激发植物产生过敏反应的蛋白质及其编码基因的制作方法

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及激发植物产生过敏反应的蛋白质及其基因。

背景技术：

植物对病原物侵染的抗性表现在非寄主和寄主抗性两个方面。革兰氏阴性植物病原细菌在非寄主植物上产生过敏反应(Hypersensitive response,HR)是由病原菌中的某些激发子决定的。这种HR是一种抗病免疫反应，相应激发产生HR的蛋白质称为harpin类蛋白。目前已从革兰氏阴性植物病原细菌中鉴定的harpin类蛋白种类有HrpZ,HrpN,HrpW,PopA1,Hpa1,HopAK1和HopP1，并且明确植物病原黄单胞菌中HrpW和Hpa1这两个激发非寄主植物产生HR的harpin类蛋白。这些harpin蛋白具有共同的特点：具亲水性、富含甘氨酸、对热稳定、对蛋白酶敏感、酸性蛋白。

Harpin类蛋白具有重要的生物学功能。harpin类蛋白在植物上产生的HR是一种细胞编程死亡形式，在这个过程中伴随着活性氧迸发、水杨酸积累、病程相关蛋白产生和胼胝质增加等，从而增加植物的抗病免疫性。Harpin类蛋白施用于植物上，可促进植物生长、增加作物产量和诱导植物产生抗病性等。植物病原黄单胞菌harpin类蛋白及其编码基因具有植物抗病育种价值和生防价值，而且具有分离和鉴别植物抗病免疫基因的功能，发掘可使植物产生抗病免疫反应的植物病原黄单胞菌中的harpin类蛋白及其编码基因具有重要的科学价值和实践价值。

经对现有技术的文献检索发现，未发现植物病原黄单胞菌中可激发植物产生抗病免疫反应的XopP蛋白以及相应编码基因xopP的有关报道。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服现有技术中的不足而提供激发植物产生过敏反应的蛋白质及其编码基因。本发明XopP蛋白能够使病原黄单胞菌的非寄主植物产生过敏反应。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明涉及的激发植物产生过敏反应的蛋白质，其对应基因在黄单胞菌基因组上具有两个拷贝，氨基酸的同源性达到70％左右，根据其蛋白质序列号先后顺序分别命名为XopP1和XopP2。

本发明是以稻黄单胞菌水稻条斑病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzicola(Xoc)作为研究的模式菌株。

本发明提供的第一种激发植物产生过敏反应的蛋白质，命名为XopP1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共有713个氨基酸。蛋白质XopP1对应的编码基因命名为xopP1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1，序列长度为2142bp。

本发明提供的第二种激发植物产生过敏反应的蛋白质，命名为XopP2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，共有710个氨基酸。蛋白质XopP2对应的编码基因命名为xopP2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3，序列长度为2133bp。

本发明提供的蛋白质XopP1和蛋白质XopP2，其氨基酸序列中半胱氨酸含量均低于1％，蛋白质等电点为8.8，呈弱碱性，富含丙氨酸和亮氨酸等脂肪族氨基酸以及丝氨酸和精氨酸等碱性氨基酸，分子量77.9kD左右，其中丙氨酸和亮氨酸的总含量达25.7％。本发明提供的蛋白质XopP1和蛋白质XopP2都可以使烟草产生过敏反应。过敏反应是植物抗病性被激活的结果。

本发明还提供两种基因的构建方法。

基因xopP1的构建方法，包括以下步骤：

利用序列如SEQ ID NO.5所示的引物Xopp1-F和序列如SEQ ID NO.6所示的引物Xopp1-R，通过PCR扩增，可从水稻条斑病菌Xoc RS105菌株、水稻白叶枯病菌Xoo PXO99^A菌株以及柑橘溃疡病菌Xac 29-1菌株基因组DNA中扩增得到xopP1基因。

基因xopP2的构建方法，包括以下步骤：

利用序列如SEQ ID NO.7所示的引物Xopp2-F和序列如SEQ ID NO.8所示的引物Xopp2-R，通过PCR扩增，可从水稻条斑病菌Xoc RS105菌株、水稻白叶枯病菌Xoo PXO99^A菌株以及柑橘溃疡病菌Xac 29-1菌株基因组DNA中扩增得到xopP2基因。

