一种在微通道内固定化蛋白质的方法及应用与流程

本发明属于生物化工技术和分析检测领域，具体涉及一种在微通道内固定化蛋白质的方法及应用。

技术背景

微通道(microchannel)是微反应器、检测器、微流混合器、微流传感器等设备的核心精密组件结构，广泛用于化学品的生产、材料的合成、物质的超细粉碎或乳化、物料的快速混合、信号的发生、探测与控制、化学或生物物质的检测和分析等。在许多情况下，需要蛋白质能够稳定固定于微通道的内表面。然而在微通道内表面固定蛋白质往往是一件费时费力且成本高昂的工作，目前除了在一些贵重分析检测设备中有少量应用外，在实际应用中并不多见。借鉴于传统的蛋白质固定技术，对于在微通道表面固定化蛋白质已经有了多种多样的尝试，例如共价交联，表面功能化处理以吸附或捕捉目标蛋白，以及简单的物理吸附，等等。鉴于蛋白质具有一定的寿命，并不适于长时间使用，因此固定化蛋白质的微通道在功能上也随所固定的蛋白质一样具有同等且较短的寿命，由于生产价格较为昂贵，从生产成本上考虑，微通道需要长久重复使用，这就要求蛋白质在微通道内表面的固定化具有以下技术特点：1-操作简便，成本低廉；2-易于在微通道内重复进行蛋白质的“固定化—使用—清除—重新固定化”操作。此外，由于制造微通道的材料可以多种多样，这就要求理想的蛋白质固定化技术也必须适用于不同材质的微通道内表面。基于上述要求，一般来讲共价交联并不便于所固定蛋白质的清除和多次重复固定化，且该技术需要功能化微通道内表面，使其能与蛋白质共价交联，适用材质的范围窄且操作成本高。而通过内表达的功能化的处理来吸附固定化蛋白质的方法，也具有类似缺陷，一方面微通道的选材往往多种多样，内表面的功能化处理技术往往适用性差，另一方面内表面的功能化成本较高且由于表面功能层也具有一定的寿命而不适于蛋白质的多次重复固定化。相比于前两种，在微通道内表面通过简单的物理吸附作用来固定化蛋白质将是一种理想的技术，但其前提是要满足下述三个要求，即1-操作简便，成本低廉；2-易于在微通道内重复进行蛋白质的“固定化—使用—清除—重新固定化”操作；3-适用于不同材质的微通道内表面。然而到目前为止，可以同时满足上述要求的实用技术却没有报道。

基于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种在微通道内表面固定化蛋白质的方法，该方法可满足三个要求，即1-操作简便，成本低廉；2-易于在微通道内重复进行蛋白质的“固定化—使用—清除—重新固定化”操作；3-适用于不同材质的微通道内表面。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

一种在微通道内固定化蛋白质的方法，包含下列步骤：

步骤一，magr与目标蛋白质的融合重组表达；

步骤二，含有融合重组蛋白质的液体在处于磁场中的微通道内时，目标蛋白质固定化在微通道内壁上；

步骤三，使用过程中，从微通道内壁脱离的融合重组蛋白，在微通道末端出口被强磁场吸附回收；

步骤四，所固定的蛋白质在使用完毕后，通过流体冲洗，清除所固定化的蛋白质；

步骤五，清除所固定化的蛋白质后，重复步骤二至步骤四，实现在微通道内重复进行蛋白质的“固定化—使用—清除—重新固定化”操作。

进一步地，所述magr是如下蛋白质(i)或(ii)或(iii)：

(i)与seqidno:1或seqidno:2所示的氨基酸序列同源；

(ii)在(i)限定的氨基酸序列中经过取代，缺失或者叠加一个或几个氨基酸衍生的蛋白质；

(iii)与seqidno:1或seqidno:2所编码蛋白的功能相同的蛋白质。

进一步地，步骤一中所述magr与目标蛋白质的融合重组，为magr的c端与目标蛋白质的n端融合，或目标蛋白质的c端与magr的n端融合。

可选地，步骤一中所述magr与目标蛋白质的融合重组，为magr的c端通过一段连接肽与目标蛋白质的n端融合，或目标蛋白质的c端通过一段连接肽与magr的n端融合。

进一步地，步骤一中所述magr与目标蛋白质的融合重组表达，以原核微生物、真核微生物或动物细胞昆虫细胞为宿主。

进一步地，步骤一中所述magr与目标蛋白质的融合重组表达，在宿主细胞内表达或细胞外分泌表达。

进一步地，步骤二中所述含有融合重组蛋白质的液体是指：magr与目标蛋白质的融合重组表达后，如果是在宿主细胞内表达的，则通过破壁，来释放与magr重组的目标蛋白，破壁液的上清即为含有融合重组蛋白的液体；如果是在宿主细胞外分泌表达的，则直接取上清液，即含有融合重组蛋白的液体。

