一种重组马Interferon‑alpha‑1的制备方法与流程

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及Interferon-alpha-1（干扰素α1）真核细胞表达和制备技术领域，具体是指一种重组马Interferon-alpha-1的在酵母细胞内的重组、分泌表达和制备方法；此外本发明还涉及一种经密码子优化的编码马Interferon-alpha-1的核苷酸序列。

背景技术：

在被动免疫治疗和预防中，马抗体发挥了无可替代的作用。马抗蛇毒抗体是治疗蛇伤的最快速、最有效的药物。

上海赛伦生物技术股份有限公司利用马匹来生产抗生物毒素抗体，如抗蝮蛇血清、抗眼镜蛇血清、抗银环蛇血清、抗五步蛇血清等。这些血清特异性地治疗相应毒蛇咬伤的病人。在我国，应用了这些抗血清后，每年挽救了上万名蛇伤病人的生命。但是免疫马匹，获得高效价抗相应蛇毒抗体的成功率相对较低，能产生高抗体效价的马匹是非常宝贵的，因此需要保证这些马匹的健康。

我国每年有十几万人被毒蛇咬伤，临床使用抗蛇毒血清的量每年在10万支左右，用于免疫生产抗蛇毒血清的马匹保有量常年保持在500匹左右。这些群养的动物如果发生病毒感染，极易相互感染，需要能预防病毒感染的药物。

Interferon-alpha-1（干扰素α1）具有广谱抗病毒、抑制肿瘤细胞增殖以及调节免疫功能等作用。干扰素与细胞表面受体结合，诱导细胞产生多种抗病毒蛋白，抑制病毒在细胞内增殖。同时，它还可以激活自然杀伤细胞和抗原特异性T细胞，诱导及加强细胞表面主要组织相容性复合物(MHC)抗原的表达，促进宿主免疫应答，抑制或清除细胞内病毒，可以用于马病毒性传染病的预防。鉴于制备马Interferon-alpha-1需要大量的马白细胞，马白细胞的来源极其有限，无法获得大量的天然马Interferon-alpha-1，因此，亟需研发一种重组马Interferon-alpha-1的制备方法，其可以高表达、高纯度地获得具有生物学活性的重组马Interferon-alpha-1，对抗血清制品生产的原料保证具有重要意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题之一是提供一种重组马Interferon-alpha-1的制备方法，该重组马Interferon-alpha-1的制备方法设计巧妙，从而可以高表达、高纯度地获得具有生物学活性的重组马Interferon-alpha-1，进而可以作为在病毒性疾病流行时，用于马匹，以增强动物的免疫反应。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种经密码子优化的编码马Interferon-alpha-1的核苷酸序列。

为了解决上述技术问题，在本发明的第一方面，提供了一种重组马Interferon-alpha-1的制备方法，该方法包括如下步骤：

（1）将经过密码子优化的编码马Interferon-alpha-1的核苷酸序列构建入酵母细胞诱导表达载体中；

（2）然后转入酵母细胞进行培养后诱导表达；

（3）进行纯化，从而获得所述重组马Interferon-alpha-1。

其中，培养转化的酵母细胞所用的材料不含任何动物或人来源的物质，而且能在发酵过程中获得高细胞密度。培养转化的酵母细胞进行在含一种或多种可供选择的材料，如酵母提取物，甘油、甲醇和含氮盐类的培养基中实施。

较佳地，所述核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示的序列。编码如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

所述酵母细胞可以是任何合适的酵母细胞。

较佳地，所述酵母细胞是毕赤酵母细胞（即Pichia pastoris细胞）。

更佳地，所述毕赤酵母细胞（即Pichia pastoris细胞）是GS115细胞。

所述酵母细胞表达载体是毕赤酵母表达载体，载体转染入毕赤酵母细胞（Pichia pastoris细胞）后与酵母染色体重组整合入酵母染色体中。

所述的酵母表达载体是适合于毕赤酵母细胞（Pichia pastoris细胞）的表达载体。

较佳地，所述的酵母表达载体为Pichia pastoris分泌型载体。

更佳地，所述的酵母表达载体为Pichia pastoris分泌型载体，其所用的启动子为AOX1启动子。

能表达Interferon-alpha-1。

较佳地，所述诱导表达在培养液的OD₆₀₀达到20-400时启动。

更佳地，所述OD₆₀₀为50-300。

更进一步地，所述OD₆₀₀为150-250。

较佳地，所述的表达载体是分泌型表达载体，

更进一步地，所述诱导表达通过甲醇进行。

较佳地，所述纯化采用离子交换层析将所述重组马Interferon-alpha-1以单体形式分离。

重组Interferon-alpha-1纯化后可以进一步超滤浓缩然后添加保护剂和/或冷冻干燥保存。

在本发明的第二方面，提供了一种密码子优化的编码Interferon-alpha-1的核苷酸序列，其特点是，所述核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示的序列，适于上述的重组马Interferon-alpha-1的制备方法。