本发明还提供了两种XopP表达工程菌株。

XopP1表达工程菌株，采用以下方法得到：

将基因xopP1，通过Hind III和XbaⅠ限制性酶切位点克隆到pHB载体上，转化到农杆菌EH105株中，并筛选具有利福平和卡那霉素抗性的阳性转化子，该转化子为XopP1表达工程菌株；其中，基因xopP1核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白质XopP1氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

XopP2表达工程菌株，采用以下方法得到：

将基因xopP2，通过Hind III和XbaⅠ限制性酶切位点克隆到pHB载体上，转化到农杆菌EH105株中，并筛选具有利福平和卡那霉素抗性的阳性转化子，该转化子为XopP2表达工程菌株；其中，基因xopP2核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，蛋白质XopP2氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

以上两种农杆菌工程菌株经过诱导表达，注射三生烟，发现能够使烟草产生过敏反应。

本发明中所涉及的水稻条斑病菌Xoc RS105和水稻白叶枯病菌Xoo PXO99^A菌株已在文献《Wu Xiaomin,Li Yurong,Zou Lifang,and Chen Gongyou.2007.Gene-for-gene relationships between rice and diverse avrBs3/pthA avirulence genes in Xanthomonas oryzae pv.oryzae.Plant Pathology,56(1):26-34》中公开；涉及的柑橘溃疡病菌Xac 29-1菌株已在文献《Zhou,T.,Rou,W.,Song,X.,et al.2015.Molecular study on the carAB operon reveals that carB gene is required for swimming and biofilm formation in the Xanthomanas citri subsp.citri.BMC Microbiology(2015)15:255》中公开。这些菌株均为常用的工程菌株。

本发明中所涉及的农杆菌EH105菌株为公知公用菌株，特征见文献：TAKARA公司产品说明书。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明获得的激发子蛋白XopP1和XopP2具有harpin类蛋白的特性，能激发烟草产生HR反应和系统获得抗病性，这为设计诱导植物产生系统获得抗病性的基因工程药剂以及转基因植物提供了重要的基因资源，具有重要的实践价值。

附图说明

图1、不同来源的xopP1和xopP2基因片段PCR扩增(A)和酶切验证图(B)。

图2、XopP1和XopP2通过农杆菌在烟草上激发过敏反应的最低浓度测试图。

图3、不同植物病原黄单胞菌来源的XopP1和XopP2蛋白在烟草上激发过敏反应图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、植物病原黄单胞菌xopP基因原核表达载体构建

本实施例从水稻条斑病菌Xoc RS105菌株、水稻白叶枯病菌Xoo PXO99^A菌株以及柑橘溃疡病菌Xac 29-1菌株DNA中xopP基因为模版，设计引物xopP1-F/R(SEQ ID NO.3和NO.4)和xopP2-F/R(SEQ ID NO.5和NO.6)，进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94℃/4min+(94℃/30sec+55℃/30sec+72℃/2min)×32循环+72℃/10min。

利用序列如SEQ ID NO.5所示的引物Xopp1-F和序列如SEQ ID NO.6所示的引物Xopp1-R，通过PCR扩增，可从水稻条斑病菌Xoc RS105菌株、水稻白叶枯病菌Xoo PXO99^A菌株以及柑橘溃疡病菌Xac 29-1菌株基因组DNA中扩增得到xopP1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1，序列长度为2142bp。并且得到第一种激发植物产生过敏反应的蛋白质，命名为XopP1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共有713个氨基酸。

利用序列如SEQ ID NO.7所示的引物Xopp2-F和序列如SEQ ID NO.8所示的引物Xopp2-R，通过PCR扩增，可从水稻条斑病菌Xoc RS105菌株、水稻白叶枯病菌Xoo PXO99^A菌株以及柑橘溃疡病菌Xac 29-1菌株基因组DNA中扩增得到xopP2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3，序列长度为2133bp。并且得到第二种激发植物产生过敏反应的蛋白质，命名为XopP2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，共有710个氨基酸。