进一步地，步骤二中的磁场由外加磁场产生，或者由铁磁体内壁产生。

进一步地，所述外加磁场是指在微通道外施加永磁体或电磁体所产生的磁场。

进一步地，所述铁磁体内壁是指微通道设备的微通道内壁是铁磁体材料制成，具有铁磁性。

进一步地，通过在具有铁磁性内壁的微通道外施加永磁体或电磁体所产生的磁场，来增强目标蛋白在微通道内壁固定化的强度。

进一步地，步骤三中，所述强磁场由强磁模块产生，所述强磁模块由永磁体或电磁体构成。

进一步地，步骤四中，对于通过外加磁场实现的蛋白质固定化，通过撤除磁场，在微通道内壁为非铁磁体的情况下，直接通过水或其他溶剂等流体冲洗，即可清除所固定化的蛋白质；在微通道内壁为铁磁体的情况下，通过添加蛋白酶的流体冲洗微通道，可清除所固定化的蛋白质。

本发明的目的之一是提供一种在微通道内表面固定化蛋白质的应用，所述固定化蛋白质应用于微通道反应器的酶催化反应、微流传感器芯片的分析检测等领域。

本发明的原理根基于一种动物来源的磁受体蛋白magr棒状复合体的对铁磁体材质及磁力的强相互作用而实现。与现有技术相比，本发明具有明显优点，即可同时满足以下要求：

1)操作简便，成本低廉；

2)易于在微通道内重复进行蛋白质的“固定化—使用—清除—重新固定化”操作；

3)适用于不同材质的微通道内表面。

附图说明

图1为果蝇magr的氨基酸编码序列seqidno:1。

图2为鸽子magr的氨基酸编码序列seqidno:2。

图3为果蝇磁受体dmagr与红色荧光蛋白的重组融合方式与融合蛋白的磁性吸附。

图4为鸽子磁受体clmagr与绿色荧光蛋白的重组融合方式与融合蛋白的磁性吸附。

图5为magr与荧光蛋白分别在枯草芽孢杆菌(a)、里氏木霉(b)和cho细胞(c)中表达的粗蛋白被磁铁的吸附聚集。

图6为重组magr-蛋白分子在外加磁场微通道(微通道内壁为非铁磁材料)上的固定化及洗脱示意图。

图7为重组magr-蛋白分子在外加磁场微通道(微通道内壁为铁磁材料)上的固定化及洗脱示意图。

图8为微通道固定化酶催化反应示意图。

图9为微通道中的酶联免疫分析，其中第一(一级)抗体被固定化在微通道芯片的微通道表面。

其中，图6a-蛋白分子溶液流向外加磁场的微通道；图6b-蛋白分子被磁场吸附在微通道内壁上，其中2级磁场捕获吸附1级磁场未吸附完全的蛋白分子；图6c-底物分子流经微通道，与蛋白分子发生作用(可为酶催化反应，或者也可为抗体-抗原作用)；图6d-产物流出微通道；图6e-解除外加磁场，蛋白分子从微通道内壁上释放出来，去固定化；图6f-蛋白分子随清洗液流出微通道；图7a-蛋白分子溶液流向外加磁场的微通道；图7b-蛋白分子吸附在铁磁微通道内壁上，其中2级磁场捕获吸附1级磁场未吸附完全的蛋白分子；图7c-底物分子流经微通道，与蛋白分子发生作用(可为酶催化反应，或者也可为抗体-抗原作用)；图7d-产物流出微通道；图7e-清洗微通道；图7f-蛋白酶流进微通道，酶解蛋白分子；图7g-撤除外加磁场，蛋白分子被蛋白酶降解；图7h-清洗微通道，降解产物流出微通道。

