牛传染性鼻气管炎病毒nano‑PCR检测试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及牛传染性鼻气管炎病毒检测技术领域，具体涉及一种牛传染性鼻气管炎病毒nano-pcr检测试剂盒及其制备方法。

背景技术：

传染性鼻气管炎(infectiousbovinerhinotracheitis，ibr)又名牛疱疹病毒ⅰ型感染症(bovineherpesvirustype1infections，bohv-1)是由牛传染性鼻气管炎病毒引起牛的一种急性接触性传染病，临床表现形式多样，以呼吸道为主，又称红鼻病或牛传染性坏死性鼻炎。自然条件下，仅牛对本病易感。病牛和带毒动物是主要传染源，隐性感染的种公牛精液带毒。病牛愈后可带毒6～12个月，甚至长达19个月。病毒主要存在于鼻、眼、阴道分泌物和排泄物中。急性bohv-1呼吸道感染还可以继发其他细菌性或病毒性感染，造成牛呼吸道疾病综合征(brdc)。

此病目前在世界范围内流行，对乳牛的产奶量、公牛的繁殖力及役用牛的使役力均有较大影响，结合流行病学，可做出初步诊断，但确诊必须依靠实验室诊断，实验室诊断包括病毒分离鉴定和血清学试验。通常检测血清样品中bohv-1抗体的方法有病毒中和试验(vn)和各种酶联免疫吸附试验(elisa)。另外，还有琼脂扩散试验和间接血凝试验。bohv-1为dna病毒，属疱疹病毒科，感染后一般发生病毒潜伏而长期带毒，适当应激条件下重新发病，使疾病在牛群中广泛流行。通常情况下鉴定血清学中阳性动物是检查动物感染状态非常有用而且理想的指标，抗体阳性动物可认为是病毒携带动物和潜在的排毒者，国内目前大型养牛场有使用牛传染性鼻气管炎疫苗，或者幼畜通过吸食初乳获得母源抗体，所以依靠血清抗体对疫病筛查需结合具体情况进行分析，最后的临床诊断仍是病原的检测。bohv-1为双股dna病毒，其病毒基因平均gc含量高于75％而有别与其它病毒，因其基因组特殊性限制了对bohv-1的病原学快速检测方法的建立。鉴于目前临床仍缺乏适于临床现场应用的bohv-1病原快速有效的检测方法，所以建立快速高效的检测方法对疫病得筛查为后期疫病得治疗和养牛业得健康发展尤为重要。

技术实现要素：

为了解决现有检测牛传染性鼻气管炎病毒检测方法灵敏性低、血清学检测假阳性高、国外进口试剂昂贵的问题，本发明提供一种牛传染性鼻气管炎病毒nano-pcr检测试剂盒及其制备方法。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的牛传染性鼻气管炎病毒nano-pcr检测试剂盒，该试剂盒包括：mightyamp酶、2xbuffermix缓冲液、无菌双蒸水、金纳米颗粒溶胶、一对特异性引物和一个牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒；

所述一对特异性引物分别为：鉴定牛传染性鼻气管炎病毒的引物p1和p2：

p1：5'-gctcgccaacttctttcaggg-3'，

p2：5'-gcgtcaaactcctcctcttcctc-3'；

所述牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒为含有306个碱基的核苷酸片段构成的pmd18-t重组质粒，其序列如序列表中的seqidno:2所示；

所述含有306个碱基的核苷酸片段构成的pmd18-t重组质粒能够在大肠杆菌dh5α感受态细胞中增殖。

作为优选的实施方式，所述含有306个碱基的核苷酸片段的序列如序列表中的seqidno:1所示。

作为优选的实施方式，该试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为蒸馏水。

本发明还提供了上述牛传染性鼻气管炎病毒nano-pcr检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)配制pcr反应液

所述pcr反应液包括mightyamp酶、2xbuffermix缓冲液、无菌双蒸水、金纳米颗粒溶胶和一对特异性引物；

所述一对特异性引物分别为：鉴定牛传染性鼻气管炎病毒的引物p1和p2：

p1：5'-gctcgccaacttctttcaggg-3'，

p2：5'-gcgtcaaactcctcctcttcctc-3'；

(2)建立牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒

所述牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒为含有306个碱基的核苷酸片段构成的pmd18-t重组质粒；

所述含有306个碱基的核苷酸片段构成的pmd18-t重组质粒能够在大肠杆菌dh5α感受态细胞中增殖；

(3)阴性对照：所述阴性对照为蒸馏水。

作为优选的实施方式，所述牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒通过以下方法制备：以牛传染性鼻气管炎病毒的ge基因为模板，以p1和p2为引物进行pcr扩增，得到长度为306bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至pmd18-t载体，得到牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒，其序列如序列表中的seqidno:2所示。

