一种能够广谱抗菌的新型多肽及其应用的制作方法

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种能够广谱抗菌的新型多肽及其应用。

背景技术：

抗菌肽是一类分子量较小的多肽，它们大多数是由13-45个氨基酸组成，有些抗菌肽全部由l-氨基酸组成，有些抗菌肽分子中则同时包含了l-氨基酸和d-氨基酸，分子量一般为几千道尔顿，常带正电荷。其广泛分布于昆虫、植物、动物及人体内的防御性小肽活性物质，不仅具有广谱抗细菌能力，还具有抗真菌、抗病毒、抗寄生虫以及抗肿瘤细胞的作用，是一种比较理想的抗生素代用品，其无论作为饲料添加剂还是兽药都有着非常广阔的市场。

密度感应(quorumsensing，qs)是指微生物群体在其生长过程中，由于群体密度的增加，导致其生理和生化特性的变化，显示出少量菌体或单个菌体所不具备的特征（fuquawc,winanssc,greenbergep(1994)quorumsensinginbacteria:theluxr-luxifamilyofcelldensity-responsivetranscriptionalregulators.jbacteriol176:269-275）。它是细菌彼此之间传递信号的一种特殊机制，利用一种激素样的化合物作为信号分子(autoinducer，ai)来调节细菌基因的表达（lerate,moranna(2004)theevolutionaryhistoryofquorum-sensingsystemsinbacteria.molbiolevol21:903-913）。随着细菌密度的增加，信号分子浓度也随之增加，当信号分子的浓度也达到一定的水平，通过包括受体蛋白在内相关蛋白的信号传递，诱导或抑制信号最终传递到胞内，影响特定基因的表达，调控微生物群体的生理特征，如细菌生长、抗生素合成、生物被膜形成等。

由于使用抗生素所带来的种种弊端，迫切需要寻找一种替代方法来控制致病菌。抗菌活性肽是一种很有潜力的新型抗菌药物来源，特别是既具有抗菌肽活性，又能通过干扰致病菌的qs系统来达到抗菌是一种行之有效的新手段。因此qs已成为农业、医学和环境领域的研究热点之一。由于qs控制细菌许多病基因的表达,因此任何能够阻止qs信号分子集聚或受体识别信号分子的过程都可以阻断依赖细菌qs的毒力基因表达。由于qs介导的是微生物病原性，干扰qs体系不会对病原菌产生选择压力，因此，这使得对qs猝灭剂和抑制机制的研究具有潜在的意义。与传统抗生素相比具有分子量小、抗菌谱广、抗菌机理独特、不会产生耐药性等优点，兼具抗菌肽和阻断qs信号达到抑菌的目的。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种能够广谱抗菌的新型多肽及其应用，该抗菌多肽具有广谱抗细菌感染的用途。

本发明采取的技术方案是：一种能够广谱抗菌的新型多肽，所述多肽具有用序列号1表示的氨基酸序列，序列号1表示的序列为：hsirtgskkpvpiiy。

所述的多肽用于在体外抑制革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌ai-2分子产生，从而抑制细菌的生长。

有益效果

采用固相化学合成法即可得到本发明的抗菌多肽，该多肽只有15个氨基酸，大大解决了抗菌肽的生产成本过高的问题，有利于新型抗菌多肽在治疗细菌感染方面的应用。

本发明的抗菌多肽能够与细菌luxs/ai-2型密度感应系统的可能的受体蛋白相结合，阻断信号分子ai-2进入菌体，特异性干扰luxs/ai2密度感应系统，负向调节细菌生理功能，从而显著的抑制革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的生长，能够广谱抗菌。该阻断多肽是一种蛋白质，氨基酸短，结构简单，人工合成成本低。本发明的阻断多肽是一种分泌性小肽，可以对多种细菌中的密度感应系统做出干扰，而动物细胞无此系统，因而对正常脾细胞无毒性作用，对红细胞无溶血性。

附图说明

图1为本发明的抗菌多肽对猪链球菌的生长抑制曲线；

图2为本发明的抗菌多肽对金黄色葡萄球菌的生长抑制曲线；

图3为本发明的抗菌多肽对大肠杆菌的生长抑制曲线；

图4为本发明的抗菌多肽对沙门菌的生长抑制曲线；

图5为本发明的抗菌多肽对单核李斯特菌的生长抑制曲线；

图6为本发明的抗菌多肽对铜绿假单胞菌的生长抑制曲线。

具体实施方式

下面对本发明的实施例做详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

一种能够广谱抗菌的新型多肽，其氨基酸序列为seqid1。按常规固相合成的方法人工合成本发明的多肽。所述的多肽用于在体外抑制革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌ai-2分子产生，从而抑制细菌的生长。