具体实施方式

以下对本发明在具体应用中的最佳实施例进行详细说明，需要说明的是，这些实施例并非对本发明的权利要求保护范围进行约束。

本发明基于magr复合物的强磁性特点，来实现蛋白质在微通道内表面的非共价物理吸附式固载。

本发明提供的是一种蛋白质在微通道内固定化的方法，适用于多种蛋白质，并不局限于某种或某几种蛋白质，以下实施例中对几种蛋白质的描述，仅为举例，非为限定，从这些蛋白质可很容易推广到其它蛋白质，即以下举例的蛋白质可换成多种蛋白质，由于本发明所适用的蛋白质数据太过巨大，此处不能一一列举。

magr可以有不同来源，本发明只提供果蝇来源的magr的编码序列seqidno:1，以及鸽子来源的编码序列seqidno:2，这并不意味着magr局限于这两个来源，对任一具有生物学同源知识的人来讲，以seqidno:1或seqidno:2序列为模板可极容易地在其它物种中获得与seqidno:1或seqidno:2功能相同的同源基因及其编码的magr。

本发明所使用的微通道反应器每个模块的流体通道并无统一规制，流体通道的宽度和深度为0.5μm～50mm。制造这些模块的材料不受限制，可以为不锈钢、超硬钢、铁、铜、红宝石、金刚石、陶瓷、碳化硅、玻璃、金属陶瓷复合材料或其他高分子材料。本发明中的微通道反应器可以为商品化的微通道反应器，例如，美国康宁公司生产的心型结构g1玻璃高通量微通道反应器，或者依据相同原理制备得到的其他商品化或非商品化微通道反应器。

实施例1：果蝇magr与红色荧光蛋白的重组融合

按照果蝇magr(此处简称dmagr)的氨基酸编码序列seqidno:1，根据所用的表达宿主优化合成seqidno:1所对应的基因dmagr。本实施例以红色荧光蛋白mcherry为代表蛋白，其基因mcherry与magr进行重组连接，方式有以下几种(如图3的a部分)：

(1)dmagr的3’端直接与mcherry的5’端相连接。此基因重组的方式，在表达以后，可获得dmagr的c端与mcherry荧光蛋白的n端的直接融合，成为一重组蛋白。

(2)dmagr的3’端通过任一编码短肽的短核苷酸序列与mcherry的5’端相连接。此基因重组的方式，在表达以后，可获得dmagr的c端通过一短肽与mcherry荧光蛋白的n端的相融合，成为一重组蛋白。

(3)mcherry的3’端直接与dmagr的5’端相连接。此基因重组的方式，在表达以后，可获得mcherry荧光蛋白的c端与dmagr的n端的直接融合，成为一重组蛋白。

(4)dmagr的3’端通过任一编码短肽的短核苷酸序列与mcherry的5’端相连接。此基因重组的方式，在表达以后，可获得mcherry荧光蛋白的c端通过一短肽与dmagr的n端相融合，成为一重组蛋白。

以上重组方式，均可获得具有mcherry荧光的重组表达蛋白，且均可被磁铁吸附聚集(图3的b部分)。

实施例2：鸽子magr与绿色荧光蛋白的重组融合

按照鸽子magr(此处简称clmagr)的氨基酸编码序列seqidno:2，根据所用的表达宿主优化合成seqidno:2所对应的基因clmagr。本实施例以绿色荧光蛋白mgfp为代表蛋白，其基因mgfp与clmagr进行重组连接，方式有以下几种(如图4的a部分)：

(1)clmagr的3’端直接与mgfp的5’端相连接。此基因重组的方式，在表达以后，可获得clmagr的c端与mgfp荧光蛋白的n端的直接融合，成为一重组蛋白。

(5)clmagr的3’端通过任一编码短肽的短核苷酸序列与mgfp的5’端相连接。此基因重组的方式，在表达以后，可获得clmagr的c端通过一短肽与mgfp荧光蛋白的n端的融合，成为一重组蛋白。

(6)mgfp的3’端直接与clmagr的5’端相连接。此基因重组的方式，在表达以后，可获得mgfp荧光蛋白的c端与clmagr的n端的直接融合，成为一重组蛋白。

