所得螺旋藻破壁的粗提液中加入羟丙基葡聚糖和甲酸钠，震荡混合时间为2h，静置分相，藻蓝蛋白富集于上相；所述羟丙基葡聚糖:甲酸钠:破壁的粗提液的重量比为0.25:0.5:1。
(3)采用膜孔径为5um的滤膜对藻蓝蛋白粗提液进行粗过滤，处理时间为25小时，再于-12℃冷冻干燥10小时，制得双水相萃取藻蓝蛋白。所述滤膜的流速为150ml/min，渗透通量为55l/(h·m2)。产品中藻蓝蛋白纯度a620/a280为3.82，蛋白回收率91％。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于：本发明的一种羟丙基葡聚糖和甲酸钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)制备藻蓝蛋白粗提取液：用去离子水清洗新鲜的螺旋藻2-4次，洗涤干净的螺旋藻，经压力为150kg/cm2的高压细胞匀浆机，破碎时间为5min，超声波处理时间为13min，将破碎的螺旋藻悬浊液于离心机中，离心时间为10min，离心收集上清液，制得含藻蓝蛋白的粗提液于4.5℃下储存；所述离心速率为800r/min。
(2)双水相萃取：向步骤(1)所得螺旋藻破壁的粗提液中加入羟丙基葡聚糖和甲酸钠，震荡混合时间为1h，静置分相，藻蓝蛋白富集于上相；所述羟丙基葡聚糖:甲酸钠:破壁的粗提液的重量比为0.5:0.35-0.5:1。
(3)采用膜孔径为3um的滤膜对藻蓝蛋白粗提液进行粗过滤，处理时间为20小时，再于-10℃冷冻干燥11小时，制得双水相萃取藻蓝蛋白。所述滤膜的流速为150ml/min，渗透通量为65l/(h·m2)。产品中藻蓝蛋白纯度a620/a280为3.7，蛋白回收率89％。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于：本发明的一种羟丙基葡聚糖和甲酸钠双水相萃取分离藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)制备藻蓝蛋白粗提取液：用去离子水清洗新鲜的螺旋藻2-4次，洗涤干净的螺旋藻，经压力为265kg/cm2的高压细胞匀浆机，破碎时间为5.6min，超声波处理时间为14min，将破碎的螺旋藻悬浊液于离心机中，离心时间为14min，离心收集上清液，制得含藻蓝蛋白的粗提液于5℃下储存；所述离心速率为900r/min。
(2)双水相萃取：向步骤(1)所得螺旋藻破壁的粗提液中加入羟丙基葡聚糖和甲酸钠，震荡混合时间为1.5h，静置分相，藻蓝蛋白富集于上相；所述羟丙基葡聚糖:甲酸钠:破壁的粗提液的重量比为0.6:0.45:1。
(3)采用膜孔径为4um的滤膜对藻蓝蛋白粗提液进行粗过滤，处理时间为21小时，再于-11℃冷冻干燥12小时，制得双水相萃取藻蓝蛋白。所述滤膜的流速为150ml/min，渗透通量为60l/(h·m2)。产品中藻蓝蛋白纯度a620/a280为3.5，蛋白回收率88％。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。