本发明的有益效果在于：本发明的重组马Interferon-alpha-1的制备方法是将经过密码子优化的编码马Interferon-alpha-1的核苷酸序列构建入酵母细胞诱导表达载体中，然后转入酵母细胞进行培养后诱导表达，并进行纯化，从而获得所述重组马Interferon-alpha-1，表达量可达约500 mg/l；纯度高，经检测，不含可以用SDS-PAGE或HPLC检测到的酵母细胞蛋白或其它残留物，通过实验表明获得的重组马Interferon-alpha-1具有生物学活性，因此本发明的重组马Interferon-alpha-1的制备方法设计巧妙，从而可以高表达、高纯度地获得具有生物学活性的重组马Interferon-alpha-1，进而可以作为大规模马匹饲养时在病毒性疾病流行时预防性使用，以增强动物的免疫反应，提高动物抵抗病毒传染病的能力，适于大规模推广应用。

附图说明

图1是本发明实施例2中马Interferon-alpha-1在毕赤酵母中表达所用的载体结构图谱。采用AOX1启动子与酵母ɑ-factor secretion signal分泌表达目的蛋白。

图2是本发明实施例2中表达马Interferon-alpha-1的重组Pichia pastoris诱导后的上清液在还原条件下SDS-PAGE结果示意图。图2中从左到右，1：为蛋白分子量标准；2. 为GS115酵母细胞；3-15为挑取的13个在无精氨酸培养板上生长的克隆。

图3是本发明实施例3中离子交换层析图谱，第一峰是上样流穿峰，第二峰为氯化钠洗脱蛋白，此峰洗脱的蛋白为马Interferon-alpha-1；第三峰为氢氧化钠清洗杂蛋白峰。

图4是本发明实施例3中离子交换层析样品SDS-PAGE的结果示意图，从左到右，1：培养上清液；2:离子交换层析流穿液；3：氯化钠洗脱蛋白；4：蛋白分子量标准。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特列举以下具体实施例详细说明。然而，具体实施例仅仅是用于举例说明，而不是对本发明的限制。

实施例I：表达序列获取和优化

为了达到使马Interferon-alpha-1在酵母细胞内高表达这个目的，通过查文献得到该完整基因的氨基酸序列（即SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列）。根据这个氨基酸序列，确定编码马Interferon-alpha-1的核苷酸序列（即SEQ ID NO:1所示的序列），经密码子优化设计了核苷酸序列（即SEQ ID NO:2所示的序列），将该核苷酸序列插入表达载体，然后转化酵母细胞。然后使用相应的诱导物进行诱导表达。可以使用毕赤酵母诱导表达系统。

实施例2：表达细胞株的构建和表达克隆筛选

在优选实施方案中，含密码子优化的马Interferon-alpha-1的核苷酸序列（即SEQ ID NO:1所示的序列） 在5’端加上XhoI位点和AAA AGA核苷酸序列，在3’端加入EcoRI位点。选用pPIC9质粒（Invitrogen），用XhoI和EcoRI双酶切使之线性化。将具有XhoI和EcoRI酶切获得的马Interferon-alpha-1 DNA 与XhoI和EcoRI线性化的pPIC9质粒（Invitrogen）连接（见图1），然后转化大肠杆菌菌株DH5ɑ（Invitrogen）获得，名称定为pPIC9-Interferon-alpha-1。可理解，本发明不限于马Interferon-alpha-1因子，也涉及其它动物来源的（狗、羊、兔等）的Interferon-alpha-1。

pPIC9-Interferon-alpha-1用SalI酶切使之成线性，用苯酚：氯仿：异戊醇（phenol:chloroform:isoamyl alcohol）(25:24:1)抽提后，上清加乙醇沉淀DNA。沉淀的DNA干燥去乙醇后加10微升TE缓冲液。

