一种金黄色葡萄球菌肽聚糖的多克隆抗体的制作方法

本发明涉及抗体及其制备方法技术领域，具体是一种金黄色葡萄球菌肽聚糖的多克隆抗体。

背景技术：

细菌对抗生素的耐药性随着新型及广谱抗生素的广泛使用而不断发生变化，其中革兰阳性菌(Gram-positive bacteria，G+)耐药性问题尤为突出，以葡萄球菌、链球菌和肠球菌的耐药性最为常见和严重。肽聚糖是革兰阳性菌细胞壁主要成分。而人、动物和植物细胞中并不含有这样的成分。因此，肽聚糖可以作为诊断是否为革兰阳性菌感染的靶标。医院内诊断革兰阳性菌，一般是通过微生物培养的方法。这要求能够获得病患处的活体组织，在很多情况下，这是不能的。例如金黄色葡萄球菌肺炎常见于新生儿和幼童，在这种情况下，组织培养的手段是不可行的。另一方面，还可能使病原菌流传开来，感染抵抗力较弱的病人。因此，开发非培养、非侵袭性的诊断方法是不仅关系到革兰阳性菌感染患者的生命，也关系到医院内其他病人的安全。其中，ELISA方法以其操作简便、灵敏度高等优点，广泛应用于临床检测和科学研究。

目前，在国内上并没有可以应用于临床的革兰阳性菌快速诊断试剂盒。我国国家药监局也没有给予任何厂家该领域市场准入证和许可证。因此，国内在该领域的研究是空白。在国际市场上，只有日本WAKO一家公司生产可以用于检测革兰阳性菌快速诊断试剂盒SLP，但仅供科研。因此，研发具有自主知识产权的肽聚糖检测试剂盒具有重要意义。而ELISA方法的关键是获取合适的抗体，双抗体夹心ELISA方法是本申请人准备研发的一种高效检测方法，该方法势必对抗体的要求很高，需要抗体之间能够较好的配对。本申请人已获取了一株具有广谱性检测革兰阳性菌的肽聚糖单克隆抗体3F8，专利号为CN102675457A。仅利用此株单克隆抗体建立检测革兰氏阳性菌的间接竞争ELISA方法，灵敏度为1ug/ml，对于人血清样本的检测具有一定的局限性，但未取得预期结果。基于双抗体夹心ELISA的高灵敏度的优点，为更高灵敏度检测人血清样本，因此，制备另一种抗体至关重要，故制备针对肽聚糖抗原的抗体成为开发该抗原检测试剂盒的关键。

多克隆抗体的优点是可以识别同一抗原的多个表位。故在免疫检测时，可识别更多的抗原，受抗原构象变化的影响较少。因此，采用多克隆抗体包被酶标板，可以捕获更多的抗原，再与特异性强的单克隆抗体结合，既提高了方法的灵敏度，也增加了方法的特异性。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，而提供一种金黄色葡萄球菌肽聚糖的多克隆抗体，为双抗体夹心ELISA方法的实现打下基础，为应用于临床的革兰氏阳性菌快速诊断试剂盒的早日上市提供保障。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种金黄色葡萄球菌肽聚糖多克隆抗体，该肽聚糖多克隆抗体通过如下方法取得：

一、免疫动物

(1)以与单克隆抗体3F8相同免疫原的金黄色葡萄球菌肽聚糖作为免疫原，免疫新西兰家兔；具体方法为：

①新西兰家兔，筛选条件为：雄性，单重在2.5kg-3.0kg之间；

②首次免疫剂量为500ug糖/只，佐剂为弗氏完全佐剂，与二次免疫间隔时间为3周；

③二次免疫免疫剂量为250ug糖/只，佐剂为弗氏不完全佐剂，与三次免疫间隔时间为2周；

④三次及以后免疫剂量、途径、佐剂同第二次免疫方式，两次免疫之间的间隔时间为2周，至第六次免疫；

二、多克隆抗体的获得

(1)效价测定：免疫过程中，从第三免以后，每次免疫后7天采血测定效价，至第六免确定血清效价稳定；

(2)抗血清分离：六免后血清效价达到1：10000以上，股动脉放血收集血清样本，分装后-20℃保存；

(3)饱和硫酸铵盐析法进行初步纯化

①取定量家兔血清与PBS缓冲液等体积混匀后，缓慢加入2倍家兔血清体积的饱和硫酸铵溶液，并进行4℃过夜；

②次日离心，取沉淀并用PBS缓冲液溶解，再加入与PBS缓冲液等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃透析，获得初步纯化产物；

(4)亲和层析进一步纯化得到多克隆抗体

采用GE ProteinA柱子进行亲和层析纯化，进一步纯化后得到多克隆抗体。

而且，在获得肽聚糖多克隆抗体的方法中，所述步骤(1)中的免疫具体包括：背部皮下注射免疫、腹腔注射免疫及静脉注射免疫。

而且，在获得肽聚糖多克隆抗体的方法中，所述步骤(1)中选择免疫的新西兰家兔由人工饲养的鼠、马、牛及羊替代，免疫剂量根据具体免疫动物种类，体重确定。

本发明的优点和效果是：

1、本发明本发明提供了一种抗金黄色葡萄球菌肽聚糖抗原的多克隆抗体，为以多克隆抗体灵敏度高的优点，单克隆抗体特异性好的优点，将两种抗体进行配对，建立检测革兰氏阳性菌的双抗体夹心ELISA方法打下了基础。不仅可以弥补医院内微生物培养病患处活体组织不易获取的不足。而且可以缩短检测时间，以最快的速度获取检测结果，便于患者早日治疗。