蛋白质XopP1和蛋白质XopP2，其氨基酸序列中半胱氨酸含量均低于1％，蛋白质等电点为8.8，呈弱碱性，富含丙氨酸和亮氨酸等脂肪族氨基酸以及丝氨酸和精氨酸等碱性氨基酸，分子量77.9kD左右，其中丙氨酸和亮氨酸的总含量达25.7％。本发明提供的蛋白质XopP1和蛋白质XopP2都可以使烟草产生过敏反应。过敏反应是植物抗病性被激活的结果。

不同来源的xopP1和xopP2基因片段PCR扩增见图1(A)，酶切验证图见如1(B)。

最终PCR产物连接在pMD18-T载体，连接产物转化感受态细胞DH5α，筛选具有Amp抗性的重组转化子TxopP1和TxopP2。重组转化子经Hind III和XbaⅠ双酶切回收xopP片段，连接经过相同酶切处理的表达载体pHB载体上，连接产物转化DH5α，获得正确的重组质粒PxopP1和PxopP2，将验证正确的质粒转化到农杆菌EH105菌株中，得到重组菌株EH105(XopP1)和EH105(XopP2)。

所涉及的水稻条斑病菌Xoc RS105和水稻白叶枯病菌Xoo PXO99^A菌株已在文献《Wu Xiaomin,Li Yurong,Zou Lifang,and Chen Gongyou.2007.Gene-for-gene relationships between rice and diverse avrBs3/pthA avirulence genes in Xanthomonas oryzae pv.oryzae.Plant Pathology,56(1):26-34》中公开；涉及的柑橘溃疡病菌Xac29-1菌株已在文献《Zhou,T.,Rou,W.,Song,X.,et al.2015.Molecular study on the carAB operon reveals that carB gene is required for swimming and biofilm formation in the Xanthomanas citri subsp.citri.BMC Microbiology(2015)15:255》中公开。这些菌株均为常用的工程菌株。pMD18-T和pHB载体为公知公用载体，农杆菌EH105菌株为公用公知菌株，特征见文献：TAKARA公司产品说明书。所用内切酶为Hind III和XbaⅠ。

实施例2、XopP通过农杆菌介导的烟草上过敏反应的观察

将待测定的农杆菌菌株EH105(XopP1)和EH105(XopP2)在新鲜的平板上活化，EH105(EV)作为阴性对照，EH105(Hpa1)作为阳性对照，分别转接到的LB的液体培养基中，突变体或接合子要添加相对应的抗生素，28℃振荡培养大约12～16h，菌量浓度达到10⁸CFU/mL；低速离心(<6,000rpm)收集菌体，丢弃上清。超纯水洗涤菌体1～2次，定容至所需浓度，一般为OD₆₀₀＝0.6。选取生长适中烟草从温室移出常温下放置24h，在叶片背面用无菌针头轻轻戳出接种口(注意不要挑破叶片)，无针头的无菌注射器吸取菌液注射，并在叶片上标注好注射范围，过48h左右观察表型、并拍照。本实施例三生烟为HR测定最常用的烟草品种Nicotiana tabacum cv.xanthi，公知公用。

实施例3、XopP激发烟草过敏反应的最小浓度的测定

本实施例XopP通过调整不同的浓度值，分别接种三生烟，确定最小HR激发浓度，同时用相同浓度的Hpa1注射烟草作为阳性对照，带有空质粒的农杆菌作为阴性对照，48h后观察烟草叶片过敏反应。经测定发现XopP激发HR的最小浓度为0.1mg/ml(见图2)。

实施例4、不同来源的植物病原黄单胞菌的XopP蛋白激发烟草过敏反应的测定

本实施例从水稻条斑病菌Xoc RS105菌株、水稻白叶枯病菌Xoo PXO99^A菌株以及柑橘溃疡病菌Xac 29-1菌株等黄单胞菌中克隆出XopP基因，构建在pHB载体上，然后转化进入EH105农杆菌中，调整终浓度OD600＝0.6，用相同浓度的XopP_Xoc菌株为阳性对照，48h后观察烟草叶片过敏反应。发现来自水稻白叶枯病菌Xoo PXO99^A菌株以及柑橘溃疡病菌Xac 29-1菌株的XopP蛋白均能够激发烟草产生过敏反应(见图3)。