表达宿主细胞采用Pichia pastoris细胞株GS115。在长有GS115的YPD（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium(1L)，又叫酵母浸出粉胨葡萄糖培养基）平板上挑取单克隆细胞接种到含5毫升YPD培养基的50毫升conical（圆锥形）管中，在28-30℃，250-300rpm条件下培养过夜。取0.5毫升过夜的培养细胞接种到含500毫升YPD培养基的2升三角烧杯中，在28-30℃，250-300rpm条件下培养至OD₆₀₀=1.3-1.5。培养液1500g、4℃离心5分钟，弃上清。细胞重悬于500毫升冰2-8℃水中，1500g、4℃离心5分钟，弃上清。细胞重悬于250毫升冰2-8℃水中，1500g、4℃离心5分钟，弃上清。细胞重悬于温度为2-8℃、20毫升1 M 山梨醇中，1500g、4℃离心5分钟，弃上清。细胞重悬于温度为2-8℃、1毫升1 M 山梨醇中，此时重悬液的体积为1.5毫升左右。10微克线性化pPIC9-Interferon-alpha-1加入到80微升重悬的GS115细胞中混匀后转移到0.2cm的电转杯中，电转杯在冰浴中放置5分钟，在电转仪上脉冲电击细胞一次。电击后立即加入1毫升冰冻1 M 山梨醇，并转移到1.5毫升离心管中。取200微升涂布到RDB板（RDB培养板成分：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖；50mg/L L-谷氨酸；50mg/L L-甲硫氨酸；50mg/L L-赖氨酸；50mg/L L-亮氨酸；50mg/L L-异亮氨酸；20g/L琼脂）上，RDB板置28-30℃培养5-7天。挑取克隆，同时接种在MD培养板（MD培养板成分：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖，20g/L琼脂）和MM培养板（MM培养板成分：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；5ml/L甲醇；20g/L琼脂）上，置28-30℃培养2天。两天后比较同一克隆在MD培养板和MM培养板上生长状况，在MD和MM培养板上生长正常的克隆为Mut⁺,在MD培养板上生长正常，在MM培养板上生长很慢或不生长的克隆为Mut^s。

挑取Mut⁺克隆接种在含5毫升YPD培养基（YPD培养基成分：10g/L酵母提取物粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖）的50毫升conical管中， 置28-30℃摇床200-250rpm生长2天。离心弃上清，添加含1%甲醇的YP培养基（YP培养基成分：10g/L酵母提取物粉；20g/L蛋白胨）5毫升，置28-30℃摇床200-250rpm生长72小时，在培养24小时和48小时时每管分别加甲醇25微升。72小时后取培养上清，用SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）进行分析。SDS-PAGE参照Sambrook et al.,Molecular Biology: A Laboratory Method,1989上的方法进行。成层胶4%，分离胶12.5%。培养上清50微升和等量SDS-PAGE上样缓冲液混匀后取20微升上样。电泳结束后用考马斯亮蓝R-250染色，分析结果。从图2中可见，GS115细胞诱导后无19KD处蛋白条带，而在无精氨酸培养板上生长的13克隆大部分在19KD处有蛋白条带，有的克隆表达量高，有的克隆仅微量表达。表达阳性的克隆，在19KD处可见一蛋白条带。

实施例3：干扰素纯化

取50毫升SP-Sepharose FF装入2.6x10cm层析柱，凝胶先后用2体积1M NaCl, 2体积0.5 N NaOH清洗后用pH4.0、50 mM醋酸缓冲液平衡。

四个2000毫升三角烧瓶，每个含500毫升YPD培养基，均接种筛选到的最佳

Interferon-alpha-1表达克隆，28-30℃摇床200-250rpm生长48小时，离心弃上清，在无菌条件下各加含0.5%（v/v）甲醇的YP培养基500毫升，28-30℃摇床200-250rpm生长72小时，每24小时各添加2.5毫升甲醇。72小时后离心取上清，上清用20%醋酸调pH至4.0，上已经平衡的SP-Sepharose FF离子交换层析柱。上样完毕，层析柱用pH4.0、50 mM醋酸缓冲液洗涤至OD₂₈₀小于0.05，接着用pH4.0、50 mM醋酸、0.5 M氯化钠缓冲液洗脱，收集洗脱获得的蛋白峰，这个蛋白峰即为高纯度重组马Interferon-alpha-1（见图3，第一峰是上样流穿峰；第二峰为氯化钠洗脱蛋白，此峰洗脱的蛋白为马Interferon-alpha-1；第三峰为氢氧化钠清洗杂蛋白峰）。SDS-PAGE中在19KD处有一蛋白条带，未见其它蛋白条带（见图4）。2000毫升培养上清可以获得500毫克马Interferon-alpha-1，表达量可达约500 mg/l；经检测，不含可以用SDS-PAGE或HPLC检测到的酵母细胞蛋白或其它残留物。