2、本发明的抗肽聚糖多克隆抗体不仅具有较高效价，而且在识别其他革兰氏阳性菌肽聚糖的同时不识别革兰氏阴性菌肽聚糖，具有较强特异性。

附图说明：

图1是兔多克隆抗体纯化后的SDS-PAGE图；

图2是兔多克隆抗体的效价测定结果；

图3是多克隆抗体对金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、沙克乳杆菌和植物乳杆菌来源的肽聚糖交叉反应率图；

图4是多克隆抗体对金黄色葡萄球菌肽聚糖、酵母菌1，3-β-D-葡聚糖、大肠杆菌肽聚糖及其脂多糖的交叉反应率图。

具体实施方式

下面结合具体实施方案对本发明进一步说明，其具体实施方案应该理解为仅为举例说明，不是限定性的，不能以下述举例说明来限定本发明的保护范围。

一种金黄色葡萄球菌肽聚糖多克隆抗体，该肽聚糖多克隆抗体通过如下方法取得：

一、免疫动物

(1)以与单克隆抗体3F8相同免疫原的金黄色葡萄球菌肽聚糖作为免疫原，免疫新西兰家兔；具体方法为：

①新西兰家兔，筛选条件为：雄性，单重在2.5kg-3.0kg之间；

②首次免疫剂量为500ug糖/只，佐剂为弗氏完全佐剂，与二次免疫间隔时间为3周；

③二次免疫免疫剂量为250ug糖/只，佐剂为弗氏不完全佐剂，与三次免疫间隔时间为2周；

④三次及以后免疫剂量、途径、佐剂同第二次免疫方式，两次免疫之间的间隔时间为2周，至第六次免疫；

其中，所述免疫具体包括：背部皮下注射免疫、腹腔注射免疫及静脉注射免疫。

在本发明的具体实施中，选择免疫的新西兰家兔由人工饲养的鼠、马、牛及羊替代，免疫剂量根据免疫动物种类，体重具体确定。

二、多克隆抗体的获得

(1)效价测定：免疫过程中，从第三免以后，每次免疫后7天采血测定效价，至第六免；

(2)抗血清分离：六免后血清效价达到1：10000以上，股动脉放血收集血清样本，分装后-20℃保存；

(3)饱和硫酸铵盐析法进行初步纯化

①取定量家兔血清样本与PBS缓冲液等体积混匀后，缓慢加入2倍家兔血清体积的饱和硫酸铵溶液，并进行4℃过夜；

②次日，离心，取沉淀并用PBS缓冲液溶解，再加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃透析，获得初步纯化产物；

(4)亲和层析进一步纯化得到多克隆抗体

采用GE ProteinA柱子进行亲和层析纯化，进一步纯化后得到多克隆抗体。

抗体的检测

1.SDS-PAGE电泳鉴定

对获得的初步纯化产物和进一步纯化产物进行SDS-PAGE电泳，结果见图1，经初步纯化后，采用亲和层析获取的进一步纯化产物在50KD和25KD处有两条明显条带，无其他杂带，说明获取的纯化抗体纯度较高。

2.间接ELISA法测定效价

选择Promega辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG作为本测定方法二抗。包被肽聚糖，对采集的血清样本进行不同梯度稀释，免疫前采血血清样本作为阴性对照，测定血清样本的最高稀释浓度。评价标准为大于阴性血清OD的2.1倍即认定为阳性。从结果图2可以看出，该抗体效价在1：10000以上。

3.多克隆抗体的性能测定

①多克隆抗体广谱性的鉴定

采用间接ELISA方法对获取的多克隆抗体进行其光谱性鉴定。方法为包被各种革兰氏阳性菌的肽聚糖，以获取的多克隆抗体为一抗进行测定。多克隆抗体进行定量稀释，计算所获得的抗体与各种菌株肽聚糖的交叉反应率。

Y＝S/Z*100％

S：多克隆抗体与自身金黄色葡萄球菌肽聚糖50％结合时的浓度

Z：多克隆抗体与其他种类革兰氏阳性菌肽聚糖50％结合时的浓度。

结果见图3。该多克隆抗体与不同来源的革兰氏阳性菌肽聚糖均具有较高的交叉反应率，大于85％。说明具有一定的广谱性。

②多克隆抗体特异性的检测

采用间接竞争ELISA方法进行该多克隆抗体的特异性检测。包被金黄色葡萄球菌提取的肽聚糖，以该多克隆抗体为一抗，分别以金黄色葡萄球菌肽聚糖、酵母菌1，3-β-D-葡聚糖、大肠杆菌肽聚糖及其脂多糖为竞争抗原进行特异性检测。计算交叉反应率：

Y＝S/Z*100％

S：金黄色葡萄球菌肽聚糖与50％抗体结合时的浓度

Z：干扰物质与50％抗体结合时的浓度。

结果见图4。该多克隆抗体对酵母菌1，3-β-D-葡聚糖、大肠杆菌脂多糖的交叉反应率小于0.1％，对大肠杆菌肽聚糖的交叉反应率小于1％，说明该多克隆抗体不仅与真菌检测指标1，3-β-D-葡聚糖、革兰氏阴性菌检测指标脂多糖没有交叉反应，而且与革兰氏阴性菌肽聚糖在可控范围内，证明该多克隆抗体具有较好的特异性。