本发明涉及单核苷酸多态性(snp)标志物、试剂盒及应用，特别是涉及与抗结核药物引起的药物肝毒性反应相关的尚未公开的snp标志物及其组合、试剂盒以及它们的应用，属于生物基因工程领域。
背景技术：
：结核病可谓是传染病中的一个最大灾难——全世界每年会有上百万人因该病致死，是当前导致发展中国家居民(尤其是儿童)死亡的主要疾病之一。药物化疗是当前治疗结核病的主要手段，常用的药物为异烟肼(isoniazid，inh)、利福平(rifampicin，rfp)、吡嗪酰胺(pyrazinamide，pza)和乙胺丁醇(ethambutol，emb)。虽然药物化疗对于结核病的临床治疗效果较好，但是在治疗过程中出现的药物不良反应(adversedrugreactions，adr)，影响了抗结核治疗效果和患者健康。其中，抗结核药物肝毒性反应(anti-tuberculosisdruginducedhepatotoxicity，atdh)是最严重的常见抗结核adr。既往研究认为年龄、体重、性别、合并用药、营养状况等因素会影响atdh的发病。随着遗传领域中药物基因组学的发展，单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)在揭示个体不同的表型性状、以及对于环境暴露、药物治疗等因素的不同反应的研究中受到人们的重视，有关snp与atdh个体差异的关系的研究越来越深入，且多聚焦于n-乙酰转移酶2基因(n-acetyltrangerase2，nat2)。nat2是治疗结核病的常用药物异烟肼(isoniazid，inh)代谢过程中的主要代谢酶。遗传学研究显示，nat2的乙酰化代谢型(快、中、慢乙酰化代谢型)主要由其编码区功能多态性位点及其单体型(快、中、慢乙酰化代谢型)决定。功能学实验证明，部分编码区snp突变等位基因相对其野生型等位基因所产生的氨基酸改变，减低了nat2的表达量和/或其乙酰化酶活性。目前已经公开的相关研究有：“n-乙酰基转移酶2及谷胱甘肽s转移酶m1基因多态性与抗结核药物性肝损伤的关系研究”，安慧茹等，《中国防痨杂志》，2014年1月，第36卷第1期，第14－20页)公开了nat2的rs1805158、rs1801280、rs72554617、rs1799930、rs1799931多态性位点与抗结核药致肝损伤相关，统计的患者为接受异烟肼+利福平+乙胺丁醇+吡嗪酰胺联合治疗后造成肝损伤的患者，所使用的方法为对每个snp位点与肝损伤的相关性进行单独分析，没有公开将某些snp组成一组时与药物肝损伤的关联是否更高；wo2015109608a1公开了nat2的rs1041983、rs1495741snp及其组合与抗结核药异烟肼、利福平、吡嗪酰胺中任一种或其组合造成的肝损伤相关，并公开了一些包含nat2rs1041983或rs1495741以及xo基因rs2295475或rs1884752snp的组合与药物肝损伤的相关性；cn106119363a公开了n-乙酰转移酶2基因(n-acetyltrangerase2，nat2)的7个snp位点(rs1801279、rs1041983、rs1801280、rs1799929、rs1799930、rs1208和rs1799931)的组合可以用于抗结核药物肝损伤易感基因型检测。技术实现要素：本发明的目的在于提供尚未公开的、与抗结核药物肝毒性反应相关的snp标志物，以更加全面、准确地分子遗传标记抗结核药物引起的药物肝毒性反应，从而进行分子标记辅助选择和用药预测，实现个体化用药，减少药物不良反应。本发明的目的还在于提供上述snp标志物在抗结核药物肝毒性反应方面非诊断的应用。本发明还提供了一种评估抗结核药物肝毒性反应风险的试剂盒，用于通过准确检测上述与抗结核药物肝毒性反应相关的snp标志物，以更加全面、准确评估抗结核药物肝毒性反应风险。为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：本发明提供了与抗结核药物肝毒性反应相关的snp标志物，所述的snp标志物是包括kcne3基因snp位点和nat2基因snp位点的组合，所述的kcne3基因snp位点是rs12272502，所述nat2基因snp位点是rs4921914、rs10103029和rs7816847中一个或多个。进一步地，上述snp标志物组合与blnk基因snp位点rs2290714、ppp2r2b基因snp位点rs1031915、flt3基因snp位点rs9319408、vav2基因snp位点rs679106、xo基因snp位点rs1429372和il6基因snp位点rs2069852中一个或多个相组合，可以实现更准确地标记抗结核药物引起药物肝毒性反应的目的。更进一步地，以上所有情况还可以与其它的nat2基因的与抗结核药物肝毒性反应相关的snp位点及其组合(如：nat2基因的snp位点rs1041983或rs1495741，或者两者的组合)相组合，可以更准确地标记抗结核药物引起药物肝毒性反应。