实施例4：干扰素活性测定

用rhIFN-ɑ2b作对照（人干扰素生物学活性测定的国家标准品），采用滤泡性口膜炎病毒（VSV）-人羊膜传代细胞（WISH）体系测定干扰素的抗病毒活性。系依据干扰素可以保护人羊膜细胞WISH免受VSV破坏的作用，用结晶紫对存活的WISH细胞染色，于波长570nm处测定其吸光度，可得到干扰素对WISH细胞的保护效应曲线，以此测定干扰素生物学活性。

试剂:

1.每升MEM加青霉素10⁵IU和链霉素10⁵IU再加碳酸氢钠2.1g，除菌过滤，4℃保存。

 2.完全培养液量取新生牛血清10ml加MEM培养液90ml。4℃保存。

3.测定培养液量取新生牛血清7ml加MEM或RPMI 1640培养液93ml, 4℃保存。

4.攻毒培养液量取新生牛血清3ml加MEM培养液97ml,4℃保存。

5.消化液取乙二胺四乙酸二钠0.2g、氯化钠8.0g、氯化钾2g、磷酸氢二钠1.152g、磷酸二氢钾0.2g加水溶解并稀释至1000ml经121℃ 15分钟灭菌。使用时加胰蛋白酶至0.25%（w/v）浓度。

6.染色液取结晶紫50mg加无水乙醇20ml溶解后加水稀释至100ml即得。

7.脱色液取无水乙醇50ml、乙酸0.1ml加水稀释至100ml。

8.PBS缓冲液取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g加水溶解并稀释至1000ml经121℃ 15分钟灭菌。

9. 标准品溶液的制备：取人干扰素生物学活性测定的国家标准品，按说明书复溶后用测定培养液稀释至每1ml含1000IU。在96孔细胞培养板中做4倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。

10. 供试品溶液的制备将供试品按标示量溶解后用测定培养液稀释成每1ml约含1000IU。在96孔细胞培养板中,做4倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2个孔。在无菌条件下操作。

具体实验如下：

使WISH细胞在含10%小牛血清的MEM培养基中贴壁生长。按1:3传代每周2次于完全培养液中生长。弃去培养液用PBS洗贴壁细胞2次后，消化和收集细胞，用含10%小牛血清的MEM培养基配制成每1ml 含2.5×10⁵~3.5×10⁵个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl。于37℃、5%二氧化碳条件下培养6小时。弃去孔中细胞培养液，将配制完成的标准品溶液和供试品溶液移入接种WISH细胞的培养板中，每孔加入100μl。于37℃、5%二氧化碳条件下培养24小时。弃去细胞培养板中的上清液。分别向每孔加100μl将配制好的水泡性口炎病毒（VSV）（-70℃保存）攻毒培养液。于37℃、5%二氧化碳培养24小时，镜检观察细胞状况后弃细胞培养板中的上清，每孔加入染色液50μl，室温放置30分钟后用流水小心冲去染色液，并吸干残留水分每孔加入脱色液100μl室温放置3-5分钟。混匀后用酶标仪以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果，计算实验样品中的半效稀释倍数，然后按公式：待测样品效价=标准品效价x待测样品预稀释倍数/标准样品预稀释倍数x待测样品半效稀释倍数/标准样品半效稀释倍数。经测定，1毫克马Interferon-alpha-1活性为3.5x10⁸，其活性与人α2b干扰素相似。

表达的Interferon-alpha-1蛋白与其它杂蛋白分离，随后超滤浓缩，添加保护剂并冷冻干燥。结果表明，采用本发明的方法可以高表达、高纯度地获得具有生物学活性的重组马Interferon-alpha-1。马Interferon-alpha-1的氨基酸序列（带有信号肽）如SEQ ID NO:3所示，重组表达马Interferon-alpha-1的氨基酸序列（无信号肽）如SEQ ID NO:4所示。

综上，本发明的重组马Interferon-alpha-1的制备方法设计巧妙，从而可以高表达、高纯度地获得具有生物学活性的重组马Interferon-alpha-1，进而可以作为大规模马匹饲养时在病毒性疾病流行时预防性使用，以增强动物的免疫反应，提高动物抵抗病毒传染病的能力，适于大规模推广应用。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