(7)clmagr的3’端通过任一编码短肽的短核苷酸序列与mgfp的5’端相连接。此基因重组的方式，在表达以后，可获得mgfp荧光蛋白的c端通过一短肽与clmagr的n端相融合，成为一重组蛋白。

以上重组方式，均可获得具有mgfp荧光的重组表达蛋白，且均可被磁铁吸附聚集(图4的b部分)。

实施例3：重组融合蛋白在大肠杆菌中的表达

实施例1中，如图3的a部分所示的四种果蝇magr与红色荧光蛋白mcherry的重组融合方式，构建于常规大肠杆菌表达pet载体，然后在常规大肠杆菌表达宿主bl21(de3)中表达。于28摄氏度左右，分别通过iptg诱导，四种融合重组的蛋白均能表达出红色荧光蛋白，蛋白质经匀浆破壁后，可获得粗蛋白液，在6000-7000高斯的磁场作用下，均可发生吸附聚集(图3的b部分)。其中以图3的a部分中(1)dmagr的c端与mcherry的n端直接融合的产物以及(2)dmagr的c端与mcherry的n端通过一段短肽相融合的产物的吸附效果最佳，在强磁场的作用下(6000-7000高斯，永磁铁)，吸附率可达到95％以上，(4)mcherry的n端通过一段短肽与dmagr的c端相融合的产物的吸附效果稍差，吸附率约为85％左右，而(3)mcherry的n端与dmagr的c端直接融合的产物吸附效果最差，仅为75％左右。

实施例4：重组融合蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达

实施例1中，如图3的a部分所示的四种果蝇magr与红色荧光蛋白mcherry的重组融合方式，构建于枯草芽孢杆菌psk4衍生杂交型启动子的表达载体，然后在枯草芽孢杆菌表达宿主wb800n中表达。于30摄氏度左右，四种融合重组的蛋白均能表达出红色荧光蛋白，表达量可达到实施例3中大肠杆菌表达量的45％左右，提取的浓缩粗蛋白液，均可被磁铁吸附聚集。其中以(1)dmagr的c端与mcherry的n端直接融合的产物以及(2)dmagr的c端与mcherry的n端通过一段短肽相融合的产物的吸附效果最佳，在强磁场的作用下(6000-7000高斯，永磁铁)，吸附率可达到90％左右(图5的a管)，(4)mcherry的n端通过一段短肽与dmagr的c端相融合的产物的吸附效果稍差，吸附率约为80％左右，而(3)mcherry的n端与dmagr的c端直接融合的产物吸附效果较差，约为65％左右。

实施例5：重组融合蛋白在毕赤酵母中的表达

实施例2中，如图4的a部分所示的四种鸽子magr与绿色荧光蛋白mgfp的重组融合方式，分别通过ppic3.5k和ppic9k中，构建于常规毕赤酵母gs115中表达。于30摄氏度左右，四种融合重组的蛋白均能表达出绿色荧光蛋白，而且也均可被磁铁吸附聚集，其中ppic9k作为载体的表达效果较佳，提取ppic9k为载体的表达菌株生产的粗蛋白，在6000-7000高斯的磁场作用下，发生吸附聚集的情况如图4的b部分所示。在以ppic9k为载体的表达菌株中，其中以(1)clmagr的c端与mgfp的n端直接融合以及(2)clmagr的c端与mgfp的n端通过一段短肽相融合的表达效果最佳，且吸附效果最佳，在(6000-7000高斯磁场作用下，吸附率可达到90％左右，(4)mcherry的n端通过一段短肽与dmagr的c端相融合的产物的吸附效果稍差，吸附率约为75％左右，而(3)mcherry的n端与dmagr的c端直接融合的产物吸附效果较差，约为60％左右。