上述snp标志物的特异性扩增引物的引物序列可以分别为：rs12272502的引物序列为seqidno.1和seqidno.2；rs2290714的引物序列为seqidno.4和seqidno.5；rs1031915的引物序列为seqidno.7和seqidno.8；rs9319408的引物序列为seqidno.10和seqidno.11；rs679106的引物序列为seqidno.13和seqidno.14；rs1429372的引物序列为seqidno.16和seqidno.17；rs2069852的引物序列为seqidno.19和seqidno.20；rs4921914的引物序列为seqidno.22和seqidno.23；rs10103029的引物序列为seqidno.25和seqidno.26；rs7816847的引物序列为seqidno.28和seqidno.29；rs1041983的引物序列为seqidno.31和seqidno.32；rs1495741的引物序列为seqidno.34和seqidno.35。进一步地，对应于上述snp标志物的特异性扩增引物，其特异性延伸引物的引物序列可以分别为：rs12272502的引物序列为seqidno.3；rs2290714的引物序列为seqidno.6；rs1031915的引物序列为seqidno.9；rs9319408的引物序列为seqidno.12；rs679106的引物序列为seqidno.15；rs1429372的引物序列为seqidno.18；rs2069852的引物序列为seqidno.21；rs4921914的引物序列为seqidno.24；rs10103029的引物序列为seqidno.27；rs7816847的引物序列为seqidno.30；rs1041983的引物序列为seqidno.33；rs1495741的引物序列为seqidno.36。本发明还提供上述snp标志物在抗结核药物肝毒性反应方面非诊断的应用，如应用于制备评估抗结核药物肝毒性反应风险的试剂盒。本发明还提供了一种评估抗结核药物肝毒性反应风险的试剂盒，用于检测与抗结核药物肝毒性反应相关的至少如下的snp标志物：所述的snp标志物是包括kcne3基因snp位点和nat2基因snp位点的组合，所述的kcne3基因snp位点是rs12272502，所述nat2基因snp位点是rs4921914、rs10103029和rs7816847中一个或多个。可选地，该试剂盒含有如下特异性扩增引物序列：所述的snp位点rs12272502的引物序列为seqidno.1和seqidno.2；所述的snp位点s4921914的引物序列为seqidno.22和seqidno.23；所述的snp位点rs10103029的引物序列为seqidno.25和seqidno.26；所述的snp位点rs7816847的引物序列为seqidno.28和seqidno.29。更进一步地，与上述试剂盒所含特异性扩增引物序列相对应的特异性延伸引物序列为：所述的snp位点rs12272502的引物序列为seqidno.3；所述的snp位点rs4921914的引物序列为seqidno.24；所述的snp位点rs10103029的引物序列为seqidno.27；所述的snp位点rs7816847的引物序列为seqidno.30。进一步地，该评估抗结核药物肝毒性反应风险的试剂盒还用于检测与抗结核药物肝毒性反应相关的blnk基因snp位点rs2290714、ppp2r2b基因snp位点rs1031915、flt3基因snp位点rs9319408、vav2基因snp位点rs679106、xo基因snp位点rs1429372和il6基因snp位点rs2069852中的一个或多个。相应于此检测，可选地，该试剂盒含有如下特异性扩增引物序列：所述的snp位点rs2290714的引物序列为seqidno.4和seqidno.5；所述的snp位点rs1031915的引物序列为seqidno.7和seqidno.8；所述的snp位点rs9319408的引物序列为seqidno.10和seqidno.11；所述的snp位点rs679106的引物序列为seqidno.13和seqidno.14；所述的snp位点rs1429372的引物序列为seqidno.16和seqidno.17；所述的snp位点rs2069852的引物序列为seqidno.19和seqidno.20。相应于此检测，进一步地，与上述试剂盒所含特异性扩增引物序列相对应的特异性延伸引物序列可以为：所述的snp位点rs2290714的引物序列为seqidno.6；所述的snp位点rs1031915的引物序列为seqidno.9；所述的snp位点rs9319408的引物序列为seqidno.12；所述的snp位点rs679106的引物序列为seqidno.15；所述的snp位点rs1429372的引物序列为seqidno.18；所述的snp位点rs2069852的引物序列为seqidno.21。更进一步地，该评估抗结核药物肝毒性反应风险的试剂盒还用于检测与抗结核药物肝毒性反应相关的nat2基因位点rs1495741和/或rs1041983。相应于此检测，可选地，该试剂盒含有如下特异性扩增引物序列：所述的snp位点rs1041983的引物序列为seqidno.31和seqidno.32；所述的snp位点rs1495741的引物序列为seqidno.34和seqidno.35。