序列表

<110>上海赛伦生物技术股份有限公司

<120>一种重组马Interferon-alpha-1的制备方法

<130>HJ17-12952

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 552

<212> DNA

<213> 马Interferon-alpha-1

<400> 1

atggctttgc cagtttcttt gttgatggct ttggttgttt tgtcttgtca ctctatctgt 60

tctttgggtt gtgacttgcc acacactcac tctttgggta acactagagt tttgatgttg 120

ttgggtcaaa tgagaagaat ctctccattc tcttgtttga aggacagaaa cgacttcggt 180

ttcccacaag aagttttcga cggtaaccaa ttcagaaagc cacaagctat ctctgctgtt 240

cacgaaacta tccaacaaat cttccacttg ttctctactg acggttcttc tgctgcttgg 300

gacgaatctt tgttggacaa gttgtacact ggtttgtacc aacaattgac tgaattggaa 360

gcttgtttgt ctcaagaagt tggtgttgaa gaaactccat tgatgaacga agactctttg 420

ttggctgtta gaagatactt tcagagaatc gcgttgtact tgcaagagaa gaagtactct 480

ccatgtgctt gggaaatcgt tagagctgaa atcatgagat cgttctcttc ttctactaac 540

ttgccacaat ct 552

<210> 2

<211> 552

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggctttgc cagtttcttt gttgatggct ttggttgttt tgtcttgtca ctctatctgt 60

tctttaggtt gtgacttacc acacactcac tctttgggta acactagagt tttgatgttg 120

ttaggtcaaa tgagaagaat ctctccattc tcttgtttga aggacagaaa cgacttcggt 180

ttcccacaag aggttttcga cggtaaccaa ttcagaaagc cacaagctat ctctgctgtt 240

cacgaaacta tccaacaaat cttccacttg ttctctactg acggttcttc tgctgcttgg 300

gacgaatctt tgttagacaa gttgtacact ggtttgtacc aacaattgac tgaattagag 360

gcttgtttgt ctcaagaagt tggtgttgaa gagactccat tgatgaacga agactctttg 420

ttagctgtta gaagatactt tcagagaatc gcattgtact tacaagagaa gaagtactct 480

ccatgtgctt gggaaatcgt tagagctgag atcatgagat cgttctcttc ttctactaac 540

ttaccacaat ct 552

<210> 3

<211> 553

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

METALALEUP ROVALSERLE ULEUMETALA LEUVALVALL EUSERCYSHI SSERILECYS 60

SERLEUGLYC YSASPLEUPR OHISTHRHIS SERLLEUGLY ASNTHEARGV ALLEUMETLE 120

ULEUGLYGLN METARGARGI LESERPROPH ESERCYSLEU LYSASPARGA SNASPPHEGL 180

YPHEPROGLN GLUVALPHEA SPGLYASNGL NPHEARGLYS PROGLNALAI LESERALAVA 240

LHISGLUTHR ILEGLNGLNI LEPHEHISLE UPHESERTHR ASPGLYSERS ERALAALATR 300

PASPGLUSER LEULEUASPL YSLEUTYRTH RGLYLEUTYR GLNGLNLEUT HRGLULEUGL 360

UALACYSLEU SERGLNGLUV ALGLYVALGL UGLUTHRPRO LEUMETASNG LUASPSERLE 420

ULEUALAVAL ARGARGTYRP HEGLNARGIE UALALEUTYR LEUGLNGLUL YSLYSTYRSE 480

RPROCYSALA TRPGLUILEV ALARGALAGL UILEMETARG SERPHESERS ERSERTHRAS 540

NLEUPROGLN SER 553

<210> 4

<211> 484

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

CYSASPLEUP ROHISTHRHI SSERLLEUGL YASNTHEARG VALLEUMETL EULEUGLYGL 60

NMETARGARG ILESERPROP HESERCYSLE ULYSASPARG ASNASPPHEG LYPHEPROGL 120

NGLUVALPHE ASPGLYASNG LNPHEARGLY SPROGLNALA ILESERALAV ALHISGLUTH 180

RILEGLNGLN ILEPHEHISL EUPHESERTH RASPGLYSER SERALAALAT RPASPGLUSE 240

RLEULEUASP LYSLEUTYRT HRGLYLEUTY RGLNGLNLEU THRGLULEUG LUALACYSLE 300

USERGLNGLU VALGLYVALG LUGLUTHRPR OLEUMETASN GLUASPSERL EULEUALAVA 360

LARGARGTYR PHEGLNARGI EUALALEUTY RLEUGLNGLU LYSLYSTYRS ERPROCYSAL 420

ATRPGLUILE VALARGALAG LUILEMETAR GSERPHESER SERSERTHRA SNLEUPROGL 480

NSER 484