关于RS105：陈功友、潘小玫、王金生，水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)化学诱变hrp基因突变体及相关性状的研究，植物病理学报，2001,31(3):199～207；

关于基因重组分子操作：Sambrook J,Russell D.W.,Molelcular cloning,A Laboratory Manual(3^rd ed),2001,Spring Harbor Laboratory Press；

关于克隆harpin相关基因的方法：Wen W.G,Wang J.S,Defense response in plants induced by Harpin_xoo,an elicitor of Hypersensitive response from Xanthomonas oryzae pv.oryzae,2003,Journal of Agricultural Biotechnology；

关于克隆载体pMD18-T和pHB：TAKARA载体说明书。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

<110>上海交通大学

<120>激发植物产生过敏反应的蛋白质及其编码基因

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2142

<212> DNA

<213> 水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2142)

<400> 1

gtgcctaaaa ttgaatcgac caagcaggcc ccccctgatc ccgcgcaatt ggttcaaact 60

gcaccgacac catcgggctc ggcatcagtg gcaagcacgt ctgccgacag tgcggtgccc 120

tcagcgcaac tcggcgggct ttccatcagg ccgcggctgt tgggccgagc ctccacagcc 180

aatccctcag cggcatcgtc cagcaacgca aagaacgtca gggcggcgct ctttgccgcg 240

cagtcagttt cgcaagggcc agatcctgcc gaagtattgg tcaaggcctc atccaggctg 300

aaacgcttca acgacttggc acaaaaagta gtgccgacag aaccgtcgga tatcaaagcc 360

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aatttcctgg tgccgcagtt cgcaatcgcc gcatccctgc acttcggcgc atgccagaag 540

atgatcgatc agaaaatggc caccgaattg ggccatgtgc ccacccaaag ggtcgagatg 600

gtgacgttgt ccgttgacgc cacccgtctg cagcaaccgg aatcatggct tgcgttacgc 660

gctcatattc tgaattccct tgcagcgatg gaggaggttt gccagcgcat caggtcgccg 720

atgacgggtc aggggccgcg tgactcgctc aaggccaatc tccccgtcgt cagggcgatg 780

atcgcatcgt gccatgaacg catgcagacc gtccgcggaa tgctcgtcga aatatattca 840

aggagactta gcgatcaggc caccgattgc ggcctgctcc aggtgcttga cagactgagg 900

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atccaggtcc atatcgaacg tctgtcctca accgagcatt cgctcacacc ggaggcgctg 1020

gccctgtgca aaaggctact cgtcgaatac gccgaggtgc gcggccgagc ggggatgcag 1080

ctgtgtgtag atgccgccgc gctcatcgaa caaggtgagc atgccagaga tcatctatgg 1140

ccaacgatgc tccatcttgc acaggcactt gccgaccaac gtcaggcaat tcttgacatg 1200

tgtgagttcg ccgtccagga cagacagctg attggcacgg cggcggcttc gcccgagcaa 1260

gcaccggcat cgataacacc gagcgtgccg acaacgacag caggcaaatc gagcaggtca 1320

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attgacgagc gcaacgcagc gcaaaagcag gccgacgaga tactgaaaag cacgcgtctg 1440

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gccgccgtcc acctgaagac ggccagggag gtcaacctgg gcccacgctg ggaagagatg 2040