相应于此检测，进一步地，与上述试剂盒所含特异性扩增引物序列相对应的特异性延伸引物序列可以为：所述的snp位点rs1041983的引物序列为seqidno.33；所述的snp位点rs1495741的引物序列为seqidno.36。可选地，该试剂盒还可以包括相应pcr技术所需的常用试剂，如dntps，mgcl2，双蒸水，taq酶等，这些常用试剂是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。综上所述，本发明的技术方案提供了尚未被公开的与抗结核药物肝毒性反应相关的基于kcne3和nat2基因snp标志物组合，从而更加全面、准确地分子遗传标记抗结核药物引起的药物肝毒性反应；此外，将上述未公开的snp标志物组合应用于评估抗结核药物肝毒性反应风险的试剂盒中，从而更加全面、准确地进行检测，以及分子标记辅助选择和用药预测，实现个体化用药，减少药物不良反应。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。实施例1研究对象说明：本发明的研究对象是：2005-2014年在首都医科大学附属北京儿童医院住院治疗、年龄在0-16岁间的中国汉族结核病患儿(均是在患儿和家长知情同意的前提下)；并且，他们完全满足以下3个标准：①临床诊断为结核病；②以标准化疗剂量及方案接受抗结核化疗时间超过2周；③基础肝肾功能正常。其中，结核病诊断标准是：根据美国胸科协会制定的《成人和儿童结核病诊断和分级标准》和中华医学会儿科学分会呼吸学组制定的《儿童肺结核的临床诊断标准和治疗方案(试行)》进行结核病诊断。结核病临床诊断标准具体为：①活动性结核病接触史；②ppd试验阳性；③抗结核治疗有效；④排除其他疾病；满足①至④中的任意2项，并具有典型临床症状和影像学证据，临床诊断为结核病。atdh判断标准是：满足以下4项中任意1项即可诊断为atdh：①血清alt含量>(2×uln)；alt代表丙氨酸氨基转移酶；血清alt相应的uln＝40iu/l；②血清dbil含量>(2×uln)；dbil代表直接胆红素；血清dbil相应的uln＝6.8μmol/l；③血清ast含量、血清alp含量和血清tbil含量均>(1×uln)，且其中n1项>(2×uln)，n1≥1；ast代表天门冬氨酸氨基转移酶，alp代表碱性磷酸酶，tbil代表总胆红素；血清ast相应的uln＝40iu/l，血清alp相应的uln＝220iu/l，血清tbil相应的uln＝19.0μmol/l；④满足标准a和标准b：标准a：血清alt含量、血清dbil含量、血清ast含量、血清alp含量和血清tbil含量，上述5项中的n2项>(1×uln)，n2≥1；标准b：具有如下肝毒性疑似症状之一：皮肤巩膜黄染、肝区不适、恶心、呕吐、厌食、发热、皮疹、瘙痒等肝毒性疑似症状。atdh入组标准：①atdh发生在抗结核化疗开始后；②排除外病毒感染、新生儿黄疸、肝肾基础疾病及其他疾病引起的atdh；③结核药减量或停用后，atdh症状减轻；④排除其他药物致atdh的可能性。满足①至④四项者即可诊断为atdh。对照组入组标准：抗结核化疗后，肝功能仍正常者。本实施例1中，使用全基因组关联分析(gemone-wideassociationstudy，gwas)对大样本数据进行了筛选。其中，基于上述研究对象标准，将385例结核病患儿分成atdh组和非atdh对照组，atdh组77例，对照组308例。1、关于gwas全基因组芯片：gwas全基因组芯片数据来自于前期的中国汉族人群结核病易感研究，通过质控分析，最终得到了691388个snp位点的分型结果。芯片执行情况如下：1)gwas芯片类型：illumina公司humanomnizhonghua-8beadchip；2)gwas芯片的数据分析方法：plink软件。芯片共得到900，015个snp位点的分型结果，经过检出率、hardy-weinberger平衡(hwe)、样本亲缘关系以及主成分分析等质控，最终得到691388个snp位点用于后续分析。(1)检出率标准设定和hwe分析：snp分型数据需符合以下标准，才能纳入后续分析：样品检出率＞99％、snp位点检出率＞95％、对照组hwe的p值＞0.0001和最小等位基因频率＞0.01。除此之外，采用genomestudiov3.0(illumina)软件进行snp位点散点图的筛查，舍弃聚类不良的snp位点。(2)样本亲缘关系分析：为明确个体间是否有血缘关系，采用血缘同源(ibd)等位基因的概率分布进行分析。在分析中发现，病例组和对照组分别有一对样本ibd的pi-hat＞0.05，因此，对具有血缘关系的病例和对照及其相对应的对照和病例样本给予删除。另外，我们随机选择15个样本进行重现性的检测，其基因分型吻合率为99.99％，证明：芯片检测结果稳定，snp位点基因分型数据可靠。(3)主成分分析：整合千人基因组计划中非洲人(yri)、欧洲人(ceu)，日本人(jpt)、中国北方人(chb)和中国南方人(chs)的数据以及我们芯片数据，并对整合数据进行主成分分析，确保芯片检测的病例和对照组样本具有中国人群的遗传特征，遗传背景一致。