牛呼吸道合胞体病毒nano‑PCR检测试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及牛呼吸道合胞体病毒检测技术领域，具体涉及一种牛呼吸道合胞体病毒nano-pcr检测试剂盒及其制备方法。

背景技术：

牛呼吸道合胞体病毒(bovineerspiartorysyneytialviurs，brsv)是能够引起牛急性呼吸道疾病综合征(bovinerespiratorydiseasecomplex，brdc)的重要病原体之一，给养牛业带来巨大的经济损失。在规模化养殖厂2-6月龄犊牛感染发病率很高、死亡率低、易继发细菌感染，死亡率可达到20％以上，犊牛感染愈后再次感染症状不明显，在无临床症状的牛上也可分离到此病毒。本病在牛群中较长期存在，气温骤降或长途运输等应激条件下可引起疫情暴发，通常brsv在某一牛群中能够较长的时间存在，但具体机制尚不清楚，有待系统研究。

目前，针对牛呼吸道合胞体病毒的实验室诊断方法主要有elisa和rt-pcr方法，由于病毒的滴度很低并且不稳定，导致上述方法灵敏度非常低，常呈假阴性结果，对疫病的诊断及治疗造成误判。在临床应用中，普通pcr较为常用，但其敏感性不显著，且目前pcr反应中普遍存在的非特异性扩增、复杂背景干扰使反应特异性降低及部分病原体扩增率低的共性问题。荧光定量pcr较为精准，但需要精密的仪器并且操作程序复杂，elisa检测方法存在假阳性率高，免疫荧光抗体试验耗时长，操作繁琐。

随着我国养牛业的迅速发展，国内仍缺乏对brsv系统的研究，仍无检测牛呼吸道合胞体病毒病原的pcr检测试剂盒。鉴于brsv对养牛业造成的危害，目前亟需建立一种能够高效、快速、特异、可重复性好的brsv分子检测方法是疫病诊断技术的研究方向。

技术实现要素：

为了解决现有牛呼吸道合胞体病毒检测方法存在的灵敏性低、血清学检测假阳性高、国外进口试剂昂贵的问题，本发明提供一种牛呼吸道合胞体病毒nano-pcr检测试剂盒及其制备方法。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的牛呼吸道合胞体病毒nano-pcr检测试剂盒，该试剂盒包括：mightyamp酶、2xbuffermix缓冲液、金纳米颗粒溶胶、无菌双蒸水、一对特异性引物和一个牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒；

所述一对特异性引物分别为：鉴定牛呼吸道合胞体病毒的引物p1和p2：

p1：5'-tatgctatgtcccgattgg-3'，

p2：5'-actgatttggctagtacaccc-3'；

所述牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒为含有596个碱基的核苷酸片段构成的pmd18-t重组质粒，其序列如序列表中的seqidno:2所示。

所述含有596个碱基的核苷酸片段构成的pmd18-t重组质粒能够在大肠杆菌dh5α感受态细胞中增殖。

作为优选的实施方式，所述含有596个碱基的核苷酸片段的序列如序列表中的seqidno:1所示。

作为优选的实施方式，该试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为蒸馏水。

本发明还提供了上述牛呼吸道合胞体病毒nano-pcr检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)配制nano-pcr反应液

所述反应液包括：mightyamp酶、2xbuffermix缓冲液、金纳米颗粒溶胶、无菌双蒸水和一对特异性引物；

所述一对特异性引物分别为：鉴定牛呼吸道合胞体病毒的引物p1和p2：

p1：5'-tatgctatgtcccgattgg-3'，

p2：5'-actgatttggctagtacaccc-3'；

(2)建立牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒

所述牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒为含有596个碱基的核苷酸片段构成的pmd18-t重组质粒，其序列如序列表中的seqidno:2所示；

所述含有596个碱基的核苷酸片段构成的pmd18-t重组质粒能够在大肠杆菌dh5α感受态细胞中增殖；

(3)阴性对照：所述阴性对照为蒸馏水。

作为优选的实施方式，所述牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒通过以下方法制备：以牛呼吸道合胞体病毒的np基因为模板，以p1和p2为引物进行pcr扩增，得到长度为596bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至pmd18-t载体，得到牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒，其序列如序列表中的seqidno:2所示。

作为优选的实施方式，以p1和p2为引物进行pcr扩增的反应条件为：98℃2min；98℃10s，60℃2s，68℃1min，35个循环；68℃总延伸10min。

作为优选的实施方式，所述金纳米颗粒溶胶的直径为20nm，浓度为0.5μg/μl。

本发明的有益效果是：

1、根据牛呼吸道合胞体病毒基因组的保守基因np序列设计一对特异性引物，通过组装得到检测牛呼吸道合胞体病毒nano-pcr检测试剂盒，与现有技术相比，本发明的nano-pcr检测试剂盒可以在低核酸含量、退火温度温差范围12℃内，退火时间5秒以内检测被检测样品中是否含有牛呼吸道合胞体病毒(brsv)核酸，具有较高的特异性和敏感性，比常规pcr技术高效，灵敏特异的特点，敏感性是普通pcr的10倍，临床样品阳性符合率与常规rt-pcr为100％，阳性检出率高于普通rt-pcr46％，具可以对牛群中感染和发病动物进行准确检测。