作为优选的实施方式，以p1和p2为引物进行pcr扩增的反应条件：98℃2min；98℃10s，57℃5s，68℃1min，35个循环；68℃总延伸10min。

作为优选的实施方式，所述金纳米颗粒溶胶的直径为20nm，浓度为0.5μg/μl。

本发明的有益效果是：

1、根据牛传染性鼻气管炎病毒基因组的保守基因ge序列设计一对特异性引物，通过组装得到检测牛传染性鼻气管炎病毒nano-pcr检测试剂盒，与现有技术相比，本发明的nano-pcr检测试剂盒可以在模板高gc含量、退火温度温差范围5℃内，退火时间3秒以内检测被检测样品中是否含有牛传染性鼻气管炎病毒(ibrv)核酸，具有较高的特异性和敏感性，比常规pcr技术高效，灵敏特异的特点。具可以对牛群中感染和发病动物进行准确检测。

2、本发明的nano-pcr检测试剂盒可以对细胞培养物、血液、组织培养物、鼻拭子及粪拭子等多种样品的牛传染性鼻气管炎病毒(ibrv)进行快速检测，样品适用范围广，试剂盒提供的试剂无感染性、无生物安全隐患成分，使用安全性高。

3、本发明的nano-pcr检测试剂盒可在收到样品3小时内给出进行定性检测结果，反应灵敏特异，省时高效，是一种检测牛传染性鼻气管炎病毒的有效工具。

附图说明

图1为本发明的nano-pcr检测试剂盒的特异性检测电泳图；

图中：m为dl2000dnamarker，1-4为分别以bvdv、ibrv、bpiv3和ibrv阳性对照重组质粒为模板，加入鉴定牛传染性鼻气管炎病毒(ibrv)的引物p1和p2的检测结果，5为阴性对照(蒸馏水)。

图2为本发明的nano-pcr检测试剂盒的敏感性检测电泳图；

图2中：ibrv阳性对照重组质粒的检测浓度泳道2～7为2.23×10⁶拷贝/μl～2.23×10¹拷贝/μl，泳道1为阴性对照。

图3为本发明的nano-pcr检测试剂盒的普通pcr敏感性检测对比电泳图；

图中：ibrv阳性对照重组质粒的检测浓度泳道2～7为2.23×10⁶拷贝/μl～2.23×10¹拷贝/μl，泳道7为阴性对照。

图4、为本发明的nano-pcr检测试剂盒的ibrv病毒样品检测电泳图；

图中：m为dl2000dnamarker，3、5、6、7、8阳性结果，2、4、9、10、11为阴性结果，1为阴性对照。

图5为本发明的nano-pcr检测试剂盒的临床ibrv病毒样品普通pcr检测对比电泳图；

图中：m为dl2000dnamarker，3、5、6为阳性结果，1、2、4、7、8、9、10、11为阴性结果，1为阴性对照(蒸馏水)。

具体实施方式

本发明建立了牛传染性鼻气管炎病毒(bohv-1)的纳米pcr(nano-pcr)新型分子检测试剂盒。纳米技术近年来在疫病临床诊断中得到了广泛运用，有十分突出的优点。本发明针对bohv-1病毒ge基因(genbank:l27212.1)的序列设计引物，特异性识别靶基因序列的独立区域，利用金纳米颗粒导热快速，可与dna片段结合的原理，在pcr反应体系中加入一定浓度的金纳米颗粒，通过试验优化反映条件，建立了通特异性好、灵敏度高的bohv-1病毒nano-pcr方法，并对重复性、稳定性进行了评价。结果显示，试验条件经优化后，该方法在模板2.23×10²拷贝/μl仍能被检测出。应用本发明建立的检测试剂盒与普通pcr进行比较，灵敏性是普通pcr的10倍。对临床样品的检测，阳性检出率高于普通pcr40％。nano-pcr具有简单快速、灵敏度高、特异性强的优势，为bohv-1的临床检测提供了一种灵敏高效的试验手段，更适合ibr的诊断和临床快速检测。

实验材料：

牛传染性鼻气管炎病毒ibrv病毒阳性质粒、牛病毒性腹泻病毒(bvdv)病毒阳性质粒、牛副流感3型病毒(bpi3)病毒阳性质粒、牛呼吸道合胞体病毒(brsv)阳性质粒和大肠杆菌dh5α感受态细胞均由中国农业科学院特产研究所保存；

m-mlv反转录酶、rtaqdna聚合酶、mightyamp酶、dl2000dnamarker和dntp均购自宝生物工程(大连)有限公司；金纳米颗粒(20nm)购自sigma公司；dna提取试剂盒购自invitrogen公司。

实施例1本发明的牛传染性鼻气管炎nano-pcr检测试剂盒的组装

(1)配制nano-pcr反应液：

①根据ibrv病毒ge基因组的保守基因序列设计一对特异性引物，为鉴定牛传染性鼻气管炎病毒(ibrv)的引物p1和p2，引物的序列如下：

p1：5'-gctcgccaacttctttcaggg-3'，

p2：5'-gcgtcaaactcctcctcttcctc-3'，

②nano-pcr反应液的配制：反应液由mightyamp酶、金纳米颗粒溶胶(20nm，浓度0.5μg/μl)，2xbuffermix缓冲液、无菌双蒸水和上述①中的一对特异性引物组成。