(4)对于芯片的数据进行人群分层分析：为研究样本的人群分层情况，进行膨胀系数(λgc)的分析。λgc为1.017，说明我们很好地削减了人群分层对于结果的影响。2、使用上述gwas全基因组芯片对大样本进行数据分析：对于芯片的数据进行相关性分析：对上述385例atdh病例及对照样本的snp位点分型结果进行了数据调取。采用plink软件对385例atdh和非atdh对照儿童的691388个snp位点进行基因型比较分析，采用年龄性别对数据进行矫正，并结合离散关联决策算法对数据进行验证，得到snp位点与atdh易感相关性的结果。选取的atdh关联snp位点or值和p值如表1所示：表1：atdh关联snp位点or值和p值snp位点基因or值(95％ci)p值rs6696544camta12.412(1.612-3.611)1.87e-05rs12272502kcne32.228(1.494-3.324)8.63e-05rs2290714blnk2.281(1.535-3.391)4.54e-05rs1031915ppp2r2b2.197(1.479-3.263)9.7e-05rs9319408flt32.832(1.455-5.51)2.18e-03rs679106vav22.938(1.779-4.852)2.56e-05rs1429372xo1.821(1.231-2.693)2.68e-03rs2069852il61.540(1.053-2.254)2.62e-02rs4921914nat23.544(2.289-5.489)1.42e-08rs10103029nat23.589(2.296-5.611)2.09e-08rs7816847nat23.408(2.188-5.307)5.82e-08rs1041983nat23.434(2.236-5.273)1.73e-08rs1495741nat23.522(2.277-5.446)1.52e-08从表1中可以看出，检测结果共涉及9个基因的13个snp位点。其中，camta1基因snp位点rs6696544、kcne3基因snp位点rs12272502、blnk基因snp位点rs2290714、ppp2r2b基因snp位点rs1031915、flt3基因snp位点rs9319408、vav2基因snp位点rs679106、xo基因snp位点rs1429372、il6基因snp位点rs2069852、以及nat2基因snp位点rs4921914、rs10103029和rs7816847，均为首次发现与抗结核药物肝毒性反应相关的snp位点。实施例2：研究对象说明详见实施例1。本实施例2中，针对实施例1中所获得的13个snp位点，另外选取582例样本(与上述实施例1中的385例无重合)(atdh组122例，非atdh对照组460例)，进行质谱验证。1、实验步骤：1)引物设计及合成：根据snp位点序列信息，使用引物设计软件assaydesign3.1设计pcr反应和单碱基扩展引物，并交由生物公司合成。各snp位点对应的引物见表2。其中，forwardprimer为上游引物，reverseprimer为下游引物，extendedprimer为延伸引物。表2：实施例1中所获得的13个snp位点所对应的引物：2)dna提取：使用成品化试剂盒，提取血样、组织、细胞、唾液中的dna。使用nanodrop2000仪器进行od值检测，1.25％琼脂糖凝胶电泳检测，dna质检合格，转移至96孔板，-20℃储存备用。3)系统基因分型步骤：①pcr扩增反应：聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)用于扩增位于两端已知序列之间的dna区域。每个pcr循环，反应混合体系都在模板变性、引物退火和引物延伸三种不同温度下依序温育。该过程可使用一种可编程序的温度热循环仪而达到自动化。②产物碱性磷酸酶处理：在pcr反应结束后，将pcr产物用sap(shrimpalkalinephosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dntps。③单碱基延伸反应：在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9μl。④树脂纯化：⑤芯片点样：采用massarraynanodispenserrs1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至spectrochipbioarray上。⑥质谱检测及数据输出：将点样后的spectrochip芯片使用maldi-tof质谱仪分析，检测结果使用typer4.0软件获取原始数据及基因分型图，检查数据文件的完整性和正确性，将结果保存并进行分析。以上①至⑥均为本领域质谱检测的常规方法，这里不再冗述。2、多位点联合风险评估：采用以or值作为权重的遗传风险评分(oddsratioweightedgeneticriskscore，or-grs)方法对以上582例样本进行多位点联合风险评估计算。该方法大致可以分为两步：a)所有snp位点的or值*突变基因数量，然后求和，即：公式中，g表示一组遗传易感位点风险等位基因数的集合向量(gi表示第i个遗传易感位点的风险等位基因的数量)；b)对所有样本的求和数值计算敏感性和特异性，绘制roc曲线，并计算曲线下面积，即：auc值。