2、本发明的nano-pcr检测试剂盒可以对细胞培养物、血液、组织培养物、鼻拭子及粪拭子等多种样品的牛呼吸道合胞体病毒(brsv)进行快速检测，样品适用范围广，试剂盒提供的试剂无感染性、无生物安全隐患成分，使用安全性高。

3、本发明的nano-pcr检测试剂盒可在收到样品7小时内给出进行定性检测结果，是一种检测牛呼吸道合胞体病毒早期发病和预后筛查的有效工具。

4、相比采用国外进口试剂，本发明采用的试剂均为实验室自行保存的，试剂成本大大降低，从而降低整个检测的成本。

5、本发明利用金纳米颗粒与pcr分子检测技术，建立brsv高灵敏度、简便、快速高效的纳米pcr检测试剂盒，实现对brsv的快速诊断，对疫病控制具有重要意义。我国目前仍无检测牛呼吸道合胞体病毒病原的试剂盒，因此，本发明的试剂盒可以提供临床诊断的高效检测试剂。

附图说明

图1为本发明的牛呼吸道合胞体病毒nano-pcr检测试剂盒的特异性检测电泳图。图中：m为dl2000dnamarker，1为阴性对照(蒸馏水)，2～5为分别以brsv、ibrv、bpiv3和bvdv阳性对照重组质粒为模板、加入鉴定牛呼吸道合胞体病毒的引物p1和p2的检测结果。

图2为本发明的牛呼吸道合胞体病毒nano-pcr检测试剂盒的敏感性检测电泳图。图中：brsv阳性对照重组质粒的检测浓度为1.43×10⁸拷贝/μl～1.43×10¹拷贝/μl。

图3为本发明的牛呼吸道合胞体病毒nano-pcr检测试剂盒的敏感性与普通rt-pcr对比检测电泳图。图中：brsv阳性对照重组质粒的检测浓度为1.43×10⁸拷贝/μl～1.43×10¹拷贝/μl。

图4为本发明的牛呼吸道合胞体病毒nano-pcr检测试剂盒的临床brsv病毒样品检测电泳图。图中：m为dl2000dnamarker，brsvnano-pcr临床样品检测结果：4、6、7、11、13、16、20、21、22、23、24、26均为阳性电泳结果。

图5为本发明的牛呼吸道合胞体病毒nano-pcr检测试剂盒的临床brsv病毒样品与普通rt-pcr对比检测电泳图。图中：m为dl2000dnamarker，11、13、20、21、22、23均为阳性电泳结果。

具体实施方式

纳米pcr是一种新型的pcr技术，它比普通pcr更加敏感。纳米材料是一类具有特殊性能的、尺度为纳米级的新型超细材料。有研究发现，金纳米颗粒参与的pcr(nano-particlepcr)能够显著提高产物特异性等pcr的关键指标，利用纳米结构调控pcr反应是一个新的研究方向。金纳米颗粒悬浮在反应液体里，因其具有更强的热导性，在pcr热循环体系中，会更快地达到目标温度，从而增强反应的特异性和提高产物扩增量。纳米pcr检测方法比常规pcr具有突出的优点，可以克服pcr反应中非特异性扩增及最大限度提高扩增效率及产量，较高的灵敏性、特异性及可重复性，可操作性强。pcr是公认的可以大规模应用与临床诊断和使用，并符合判断标准，纳米pcr符克服传统pcr的技术瓶颈，是更优于普通pcr的临床样品快速检测的技术手段。本发明利用纳米材料可以与生物材料发生复杂的相互作用的特点，将金纳米颗粒与传统pcr技术相结合，在传统pcr技术的基础上，建立了高效、快速、特异、可重复性好的brsv病原检测新型分子检测试剂盒。

实验材料：

牛传染性鼻气管炎病毒(ibrv)阳性质粒、牛病毒性腹泻病毒(bvdv)阳性质粒、牛副流感3型病毒(bpi3)阳性质粒、牛呼吸道合胞体病毒(brsv)阳性质粒和大肠杆菌dh5α感受态细胞均由中国农业科学院特产研究所保存；

m-mlv反转录酶、mightyamp酶、rtaqdna聚合酶、dl2000dnamarker和dntp均购自宝生物工程(大连)有限公司；

金纳米颗粒溶胶(20nm)购自sigma公司；

rna提取试剂盒购自invitrogen公司。

实施例1本发明的牛呼吸道合胞体病毒nano-pcr检测试剂盒的组装

(1)配制nano-pcr反应液

①根据brsv病毒np基因组的保守基因序列设计一对特异性引物，为鉴定牛呼吸道合胞体病毒(brsv)的引物p1和p2，引物的序列如下：

p1：5'-tatgctatgtcccgattgg-3'，

p2：5'-actgatttggctagtacaccc-3'。

②nano-pcrp反应液的配制：反应液由mightyamp酶、金纳米颗粒溶胶(20nm，浓度0.5μg/μl)，2xbuffermix缓冲液、无菌双蒸水和上述①中的一对特异性引物组成。