实施例2

抗菌多肽抑制多种细菌信号分子ai-2实验

srh的制备：srh的体外合成参照schauder（schauders,shokatk,surettemg,etal.theluxsfamilyofbacterialautoinducers:biosynthesisofanovelquorum-sensingsignalmolecule.molmicrobiol,2001,41:463-476）等建立的方法进行，1mg/ml纯化的pfs重组蛋白与1mmsam在10mm磷酸钠（sodiumphosphatebuffer，ph7.5）缓冲液中，37°c作用1小时,反应液用millpore(10,000dacutoff)的超滤膜，进行超滤，去除反应液中的蛋白。滤液即为srh，滤液冻存于-80°c。

将人工合成的多肽溶于10mm磷酸钠缓冲液中，同时加入纯化的重组蛋白luxs，37℃作用1小时，加入1mmsrh,37℃作用1小时，反应液用millpore（100000dacutoff）的超滤膜，进行超滤，去除反应液中的蛋白。取适量滤液用100mm磷酸钠，0.1mmedta，ph7.2缓冲液作20倍稀释。取200ul上述稀释液，加入100ul的5mmellman’s试剂（dtnb,溶于100mm磷酸钠，0.1mmedta，ph7.2缓冲液），37°c作用15min，在412nm的波长下测光吸收值。

实验结果：由表1结果表明，多肽能显著抑制luxs催化srh生成ai-2，各细菌ai-2抑制率在80%-90%之间（luxs中不加多肽催化srh形成ai-2的能力设定为100%）。

表1多肽抑制ai-2实验

实施例3

阻断多肽对各种细菌的最小抑菌浓度

阻断多肽在抑制细菌的应用中，首先将实验用菌挑单菌落37℃过夜培养后，在1:100接种新鲜的培养基，37℃培养到od600=1.0左右，用培养液稀释成105cfu/ml的细菌悬液。并将多肽配置成浓度为100g/ml，0.22m无菌过滤，分装。用无菌培养液将多肽倍比稀释成100、10、1、0.1g/ml。另设不含药物作为对照。37℃培养培养16-20小时后，观察抗菌效果。确定阻断多肽的10倍稀释的最低抑制浓度后，将最低抑制浓度进行2倍等比稀释，重复上述实验，最终确定阻断多肽对细菌的最低抑制浓度。

抗菌结果表明阻断多肽对金黄色葡萄球菌、猪链球菌、大肠杆菌、沙门菌和单核李斯特菌都有高效的抗菌作用，其最小抑菌浓度mic均低于6g/ml，抗菌多肽能显著抑制细菌生长。对铜绿假单胞菌也有较强的抑制作用，添加多肽组细菌几乎不增加，6小时后细菌开始下降，直到全部抑制。

实施例4：阻断多肽对各种细菌的生长抑制曲线

采用5倍的mic的药物浓度，混合于制备好的菌悬液中，使其终浓度为105cfu/ml左右，在0min、30min、1h、2h、4h、6h和8h时，吸取培养物系列稀释，进行活菌计数，每个稀释度做三个平行实验，求平均值。以细菌浓度对数为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制抑菌曲线同时做空白对照和阳性对照组。结果见附图1-4.

采用5倍mic的药物浓度测定阻断多肽对金黄色葡萄球菌、猪链球菌、大肠杆菌、沙门菌、单核李斯特菌和铜绿假单胞菌的杀菌曲线。由图可以看出，阻断多肽对各种细菌均具有明显的抑制效果。体外的杀菌实验表明，阻断多肽具有显著的杀灭细菌的作用，可用来制备细菌感染的有效药物，所述的细菌主要指金黄色葡萄球菌、猪链球菌、大肠杆菌、沙门菌、单核李斯特菌和铜绿假单胞菌。

实施例5：抗菌肽的溶血检测

利用羊血红细胞检测抗菌肽的溶血作用。将浓度为1mg/ml的抗菌肽溶液10微升滴加在血平皿表面，以蒸馏水做对照。置于37℃条件下24小时以上，然后观察溶血圈的有无。结果所测抗菌肽没有出现溶血圈，初步结果表明，所述抗菌肽不存在溶血毒性。

实施例6：抗菌肽对小鼠脾细胞的毒性测定

取健康icr小鼠的脾脏，经筛网研磨成分散细胞，用rpim-1640培养基将细胞重悬成5×107个/ml，置于无菌96孔板中。同时加入1600微克/ml的抗菌肽，同时设置不含药物组及cona分别做阴性和阳性对照，设置三成重复，置于co2培养箱培养孵育48小时，然后加入mtt（5weike/ml），再孵育4小时后，经过、离心10min。弃去上清，加dmso溶解于490nm测吸光值，结果发现抗菌肽处理48h的脾细胞存活数没有发生显著性增大或减少，因此说明抗菌肽对小鼠脾细胞没有毒性。

sequencelisting

<110>河南科技大学

<120>一种能够广谱抗菌的新型多肽及其应用

<130>2017

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