实施例6：重组融合蛋白在里氏木霉中的表达

将里氏木霉纤维二糖水解酶(cbh1)和丙酮酸脱羧酶基因启动子(ppdc)相融合组成杂合型启动子，同cbh1自身信号肽、终止子和潮霉素筛选基因依次插入骨架质粒puc19中，构建出里氏木霉表达载体ptr，分别把实施例2中，如图4的a部分所示的四种鸽子磁受体clmagr与绿色荧光蛋白mgfp的重组融合方式，构建入ptr载体中，然后通过农杆菌介导转化入里氏木霉中，筛选获得稳定遗传的高表达菌株。于28摄氏度左右，四种融合重组的蛋白均能表达出绿色荧光蛋白，而且也均可被磁铁吸附聚集。其中以(1)clmagr的c端与mgfp的n端直接融合的产物以及(2)clmagr的c端与mgfp的n端通过一段短肽相融合的产物的吸附效果最佳(图5的b管)，在强磁场的作用下(6000-7000高斯，永磁铁)，吸附率可达到95％左右，(4)mcherry的n端通过一段短肽与dmagr的c端相融合的产物的吸附效果稍差，吸附率约为85％左右，而(3)mcherry的n端与dmagr的c端直接融合的产物吸附效果较差，约为70％左右。

实施例7：重组融合蛋白在cho细胞(中国仓鼠卵巢细胞)中的表达

实施例2中，如图4的a部分所示的四种鸽子磁受体clmagr与绿色荧光蛋白mgfp的重组融合方式，分别通过lentiviralvector构建于cho无血清培养的表达系统中表达。于37度左右，四种融合重组的蛋白均表达出绿色荧光蛋白，且均可被磁铁吸附聚集。其中以(1)clmagr的c端与mgfp的n端直接融合的产物以及(2)clmagr的c端与mgfp的n端通过一段短肽相融合的产物的吸附效果最佳(图5的c管)，在强磁场的作用下(6000-7000高斯，永磁铁)，吸附率可达到90％左右，(4)mcherry的n端通过一段短肽与dmagr的c端相融合的产物的吸附效果稍差，吸附率约为85％左右，而(3)mcherry的n端与dmagr的c端直接融合的产物吸附效果较差，约为70％左右。

实施例8：重组融合蛋白在微通道铁磁体内表面上的固定化

实施例5所获得的四种重组蛋白，在发酵结束后，以6000-7000高斯的永磁铁吸附目标蛋白，移除菌体和大部分液体后，加纯净水溶解稀释磁吸附的沉淀，配成浓度为100mg/l的重组融合蛋白溶液30ml。然后通过泵把溶液以1ml/min的速度泵入微通道反应器的微通道内，此微通道长度为0.1m，管径为0.1mm，此微通道内表面材料为铁磁体。结果表明，实施例5所获得的四种重组蛋白，均可以在5分钟内快速吸附固定化于微通道内壁上。

在重组蛋白未能占满微通道铁磁体内表面时，即微通道铁磁体内表所固定的蛋白质未饱和时，对于clmagr的c端与mgfp的n端直接融合的蛋白以及clmagr的c端与mgfp的n端通过一段短肽相融合的蛋白来讲，80％的重组蛋白可在1分钟内吸附于微生物通道内壁上，3分钟吸附率稳定在90％左右，不再增加。mcherry的n端通过一段短肽与dmagr的c端相融合的产物的吸附效果稍差，3分钟吸附率稳定在75％左右，mcherry的n端与dmagr的c端直接融合的产物，3分钟吸附率稳定在60％左右。

在重组蛋白相对于占满微通道铁磁体内表面过剩的情况下，微通道铁磁体内表面对实施例5所构建的四种融合蛋白的吸附规律相同，1分钟内相当于75％饱和当量的蛋白已吸附于微生物通道内壁上，随后吸附率缓慢增加，5分钟以后基本达到吸附饱和，此后吸附率无明显增加。

上述所固定的蛋白，在高压力高速流体的工作条件下，所固定的蛋白质有脱吸附现像。(1)clmagr的c端与mgfp的n端直接融合的产物以及(2)clmagr的c端与mgfp的n端通过一段短肽相融合的产物在固定化效果较好，5bar压力10m/s的纯水流作用下，所固定蛋白质的达到50％脱吸率，时间约为80min。而(3)mcherry的n端与dmagr的c端直接融合的产物和(4)mcherry的n端通过一段短肽与dmagr的c端相融合的产物的吸附稳定较差，达到50％脱吸率，所用时间分别为35min和50min。