(2)阳性对照重组质粒的构建

①制备牛呼吸道合胞体病毒(brsv)阳性对照质粒：利用mdbk细胞增殖牛呼吸道合胞体病毒，培养40h后参照病毒rna提取试剂提取牛呼吸道合胞体病毒rna后反转录，以反转录产物即牛呼吸道合胞体病毒的np基因为模板，以5'-tatgctatgtcccgattgg-3'(p1)和5'-actgatttggctagtacaccc-3'(p2)为引物进行pcr扩增，得到长度为596bp的扩增产物(brsv596bp目的片段)，其序列如序列表中的seqidno:1所示。pcr反应条件为：98℃2min；98℃10s，60℃2s，68℃1min，35个循环；68℃总延伸10min，将扩增产物回收并纯化后克隆至pmd18-t载体，利用pmd18-t载体构建brsv阳性对照重组质粒，最终得到牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒，送至invitrogen公司进行测序；

②阳性对照重组质粒的建立结果：上述一个阳性对照重组质粒经过测序后，进行核酸比对发现相关基因的核酸同源性达到99％以上，这表明所获得的阳性对照重组质粒均为阳性质粒，牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒的序列如序列表中的seqidno:2所示。

(3)设置阴性对照：阴性对照为蒸馏水。

实施例2本发明的牛呼吸道合胞体病毒nano-pcr检测试剂盒的使用方法

(1)对待检测的样品提取样品dna，待检测的样品包括细胞培养物、血液、组织培养物、鼻拭子及粪拭子等。

(2)nano-pcr反应条件的确定

经过对金纳米颗粒溶胶浓度和反应退火温度的条件的优化，确定在25μl反应体系中，引物p10.5μl，引物p20.5μl，mightyamp酶0.5μl，2×buffer12.5μl，模板1μl，金纳米颗粒溶胶0.7μl，去离子水补齐反应体系至25μl，brsv标准阳性质粒为阳性模板。反应条件设置为：98℃2min；98℃10s，退火温度范围55℃～62℃，退火时间2s～10s，68℃1min，30个循环，68℃总延伸10min，以双蒸水为阴性对照。

(3)以提取的样品反转录cdna为模板，将样品cdna、阳性对照质粒、阴性对照分别加入到含有mightyamp酶、1xbuffermix缓冲液、20nm金纳米颗粒溶胶、无菌双蒸水和一对特异性引物的管中，98℃2min；98℃10s，60℃2s，68℃1min，35个循环；68℃总延伸10min。

(4)取5μlpcr产物，以1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

(5)判定结果：如果从待检测的样品中扩增到了596bp片段，则该待检测的样品中含有牛呼吸道合胞体病毒。

实施例3本发明的牛呼吸道合胞体病毒nano-pcr检测试剂盒的特异性实验

分别以brsv、ibrv、bvdv和bpi3阳性对照重组质粒为模版加入鉴定牛呼吸道合胞体病毒(brsv)的引物p1和p2，进行nano-pcr检测试剂盒的特异性实验；

实验结果：如图1所示，分别以ibrv、brsv、bvdv和bpi3阳性对照重组质粒为模板出现其对应的阴性、596bp、阴性和阴性条带，阴性对照均未扩增出任何条带；

实施例4本发明的牛呼吸道合胞体病毒nano-pcr检测试剂盒的敏感性实验

分别以不同浓度的brsv阳性对照重组质粒为模板，进行nano-pcr检测试剂盒的敏感性实验，brsv阳性对照重组质粒的检测浓度为1.43×10⁸拷贝/μl，并与普通rt-pcr进行平行对比试验。

实验结果：如图2和图3所示，nano-brsv阳性对照重组质粒的最低检测结果为1.43×10²拷贝/μl。

实施例5利用本发明的牛呼吸道合胞体病毒nano-pcr检测试剂盒检测临床采集样品

(1)制备病毒核酸模板(病毒rna的提取)

参照病毒rna提取试剂提取临床样品的总rna，并利用m-mlv反转录酶进行反转录，提取其cdna作为brsv病毒的nano-pcr模板。

(2)nano-pcr反应

以brsv病毒提取的rna反转录产物为模板，加入到包含引物的nano-pcr反应体系中，采用nano-pcr最佳反应条件对病毒模板进行检测，并与普通rt-pcr进行对比试验。

(3)检测结果

如图4和图5所示，brsv病毒阳性样品出现其对应的596bp。其中nano-pcr检出阳性样品11/25份，rt-pcr检出阳性样品6/25份。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定；对于所属技术领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动；这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举；而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。