atgcgcgccc tcggaaacac cgaggccaag gtgcaccggg caaccatcgg ctcgaagctg 2100

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<210>2

<211>713

<212>PRT

<213> 水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）

<400>2

Met Pro Lys Ile Glu Ser Thr Lys Gln Ala Pro Pro Asp Pro Ala

5 10 15

Gln Leu Val Gln Thr Ala Pro Thr Pro Ser Gly Ser Ala Ser Val

20 25 30

Ala Ser Thr Ser Ala Asp Ser Ala Val Pro Ser Ala Gln Leu Gly

35 40 45

Gly Leu Ser Ile Arg Pro Arg Leu Leu Gly Arg Ala Ser Thr Ala

50 55 60

Asn Pro Ser Ala Ala Ser Ser Ser Asn Ala Lys Asn Val Arg Ala

65 70 75

Ala Leu Phe Ala Ala Gln Ser Val Ser Gln Gly Pro Asp Pro Ala

80 85 90

Glu Val Leu Val Lys Ala Ser Ser Arg Leu Lys Arg Phe Asn Asp

95 100 105

Leu Ala Gln Lys Val Val Pro Thr Glu Pro Ser Asp Ile Lys Ala

110 115 120

Leu Glu Ala Arg Leu Arg Ser Gly Thr Ser Ala Leu Glu Ser Ala

125 130 135

Arg Gln Ala Phe Gln Ala Leu Ala Glu Leu Asn Ile Lys Lys Arg

140 145 150

Ile Pro Val Asp Asn Ile Glu Glu His Glu Asn Phe Leu Val Pro

155 160 165

Gln Phe Ala Ile Ala Ala Ser Leu His Phe Gly Ala Cys Gln Lys

170 175 180

Met Ile Asp Gln Lys Met Ala Thr Glu Leu Gly His Val Pro Thr

185 190 195

Gln Arg Val Glu Met Val Thr Leu Ser Val Asp Ala Thr Arg Leu

200 205 210

Gln Gln Pro Glu Ser Trp Leu Ala Leu Arg Ala His Ile Leu Asn

215 220 225

Ser Leu Ala Ala Met Glu Glu Val Cys Gln Arg Ile Arg Ser Pro

230 235 240

Met Thr Gly Gln Gly Pro Arg Asp Ser Leu Lys Ala Asn Leu Pro

245 250 255

Val Val Arg Ala Met Ile Ala Ser Cys His Glu Arg Met Gln Thr

260 265 270

Val Arg Gly Met Leu Val Glu Ile Tyr Ser Arg Arg Leu Ser Asp

275 280 285

Gln Ala Thr Asp Cys Gly Leu Leu Gln Val Leu Asp Arg Leu Arg

290 295 300

Glu Leu Glu Glu Ile Asp Ser Leu Ser His Ala Glu Val Ser Glu

305 310 315

Ala Leu Asn His Val Ile Gln Val His Ile Glu Arg Leu Ser Ser

320 325 330

Thr Glu His Ser Leu Thr Pro Glu Ala Leu Ala Leu Cys Lys Arg

335 340 345

Leu Leu Val Glu Tyr Ala Glu Val Arg Gly Arg Ala Gly Met Gln

350 355 360

Leu Cys Val Asp Ala Ala Ala Leu Ile Glu Gln Gly Glu His Ala

365 370 375

Arg Asp His Leu Trp Pro Thr Met Leu His Leu Ala Gln Ala Leu

380 385 390

Ala Asp Gln Arg Gln Ala Ile Leu Asp Met Cys Glu Phe Ala Val

395 400 405

Gln Asp Arg Gln Leu Ile Gly Thr Ala Ala Ala Ser Pro Glu Gln

410 415 420

Ala Pro Ala Ser Ile Thr Pro Ser Val Pro Thr Thr Thr Ala Gly

425 430 435

Lys Ser Ser Arg Ser Arg Lys Ala Arg Met Arg Thr Ser Asp Ala

440 445 450

Ser Ser Ser Ala Ala Pro Ala Gln Arg Val Ile Asp Glu Arg Asn

455 460 465

Ala Ala Gln Lys Gln Ala Asp Glu Ile Leu Lys Ser Thr Arg Leu

470 475 480

Glu Ser Leu Pro Val Ala Glu Leu Gly Gly Asp Phe Ile Ala Leu

485 490 495

Ala Lys Arg Leu Gly Lys Asp Thr Thr Asp Ile Glu Arg Leu Ile

500 505 510

Gly Asp Ser Arg Arg Asp Ala Ala Thr Ala Phe Asp Phe Ala Arg

515 520 525

Thr Ser Met Gln Asp Trp Phe Gly Ser Ser Glu Arg Leu Leu Gln

530 535 540

Leu Lys Ser Lys Leu Arg Ala Gly Asp Pro Arg Ile Ala Gln Leu

545 550 555

Asp Thr Arg Leu Arg Leu Leu Gln Arg Ile Glu Gln Glu Phe Glu

560 565 570

Arg Arg Glu Ala Asp Ala Leu Lys Ile Asp Pro Gln Pro Arg Ala

575 580 585

Pro His Leu Gln Arg Leu Leu Ala Met His Ala Leu Ala Arg Val

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Thr Ala Pro Asn Arg Leu Pro Ser Glu Asp Asp Arg Gly Gly Arg