(2)阳性对照重组质粒的构建

①制备牛传染性鼻气管炎病毒(ibrv)阳性对照质粒：利用mdbk细胞增殖牛传染性鼻气管炎病毒，培养40h后参照病毒dna提取试剂提取牛传染性鼻气管炎病毒dna为模板，以5'-gctcgccaacttctttcaggg-3'(p1)和5'-gcgtcaaactcctcctcttcctc-3'(p2)为引物进行pcr扩增，得到长度为306bp的扩增产物(ibrv306bp目的片段)，其序列如序列表中的seqidno:1所示。pcr反应条件为：98℃2min；98℃10s，57℃5s，68℃1min，35个循环；68℃总延伸10min，将扩增产物回收并纯化后克隆至pmd18-t载体，利用pmd18-t载体构建ibrv阳性对照重组质粒，最终得到牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒，送至invitrogen公司进行测序；

②阳性对照重组质粒的建立结果：上述一个阳性对照重组质粒经过测序后，进行核酸比对发现相关基因的核酸同源性达到99％以上，这表明所获得的阳性对照重组质粒均为阳性质粒，牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒的序列如序列表中的seqidno:2所示。

(3)设置阴性对照：阴性对照为蒸馏水。

实施例2本发明的牛传染性鼻气管炎nano-pcr检测试剂盒的使用方法

(1)对待检测的样品提取样品dna，待检测的样品包括细胞培养物、血液、组织培养物、鼻拭子及粪拭子等。

(2)nano-pcr反应条件的确定

经过对反应浓度和退火温度的条件的优化，确定在25μl反应体系中，引物p10.5μl，引物p20.5μl，mightyamp酶0.5μl，2×buffer12.5μl，模板1μl，金纳米颗粒溶胶0.5μl，去离子水补齐反应体系至25μl，brsv标准阳性质粒为阳性模板。反应条件设置为：98℃2min；98℃10s，退火温度范围55℃～63℃，退火时间5s～15s，68℃1min，30个循环，68℃总延伸10min，以双蒸水为阴性对照。

(3)以提取的样品dna为模板，将样品dna、阳性对照质粒、阴性对照分别加入到含有mightyamp酶、1xbuffermix缓冲液、无菌双蒸水和一对特异性引物的管中，98℃2min；98℃10s，57℃5s，68℃1min，35个循环；68℃总延伸10min。

(4)取5μlpcr产物，以1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

(5)判定结果：如果从待检测的样品中扩增到了306bp片段，则该待检测的样品中含有牛传染性鼻气管炎病毒。

实施例3本发明的牛传染性鼻气管炎病毒nano-pcr检测试剂盒的特异性实验

分别以ibrv、brsv、bvdv和bpi3阳性对照重组质粒以及阴性对照(蒸馏水)为模板，加入鉴定牛传染性鼻气管炎病毒(ibrv)的引物p1和p2，进行nano-pcr检测试剂盒的特异性实验。

实验结果：如图1所示，分别以bpiv3、brsv、bvdv和ibrv阳性对照重组质粒为模板出现其对应的阴性、阴性、阴性和306bp条带，阴性对照未扩增出任何条带。

实施例4本发明的牛传染性鼻气管炎病毒nano-pcr检测试剂盒的敏感性实验

分别以不同浓度的ibrv阳性对照重组质粒为模板，进行nano-pcr检测试剂盒的敏感性实验，并与普通pcr进行对比研究，ibrv阳性对照重组质粒的检测浓度为5.8×10⁷拷贝/μl～5.8×10¹拷贝/μl。

实验结果：如图2所示，m为dna2000marker，1为阴性对照，2至7为ibrv阳性对照重组质粒10倍系列稀释，最低检测结果为2.23×10²拷贝/μl。如图3所示，m为dna2000marker，1-6为ibrv阳性对照重组质粒10倍系列稀释，最低检测结果为2.23×10²拷贝/μl，7为阴性对照。

实施例5利用本发明的牛传染性鼻气管炎病毒nano-pcr检测试剂盒检测临床采集样品

(1)制备病毒核酸模板(病毒dna的提取)

参照病毒dna提取试剂提取临床样品的总dna作为ibrv病毒的nano-pcr模板。

(2)nano-pcr反应

以ibrv病毒提取的dna为模板，加入到包含引物的nano-pcr反应体系中，采用nano-pcr最佳反应条件对病毒模板进行检测，并与普通pcr方法进行比对检验。

(3)检测结果

如图4和图5所示，ibrv病毒出现其对应的306bp。nano-pcr检出5份阳性样品，pcr检出3份阳性样品。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定；对于所属技术领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动；这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举；而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。