有关or-grs的原理和评分方法具体参见文献“遗传风险评分的原理与方法”(王铖，戴俊程，孙义民，谢兰，潘良斌，胡志斌，沈洪兵，2015，[j].中华流行病学杂志，36(10)：1062-1064)。相关snp位点组合的auc值的结果如下：1)根据上述方法计算出来的kcne3基因snp位点rs12272502与nat2基因snp位点rs4921914、rs10103029和rs7816847中任意至少一个组合的auc值，以及该组合与其它6个基因snp位点中至少一个相组合的auc值，如表3所示。其中，所述的其它6个基因snp位点分别为blnk基因位点(rs2290714)、ppp2r2b基因位点(rs1031915)、flt3基因位点(rs9319408)、vav2基因位点(rs679106)、xo基因位点(rs1429372)和il6基因位点(rs2069852)。表3中的方案分别为：方案1：kcne3基因snp位点rs12272502与nat2基因snp位点rs4921914、rs10103029和rs7816847中任意至少一个组合；方案2：上述方案1中kcne3基因snp位点与nat2基因snp位点的组合与其他6个snp位点中的任意一个位点的组合；方案3：上述方案1中kcne3基因snp位点与nat2基因snp位点的组合与其他6个snp位点中的任意二个位点的组合；方案4：上述方案1中kcne3基因snp位点与nat2基因snp位点的组合与其他6个snp位点中的任意三个位点的组合；方案5：上述方案1中kcne3基因snp位点与nat2基因snp位点的组合与其他6个snp位点中的任意四个位点的组合；方案6：上述方案1中kcne3基因snp位点与nat2基因snp位点的组合与其他6个snp位点中的任意五个位点的组合；方案7：上述方案1中kcne3基因snp位点与nat2基因snp位点的组合与其他所有六个snp位点的组合。表3中示出的是针对每个组合方案所测的最大auc值(表3中auc值上带有max下标的组合)、最小auc值(表3中auc值上带有min下标的组合)，以及若干位于最大值和最小值之间的、随机抽取的组合的auc值。表3：基于kcne3和nat2基因的snp位点组合、以及该组合与其它6个基因snp位点组合的auc值：2)上述相关snp位点组合的auc值的结果1)中所有情况与nat2基因位点rs1495741和/或rs1041983(表4中表示为nat2*)组合的auc值，如表4所示。表4中的方案分别为：方案1：上述结果1)中的方案1所涵盖的所有组合与nat2基因位点rs1495741和/或rs1041983组合；方案2：上述结果1)中的方案2-7所涵盖的所有组合与nat2基因位点rs1495741和/或rs1041983组合；表4中示出的是针对每个组合方案所测的最大auc值(表4中auc值上带有“max”下标的组合)、最小auc值(表4中auc值上带有“min”下标的组合)，以及若干位于最大值和最小值之间的、随机抽取的组合的auc值。表4：上述相关snp位点组合的auc值的结果1)中所有情况与nat2基因位点rs1495741和/或rs1041983组合的auc值：3)比较例：比较例见表5。表5中示出的是本发明所检测出的nat2基因的5个与抗结核药物肝毒性反应相关的snp位点各自及其组合的auc值，以及nat2基因的snp位点与xo基因和/或il6基因的snp位点的组合的auc值。表5：作为比较例的auc值：基于kcne3基因snp位点rs12272502为首次发现与抗结核药物肝毒性反应相关的snp位点，且在表3和表4中的方案1与表5的auc值的比较中，kcne3和nat2基因的snp位点组合的auc值明显高于nat2基因的5个与抗结核药物肝毒性反应相关的snp位点各自及其组合的auc值，可以看出kcne3和nat2基因的snp位点组合为更全面、准确地评估抗结核药物肝毒性反应风险提供了可能性。从表3中的方案2-7与表5的auc值的比较中可以看出，进一步地，kcne3和nat2基因的snp位点组合与本发明中其它6个基因snp位点中至少一个相组合的auc值显著高于比较例(表5)中的组合方案，尤其当组合方案是kcne3基因snp位点与nat2基因snp位点的组合与其他6个snp位点中的至少任意二个位点的组合(表3中的方案3-7)时，其auc值明显高于比较例(表5)中的组合方案的auc值，从而表明，这些方案可以实现更全面、更准确地评估抗结核药物肝毒性反应风险的目的。更进一步地，从表4中的方案2与表5的auc值的比较中可以看出，在表3中方案2-7所涵盖的所有组合的基础上，再与nat2基因位点rs1495741和/或rs1041983组合(即表4中的方案2)而形成的组合中，部分组合可以达到更高的auc值，以更准确地评估抗结核药物引起药物肝毒性反应风险。实施例3：本实施例3中，制作评估抗结核药物肝毒性反应风险的试剂盒，用于检测kcne3基因snp位点rs12272502和nat2基因snp位点rs4921914。