实施例9：重组融合蛋白在外加磁场微通道非铁磁体内表面上的固定化

实施例5所获得的四种重组蛋白，在发酵结束后，以6000-7000高斯的永磁铁吸附目标蛋白，移除菌体和大部分液体后，加纯净水溶解稀释磁吸附的沉淀，配成浓度为100mg/l的重组融合蛋白溶液30ml。然后通过泵把溶液以1ml/min的速度泵入微通道反应器的微通道内，此微通道长度为0.1m，管径为0.1mm，此微通道内表面为非铁磁体。此微通道反应器置于外加的永磁铁营造的6000-7000高斯的磁场内，结果表明，实施例5所获得的四种重组蛋白，均可以在3分钟内快速吸附固定化于微通道内壁上。

在重组蛋白未能占满微通道铁磁体内表面时，即微通道铁磁体内表所固定的蛋白质未饱和时，对于clmagr的c端与mgfp的n端直接融合的蛋白以及clmagr的c端与mgfp的n端通过一段短肽相融合的蛋白来讲，95％的重组蛋白可在1分钟内吸附于微生物通道内壁上，2分钟吸附率稳定在90％左右，不再增加。mcherry的n端通过一段短肽与dmagr的c端相融合的产物的吸附效果稍差，2分钟吸附率稳定在75％左右，mcherry的n端与dmagr的c端直接融合的产物，2分钟吸附率稳定在60％左右。

在重组蛋白相对于占满微通道铁磁体内表面过剩的情况下，微通道铁磁体内表面对实施例5所构建的四种融合蛋白的吸附规律相同，1分钟内相当于90％饱和当量的蛋白已吸附于微生物通道内壁上，随后吸附率缓慢增加，3分钟以后基本达到吸附饱和，此后吸附率无明显增加。

上述所固定的蛋白，在高压力高速流体的工作条件下，所固定的蛋白质有脱吸附现像。(1)clmagr的c端与mgfp的n端直接融合的产物以及(2)clmagr的c端与mgfp的n端通过一段短肽相融合的产物在固定化效果较好，5bar压力10m/s的纯水流作用下，所固定蛋白质的达到50％脱吸率，时间约为150min。而(3)mcherry的n端与dmagr的c端直接融合的产物和(4)mcherry的n端通过一段短肽与dmagr的c端相融合的产物的吸附稳定较差，达到50％脱吸率，所用时间分别为60min和80min。

实施例10：重组融合蛋白在外加磁场微通道铁磁体内表面上的固定化

实施例5所获得的四种重组蛋白，在发酵结束后，以6000-7000高斯的永磁铁吸附目标蛋白，移除菌体和大部分液体后，加纯净水溶解稀释磁吸附的沉淀，配成浓度为100mg/l的重组融合蛋白溶液30ml。然后通过泵把溶液以1ml/min的速度泵入微通道反应器的微通道内，此微通道长度为0.1m，管径为0.1mm，此微通道内表面为铁磁体。此微通道反应器置于外加的永磁铁营造的6000-7000高斯的磁场内，结果表明，实施例5所获得的四种重组蛋白，均可以在3分钟内快速吸附固定化于微通道内壁上。

在重组蛋白未能占满微通道铁磁体内表面时，即微通道铁磁体内表所固定的蛋白质未饱和时，对于clmagr的c端与mgfp的n端直接融合的蛋白以及clmagr的c端与mgfp的n端通过一段短肽相融合的蛋白来讲，95％的重组蛋白可在1分钟内吸附于微生物通道内壁上，2分钟吸附率稳定在90％左右，不再增加。mcherry的n端通过一段短肽与dmagr的c端相融合的产物的吸附效果稍差，2分钟吸附率稳定在75％左右，mcherry的n端与dmagr的c端直接融合的产物，2分钟吸附率稳定在60％左右。

在重组蛋白相对于占满微通道铁磁体内表面过剩的情况下，微通道铁磁体内表面对实施例5所构建的四种融合蛋白的吸附规律相同，1分钟内相当于95％饱和当量的蛋白已吸附于微生物通道内壁上，随后吸附率缓慢增加，2分钟以后基本达到吸附饱和，此后吸附率无明显增加。

上述所固定的蛋白，在高压力高速流体的工作条件下，所固定的蛋白质有脱吸附现像。(1)clmagr的c端与mgfp的n端直接融合的产物以及(2)clmagr的c端与mgfp的n端通过一段短肽相融合的产物在固定化效果较好，5bar压力10m/s的纯水流作用下，所固定蛋白质的达到50％脱吸率，时间约为240min。而(3)mcherry的n端与dmagr的c端直接融合的产物和(4)mcherry的n端通过一段短肽与dmagr的c端相融合的产物的吸附稳定较差，达到50％脱吸率，所用时间分别为90min和120min。