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Gly Arg Leu Phe Glu Val Arg Ile Asp His Thr Pro Gln Ser Asn

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Gly Asp Ile Pro Ala Pro Trp Phe Val His Val His Thr Glu Lys

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Pro Val Thr Pro Thr Gly Leu Arg Ala Leu His Tyr Lys Asp Leu

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Ala Ala Val His Leu Lys Thr Ala Arg Glu Val Asn Leu Gly Pro

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Arg Trp Glu Glu Met Met Arg Ala Leu Gly Asn Thr Glu Ala Lys

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710

<210> 3

<211> 2133

<212> DNA

<213> 水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）

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<222> (1)..(2133)

<400>3

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cgtgcgccgc atctgcagcg cctgttggcg atgcatgcac tggcacgcgt cacggcgccg 1800

aaccgccttc cctcggagga cgaccgtggc ggccgtggca ggctatttga agtgcgtatc 1860

gaccacacgc cgcagtcaaa tggcgacatt cccgcgccct ggttcgtcca cgtacatacc 1920

gaaaaaccgg taacgcccac cgggctgcgc gcgctccact acaaggactt ggccgccgtc 1980

cacctgaaga cggccaggga ggtcaacctg ggcccacgct gggaagagat gatgcgcgcc 2040

ctcggaaaca ccgaggccaa ggtgcaccgg gcaaccatcg gctcgaagct gctgggccag 2100

ctttgggcgg ctggcgctgg cgggcaacaa taa 2133

<210>4

<211>710

<212>PRT

<213> 水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）

<400>4

Met Pro Arg Phe Arg Ala Thr Asn Gln Thr Pro Val Asp Pro Thr

5 10 15

Ser Ser Thr Gln Pro Ala Ala Ala Pro Gln Asp Ala Gly Ala Ser

20 25 30

Ala Ser Val Pro Thr Ser Met Gly Pro Pro Ser Ala Gln Leu Ser

35 40 45

Gly Leu Ala Ile Arg Ala Ser Ser Glu Ala Arg Ala Ser Arg Ala

50 55 60

Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ser Ala Asn Val Arg Ala Met Leu Phe