该试剂盒含有所需检测snp位点的特异性扩增引物和特异性延伸引物的试剂，其中，snp位点rs12272502的特异性扩增引物序列为seqidno.1和seqidno.2；其特异性延伸引物序列为seqidno.3；snp位点rs4921914的特异性扩增引物序列为seqidno.22和seqidno.23；其特异性延伸引物序列为seqidno.24；该试剂盒还包括相应pcr技术所需的常用试剂：(如dntps，mgcl2，双蒸水，taq酶等，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。例如：本实施例3中的试剂盒试剂包括：dntps(25mm)，mgcl2(25mm)，primermix(500nm)，hotstartaq(5u/μl)，双蒸水。扩增反应体系包括：1.85μl双蒸水，0.1μldntp(25mm)，0.325μlmgcl2(25mm)，1μlprimermix(500nm)，0.625μlpcrbuffer(1.25x)，0.1μlhotstartaq(5u/μl)，加入1μl模板dna进行pcr扩增反应。pcr扩增的反应条件：94℃变性5min；94℃20s，57℃30s，72℃1min，45个循环；72℃延伸3min。在pcr反应结束后，将pcr产物用sap(shrimpalkalinephosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dntps。延伸反应体系：0.041μliplex酶(1x)，0.94μlprimermix，0.619μl双蒸水，0.2μliplexterminationmix(1x)，0.2μliplexbufferplus(0.222x)，7μlsap处理后pcr产物。延伸反应条件：94℃变性30s；94℃5s；52℃5s，80℃5s，40个循环；72℃延伸3min。纯化后产物使用sequenommassarray系统进行基因分型。或者，pcr扩增的反应体系的组成如下(50μl):基因组dna0.50ng、上游引物30pmol、下游引物30pmol、2×taqplantinumpcrmastermix25μl和去离子水。2×taqplantinumpcrmastermix购自天根生化科技(北京)有限公司，货号kt204。pcr扩增的反应条件：94℃变性5min；94℃20s，57℃30s，72℃1min，45个循环；72℃延伸3min。将pcr扩增产物进行测序。上述pcr反应体系、反应条件和后续的基因分型及评估方法，可以根据本领域公知常识或者惯用技术手段进行变化或者替换。该试剂盒的价值在于：评估抗结核药物肝毒性反应风险，从而进行分子标记辅助选择和用药预测，实现个体化用药，减少药物不良反应。实施例4：本实施例4中，制作评估抗结核药物肝毒性反应风险的试剂盒，用于检测kcne3基因snp位点rs12272502，nat2基因snp位点rs4921914和ppp2r2b基因snp位点rs1031915。该试剂盒的试剂与实施例3中基本相同，区别在于，该试剂盒还含有所需检测ppp2r2b基因snp位点rs1031915的特异性扩增引物和特异性延伸引物的试剂，其中，rs1031915的特异性扩增引物序列为seqidno.7和seqidno.8；其特异性延伸引物序列为seqidno.9。相应的pcr反应体系和反应条件与实施例3基本相同。实施例5：本实施例5中，制作评估抗结核药物肝毒性反应风险的试剂盒，用于检测kcne3基因snp位点rs12272502、nat2基因snp位点rs4921914、blnk基因snp位点rs2290714、ppp2r2b基因snp位点rs1031915、vav2基因snp位点rs679106、flt3基因snp位点rs9319408、xo基因snp位点rs1429372、il6基因snp位点rs2069852和nat2基因snp位点rs1041983。相应地，该试剂盒的试剂含有以上所需检测基因snp位点的特异性扩增引物和特异性延伸引物的试剂，其中，所需检测基因snp位点的特异性扩增引物和特异性延伸引物分别如下：rs12272502的特异性扩增引物序列为seqidno.1和seqidno.2；其特异性延伸引物序列为seqidno.3；rs4921914的特异性扩增引物序列为seqidno.22和seqidno.23；其特异性延伸引物序列为seqidno.24；rs2290714的特异性扩增引物序列为seqidno.4和seqidno.5；其特异性延伸引物序列为seqidno.6；rs1031915的特异性扩增引物序列为seqidno.7和seqidno.8；其特异性延伸引物序列为seqidno.9；rs679106的特异性扩增引物序列为seqidno.13和seqidno.14；其特异性延伸引物序列为seqidno.15；rs9319408的特异性扩增引物序列为seqidno.10和seqidno.11；其特异性延伸引物序列为seqidno.12；rs1429372的特异性扩增引物序列为seqidno.16和seqidno.17；其特异性延伸引物序列为seqidno.18；rs2069852的特异性扩增引物序列为seqidno.19和seqidno.20；其特异性延伸引物序列为seqidno.21；rs1041983的特异性扩增引物序列为seqidno.31和seqidno.32；其特异性延伸引物序列为seqidno.33。