实施例11：在微通道末端出口设置强磁场模块对脱落的融合重组蛋白予以吸附回收

由于在高压高流速流体通过微通道时，对内表面所固定的蛋白具有较强的剪切力，蛋白的脱吸附速度较快，为了避免蛋白质的快速损耗，在微通道末端出口的降压低速区设置由强磁铁组成强磁模块，一般情况下可通过6000-7000高斯的磁场来实现对所脱落重组蛋白的吸附回收。结果表明，在实施例8中加装强磁模块进行回收，对于clmagr的c端与mgfp的n端直接融合的蛋白以及clmagr的c端与mgfp的n端通过一段短肽相融合的蛋白来讲，脱落蛋白中的80％左右可实现回收；对于mcherry的n端通过一段短肽与dmagr的c端相融合的产物来讲，脱落蛋白中的75％左右可实现回收；而对于mcherry的n端与dmagr的c端直接融合的产物，脱落蛋白中的60％左右可实现回收。

实施例12：在微通道中固定化蛋白的清除与再固定化重组蛋白

实施例9的使用完毕后，为了重新使用微通道设备，需要对微通道内壁所残留的固定化的蛋白质进行清除。由于此微通道内表面为非铁磁材质，具体措施是撤去外加磁场，然后通过1bar的压力1m/s的纯水流体，对于不超过0.1m的微通道进行冲洗，10分钟内可完全清除微通道内壁先前所固定化的蛋白质。此时微通道可重复用于蛋白质的固定化，如果仍然使用实施例2的重组蛋白质，其固定的效果仍如实施例9，无明显差异。

实施例13：在微通道中固定化蛋白的冲洗清除与再固化重组蛋白

对于实施例8和去除外加磁场的实施例10，在使用完毕后，为了重新使用微通道设备，需要对微通道内壁所残留的固定化的蛋白质进行清除。由于此微通道内表面为铁磁材质，单纯通过高剪切力，不易快速彻底地清除所固定化的蛋白质，在此种情况下，对于不超过0.1m的微通道进行冲洗，可先在微通道内灌注蛋白酶液，在蛋白酶适宜的作用条件下，在30min内可快速消解微通道内壁的蛋白质，然而通过1bar的压力1m/s的纯水流体，冲洗10分钟可完全清除微通道内壁先前所固定化的蛋白质。此时微通道可重复用于蛋白质的固定化，如果仍然使用实施例2的重组蛋白质，其固定的效果仍如实施例8和实施例10，无明显差异。

实施例14：鸽子磁受体clmagr与转酮酶的重组融合蛋白在微通道中的固定化

鸽子磁受体clmagr与转酮酶tkl1按实施例2中(1)的方式融合，并按实施例5的表达方式，获得clmagr与转酮酶tkl1融合的重组蛋白，按实施例9的方法固定于微通道中。随后分两路泵入羟基丙酮酸锂和乙醇醛溶液，同时添加镁离子和缓冲液，在以1m/s的流速下，流过120m长的微通道反应器，结果检测到l-赤藓酮糖的合成，表明转酮酶tkl1成功固定化于微通道内，并具有良好的酶活与催化反应效率。整个反应过程参考图8。

实施例15：鸽子磁受体clmagr与环氧水解酶在微通道中的固定化

鸽子磁受体clmagr与巨大芽孢杆菌环氧水解酶bmeh按实施例2中(2)的方式融合，并按实施例4的表达方式，获得clmagr与环氧水解酶bmeh融合的重组蛋白，按实施例10的方法固定于微通道中。随后在微通道内使用水/异丙醚/异辛烷＝50/35/15(v/v/v)的两相反应体系，在50gl^-1浓度下对苯基缩水甘油醚pge进行酶促拆分。在最佳拆分条件下，反应生成(s)-pge(99％ee)和(r)型双醇(99.5％ee)时空产率达到68gl^-1d^-1和70gl^-1d^-1。表明转酮酶tkl1成功固定化于微通道内，并具有良好的酶活与催化反应效率。整个反应过程参考图8。