65 70 75

Thr Pro Ala Ser Val Ser Gly Gly Pro Asp Pro Phe Glu Val Leu

80 85 90

Asn Arg Ala Ser Ala Arg Leu Gln Leu Phe Asn His Leu Val Thr

95 100 105

Asn Val Ala Pro Arg Asp Ser Gly Asp Ala Lys Ser Leu Glu Ala

110 115 120

Arg Leu Arg Ser Gly Ala Ser Ala Ile Glu Phe Ala Arg Gln Gly

125 130 135

Leu Gln Ala Leu Ser Glu Leu Lys Ile Gln Arg Arg Met Ser Ser

140 145 150

Ala Asp Ile Glu Ala His Glu Asn Arg Leu Val Ser Ser Leu Ala

155 160 165

Gln Ala Ala Ala Met Asn Tyr Val Ser Cys Glu Arg Met Ile Asp

170 175 180

Gln Lys Leu Ala Gln Gly Leu Gly Ser Ala Leu Thr Glu Gly Ser

185 190 195

Asp Phe Ala Gln Leu Asp Ile Gln Ala Ile Arg Leu Gln Gln Pro

200 205 210

Glu Ser Trp His Ala Leu Arg Ala His Leu Leu Asp Ala Ile Ala

215 220 225

Ala Leu Glu Glu Val Phe Arg Arg Ile Lys Ser Pro Met Thr Thr

230 235 240

Arg Thr Pro Cys Asp Ser Leu Lys Ala Gln Leu Pro Ile Val Arg

245 250 255

Met Thr Met Glu Ser Cys His Thr Arg Met Gln Thr Val Arg Gly

260 265 270

Val Leu Tyr Glu Ile Tyr Ser Val Arg Leu Ser Asp Gln Val Ser

275 280 285

Ser Cys Arg Met Pro Leu Val Leu Asp Arg Leu Arg Glu Leu Glu

290 295 300

Glu Val Asp Lys Cys Met Asp Ala Lys Val Gly Lys Ala Val Thr

305 310 315

Glu Leu Ala Lys Met His Ile Glu Arg Phe Leu Ser Thr Glu His

320 325 330

Ser Leu Thr Pro Glu Met Leu Ala Met His Lys Asn Val Leu Val

335 340 345

Glu Tyr Ala Glu Met Arg Gly Arg Ala Ala Thr Gln Leu Cys Met

350 355 360

Asp Ala Ala Ala Leu Ile Glu Glu Gly Gly His Ser Arg Asp His

365 370 375

Ile Trp Pro Ala Met Leu Asp Leu Ala Gln Ala Leu Ala Asp Gln

380 385 390

Arg Gln Ala Ile Leu Asp Met Cys Glu Phe Ala Val Gln Asp Arg

395 400 405

Gln Leu Ile Gly Ala Ala Ala Ala Ser Pro Glu Gln Ala Pro Ala

410 415 420

Ser Ile Thr Pro Ser Val Pro Thr Thr Thr Ala Gly Lys Ser Ser

425 430 435

Arg Ser Arg Lys Ala Arg Met Arg Thr Ser Asp Ala Ser Ser Ser

440 445 450

Ala Ala Pro Ala Gln Arg Val Ile Asp Glu Arg Asn Ala Ala Gln

455 460 465

Lys Gln Ala Asp Glu Ile Leu Lys Ser Thr Arg Leu Glu Ser Leu

470 475 480

Pro Val Ala Glu Leu Gly Gly Asp Phe Ile Ala Leu Ala Lys Arg

485 490 495

Leu Gly Lys Asp Thr Thr Asp Ile Glu Arg Leu Ile Gly Asp Ser

500 505 510

Arg Arg Asp Ala Ala Thr Ala Phe Asp Phe Ala Arg Thr Ser Met

515 520 525

Gln Asp Trp Phe Gly Ser Ser Glu Arg Leu Leu Gln Leu Lys Ser

530 535 540

Lys Leu Arg Ala Gly Asp Pro Arg Ile Ala Gln Leu Asp Thr Arg

545 550 555

Leu Arg Leu Leu Gln Arg Ile Glu Gln Glu Phe Glu Arg Arg Glu

560 565 570

Ala Asp Ala Leu Lys Ile Asp Pro Gln Pro Arg Ala Pro His Leu

575 580 585

Gln Arg Leu Leu Ala Met His Ala Leu Ala Arg Val Thr Ala Pro

590 595 600

Asn Arg Leu Pro Ser Glu Asp Asp Arg Gly Gly Arg Gly Arg Leu

605 610 615

Phe Glu Val Arg Ile Asp His Thr Pro Gln Ser Asn Gly Asp Ile

620 625 630

Pro Ala Pro Trp Phe Val His Val His Thr Glu Lys Pro Val Thr

635 640 645

Pro Thr Gly Leu Arg Ala Leu His Tyr Lys Asp Leu Ala Ala Val

650 655 660

His Leu Lys Thr Ala Arg Glu Val Asn Leu Gly Pro Arg Trp Glu

665 670 675

Glu Met Met Arg Ala Leu Gly Asn Thr Glu Ala Lys Val His Arg

680 685 690

Ala Thr Ile Gly Ser Lys Leu Leu Gly Gln Leu Trp Ala Ala Gly

695 700 705

Ala Gly Gly Gln Gln

710

<210>5

<211>32

<212>DNA

<213> 人工序列

<400>5

cccaagcttg tgcctaaaat tgaatcgacc aa 32

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gctctagatt atcgctgccc accagcgcca gc 32

<210>7

<211>32

<212>DNA

<213> 人工序列

<400>7

cccaagcttg tgccgagatt tcgagcgacc aa 32

<210>8

<211>32

<212>DNA

<213> 人工序列

<400>8

gctctagatt attgttgccc gccagcgcca gc 32