相应的pcr反应体系和反应条件与实施例3基本相同。实施例6：本实施例6中，制作评估抗结核药物肝毒性反应风险的试剂盒，用于检测kcne3基因snp位点rs12272502、nat2基因snp位点rs4921914、blnk基因snp位点rs2290714、ppp2r2b基因snp位点rs1031915、vav2基因snp位点rs679106、flt3基因snp位点rs9319408、xo基因snp位点rs1429372、il6基因snp位点rs2069852和nat2基因snp位点rs1495741。相比于实施例5，基于本实施例6的试剂盒需检查的snp标志物与其只区别于，本实施例6中检测的nat2基因snp位点为rs1495741，而不再是rs1041983。相应地，该试剂盒的试剂与实施例5中的基本相同，区别只在于：其含有snp位点rs1495741的特异性扩增引物和特异性延伸引物，替代rs1041983的相关试剂。其中，rs1495741的特异性扩增引物序列为seqidno.34和seqidno.35；其特异性延伸引物序列为seqidno.36。相应的pcr反应体系和反应条件与实施例3基本相同。实施例7：本实施例7中，制作评估抗结核药物肝毒性反应风险的试剂盒，用于检测kcne3基因snp位点rs12272502、nat2基因snp位点rs7816847和rs4921914、blnk基因snp位点rs2290714、ppp2r2b基因snp位点rs1031915、il6基因snp位点rs2069852和nat2基因snp位点rs1495741。相应地，该试剂盒的试剂含有以上所需检测基因snp位点的特异性扩增引物和特异性延伸引物的试剂，其中，所需检测基因snp位点的特异性扩增引物和特异性延伸引物分别如下：rs12272502的特异性扩增引物序列为seqidno.1和seqidno.2；其特异性延伸引物序列为seqidno.3；rs4921914的特异性扩增引物序列为seqidno.22和seqidno.23；其特异性延伸引物序列为seqidno.24；rs7816847的特异性扩增引物序列为seqidno.28和seqidno.29；其特异性延伸引物序列为seqidno.30；rs2290714的特异性扩增引物序列为seqidno.4和seqidno.5；其特异性延伸引物序列为seqidno.6；rs1031915的特异性扩增引物序列为seqidno.7和seqidno.8；其特异性延伸引物序列为seqidno.9；rs2069852的特异性扩增引物序列为seqidno.19和seqidno.20；其特异性延伸引物序列为seqidno.21；rs1495741的特异性扩增引物序列为seqidno.34和seqidno.35；其特异性延伸引物序列为seqidno.36。相应的pcr反应体系和反应条件与实施例3基本相同。以上所述实施例仅为本发明各技术特征的任意组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。sequencelisting<110>北京光大隆泰科技有限责任公司<120>基于kcne3和nat2基因的与抗结核药物肝毒性反应相关的snp标志物、试剂盒及应用<160>36<170>patentinversion3.5<210>1<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>1acgttggatgccaaagcaagcagtcttttc30<210>2<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>2acgttggatggacatagggagactgtctca30<210>3<211>19<212>dna<213>人工引物序列<400>3ggtgactgagtgatgtgag19<210>4<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>4acgttggatgcgacctgcacaaacatatac30<210>5<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>5acgttggatgtatttctgagcctgccagag30<210>6<211>17<212>dna<213>人工引物序列<400>6tacactactcagtcccc17<210>7<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>7acgttggatgctccttgagttgagcattac30<210>8<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>8acgttggatggcacacctacatttaaagtc30<210>9<211>19<212>dna<213>人工引物序列<400