实施例16：鸽子磁受体clmagr与p450氧化酶在微通道中的固定化

鸽子磁受体clmagr与委内瑞拉链霉菌pikc按实施例2中(1)的方式融合，并在变铅青链霉菌中异源表达，获得clmagr与pikc的重组蛋白，按实施例8的方法固定于微通道中，随后加入同样大场杆菌异源表达的铁氧化还原蛋，在补加nadph的条件下，在微通道内泵入聚酮内酯yc-17，可检测到等量获得甲微素和新甲微素的生成。整个反应过程参考图8。

实施例17：鸽子磁受体clmagr与脂肪酶在微通道中的固定化

鸽子磁受体clmagr与假丝酵母来源的脂肪酶按实施例2中(2)的方式融合，并按实施例5的表达方式，获得clmagr与假丝酵母脂肪酶的重组蛋白，按实施例10的方法固定于微通道中。微通道长度为100m，以10ml/min的流速，以300g棕榈酸、200g异辛醇、1200ml石油醚组成的反应系统在40℃条件下反应，酯化率可达96.6％。整个反应过程参考图8。

实施例18：鸽子磁受体clmagr与环糊精葡萄糖基转移酶和葡萄糖淀粉酶双酶在微通道中的固定化

用鸽子磁受体clmagr分别与芽孢杆菌来源的一种环糊精葡萄糖基转移酶cgt和黑曲霉来源葡萄糖淀粉酶aml按实施例2中(1)的方式融合，并分别按实施例4和实施例6的表达方式，分别获得clmagr与cgt的重组蛋白和clmagr与aml的重组蛋白。两者按2:1的比例，按实施例10的方法固定于微通道中。微通道长度为300m，通道管径为0.1mm，以6m/min的流速，以10g/l的维生素c为底物，以30g/lβ-环糊精为糖基供体，在ph5.6，37摄氏度下，可获得11.6g/l左右的2-氧-α-d-吡喃葡萄糖基维生素c。整个反应过程参考图8。

实施例19：鸽子磁受体clmagr与抗体在微通道内的固定化

鸽子磁受体clmagr与mgfp的抗体按实施例2中(1)的方式融合，并按实施例7的表达方式，获得clmagr与mgfp的抗体的重组蛋白，按实施例10的方法固定于微通道中。微通道长度为100m，通道管径为0.1mm，在mgfp流经微通道时，可实现对mgfp的快速捕捉。在1m/s的流速情况下，1min内可实现mgfp的饱和吸附。

实施例20：鸽子磁受体clmagr与羊免疫球蛋白m(igm)兔抗体在微流传感器芯片的微通道内的固定化，用于酶联免疫分析

鸽子磁受体clmagr与羊免疫球蛋白m(igm)兔抗体蛋白按实施例2中(1)的方式融合，并按实施例7的表达方式，获得clmagr与igm兔抗体的重组蛋白，按实施例10的方法固定于微流传感器芯片的微通道中用于定量分析模板底物(羊免疫球蛋白m(igm))。igm缓冲液以10ml/min的流速流经微流传感器芯片微通道，微通道长度为0.1m，通道管径为0.1mm，0.5min内可实现igm的饱和吸附。在微流传感器芯片微通道内吸附igm后，再将辣根过氧化酶(horseradishperoxidase,hrp)标记的二级抗体(羊(igm)兔抗体-辣根过氧化酶)缓冲液以10ml/min的流速流经微流传感器芯片微通道，0.5min内，二级抗体被igm捕获，随后，将荧光底物3-羟基苯丙酸缓冲液以10ml/min的流速流经微流传感器芯片微通道，在微通道内，荧光底物被辣根过氧化酶催化生成萤光团，随后收集流出缓冲液，由荧光检测器来定量分析荧光产物，所测定的萤光信号和测试样品中的底物浓度成正比。本实施例清楚地表明，利用本发明提供的抗体固定化方法，可以方便的应用在微流传感器芯片用于酶联免疫分析，可参考图9。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围，一个有本专业知识的普通技术人员，仍可以根据本专利所传授的技术，在本发明的范围内产生其它的实施例，但是凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

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<110>理星（天津）生物科技有限公司

<120>一种在微通道内固定化蛋白质的方法及应用

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