>9ccatgttacagacaaatgc19<210>10<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>10acgttggatgctcatcaacagtgcataacg30<210>11<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>11acgttggatggaaataccaccttacacctg30<210>12<211>26<212>dna<213>人工引物序列<400>12ggtttctgtcatctttttataatagc26<210>13<211>29<212>dna<213>人工引物序列<400>13acgttggatgtatctgtccgcggcgcact29<210>14<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>14acgttggatgtcttcctcactgtgccattc30<210>15<211>15<212>dna<213>人工引物序列<400>15cagggcgcagggagt15<210>16<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>16acgttggatgtcatacacctgagcatacgg30<210>17<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>17acgttggatgatgtctcattctggcccaag30<210>18<211>21<212>dna<213>人工引物序列<400>18cccaggggcagttctcacatc21<210>19<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>19acgttggatgcttccagctgggtgacttag30<210>20<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>20acgttggatgacgtcatttaaccccagcac30<210>21<211>25<212>dna<213>人工引物序列<400>21ctataaattacttagtcttccacaa25<210>22<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>22acgttggatgcccagacttcagtgtgcaag30<210>23<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>23acgttggatgcagtgcccgcttgctttttc30<210>24<211>20<212>dna<213>人工引物序列<400>24agtcagtgtgcaagaataca20<210>25<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>25acgttggatgactgtcccatttaagtccag30<210>26<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>26acgttggatgagtgtttgtccgagacgatg30<210>27<211>23<212>dna<213>人工引物序列<400>27cctccgtccagaatttgttagcc23<210>28<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>28acgttggatggaatacagttcagccaagtc30<210>29<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>29acgttggatgtaaaggtgcttctggcaagg30<210>30<211>18<212>dna<213>人工引物序列<400>30gaagccaagtcttttgcc18<210>31<211>28<212>dna<213>人工引物序列<400>31acgttggatggtggtgtctccaggtcaa28<210>32<211>28<212>dna<213>人工引物序列<400>32acgttggatggttcgaggttcaagcgta28<210>33<211>25<212>dna<213>人工引物序列<400>33ggtgttacaatcctcccataaaaat25<210>34<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>34acgttggatgggccctgaagctactgtgaa30<210>35<211>30<212>dna<213>人工引物序列<400>35acgttggatgaggagcctctctcaggaaag30<210>36<211>19<212>dna<213>人工引物序列<400>36aagctactgtgaatgccca19当前第1页12