一种能够合成甘草次酸的酿酒酵母工程菌的构建方法与流程

本发明属于生物化工领域，具体涉及一种能够合成甘草次酸的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括了含有甘草次酸生物合成途径的酿酒酵母工程菌的构建方法。

背景技术：

萜类是自然界中具有代表性的生物活性分子，是植物生长发育所必需的物质，在植物与环境相互作用中扮演重要角色，同时也是香料、药物、杀虫剂、甜味剂等产品的工业原材料。甘草次酸是一种五环三萜化合物，由于比甘草主要活性成分甘草酸少两分子葡萄糖酸酸，使其更易穿透细胞膜，更易在细胞内发挥抗炎、抗病毒、降血脂、防治肿瘤和抗艾滋病等作用。受表观遗传等因素影响，甘草次酸在甘草中累积量很低，目前主要通过化学水解甘草酸而获得，成本高、周期长、工艺污染大；而高度复杂的化学结构使得利用传统化学合成也难以实现。

相反，甘草次酸生物合成途径的解析为构建人工合成体系提供了机会，利用微生物可以利用廉价碳源、生长周期短、更易控制等优势发酵生产甘草次酸将有利于提高高值化学品的生产效率，降低生产成本，且符合绿色发展理念。

目前还未在微生物中发现甘草次酸合成相关的酶或基因，仅在植物中存在关键合成酶或基因。

技术实现要素：

针对甘草次酸水解生产和化学合成方法的局限和困难的问题，本发明提供一种利用酿酒酵母合成甘草次酸的方法。本发明构建的酿酒酵母工程菌，将多个基因表达盒通过酵母强大的同源重组系统重组至酵母基因组中，表达遗传更稳定，无需额外添加抗生素控制外源基因的稳定性。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种能够合成甘草次酸的酿酒酵母工程菌的构建方法，首先利用来源于光果甘草的β-香树脂醇合酶ggbas基因(genbank注册序列号为ab037203)、来源于乌拉尔甘草的细胞色素p450氧化酶cyp88d6基因(genbank注册序列号为ab433179)和细胞色素p450氧化酶cyp72a154基因(genbank注册序列号为ab558146)、以及来源于拟南芥的细胞色素还原酶cpr1基因(genbank注册序列号为ab433179)和细胞色素还原酶cpr2基因(genbank注册序列号为ab558146)制备获得ggbas基因片段、cyp88d6基因片段、cyp72a154基因片段、cpr1基因片段以及cpr2基因片段，分别上述基因片段与酵母启动子和酵母终止子通过两步重叠延伸pcr连接，得到基因表达盒fba1p-ggbas-fba1t、pgk1p-cyp88d6-gmp1t、ala1p-cpr1-ala1t、eno2p-cyp72a154-tys1t和gpm1p-cpr2-cyc1t；然后将共转化上述基因表达盒于酿酒酵母cen.pk2-1c中，利用酵母同源重组能力组装形成具有完整甘草次酸生物合成途径的酿酒酵母工程菌。

进一步地，ggbas基因片段的制备具体为：利用酿酒酵母密码子偏好性对光果甘草中的β-香树脂醇合酶ggbas基因序列(genbank注册序列号为ab037203)进行密码子优化并化学合成，然后扩增获得ggbas基因片段(如seq.idno.1所示)；

进一步地，cyp88d6基因片段的制备具体为：利用酿酒酵母密码子偏好性对乌拉尔甘草中的细胞色素p450氧化酶cyp88d6基因序列(genbank注册序列号为ab433179)进行密码子优化并化学合成，然后扩增获得cyp88d6基因片段(如seq.idno.4所示)；

进一步地，cyp72a154基因片段的制备具体为：利用酿酒酵母密码子偏好性对乌拉尔甘草中的细胞色素p450氧化酶cyp72a154基因序列(genbank注册序列号为ab558146)进行密码子优化并化学合成，然后扩增获得cyp72a154基因片段(如seqidno.7所示)；

进一步地，cpr1基因片段的制备具体为：从拟南芥叶中提取总rna，反转录成cdna，以拟南芥细胞色素还原酶cpr1基因序列(genbank注册序列号为ab433179)设计引物，利用cdna为模板扩增获得cpr1基因片段(如seqidno.10所示)；

进一步地，cpr2基因片段的制备具体为：从拟南芥叶中提取总rna，反转录成cdna，以拟南芥细胞色素还原酶cpr2基因序列(genbank注册序列号为ab558146)设计引物，利用cdna为模板扩增获得cpr2基因片段(如seqidno.13所示)；

进一步地，所述基因表达盒的制备具体为：分别将酵母启动子fba1p、终止子fba1t和所述ggbas基因片段，酵母启动子pgk1p、终止子gmp1t和所述cyp88d6基因片段，酵母启动子eno2p、终止子tys1t和所述cyp72a154基因片段，酵母启动子ala1p、终止子ala1t和所述cpr1基因片段，酵母启动子gpm1p、终止子cyc1t和所述cpr2基因片段通过两步重叠延伸pcr连接，得到基因表达盒fba1p-ggbas-fba1t、pgk1p-cyp88d6-gmp1t、ala1p-cpr1-ala1t、eno2p-cyp72a154-tys1t和gpm1p-cpr2-cyc1t。

所述具有完整甘草次酸生物合成途径的酿酒酵母工程菌在发酵生产甘草次酸中的应用。

本发明的有益技术效果：

(1)本发明所述方法在酿酒酵母工程菌中导入了完整甘草次酸合成途径，能够发酵生产甘草次酸，实现了酿酒酵母中甘草次酸的人工合成。

(2)本发明所述方法制备获得的酿酒酵母工程菌，具有以下优点：

本发明所构建的酿酒酵母工程菌，将多个基因表达盒通过酵母强大的同源重组系统重组至酵母基因组中，表达遗传更稳定，无需额外添加抗生素控制外源基因的稳定性。

本发明所构建的酿酒酵母工程菌中，甘草次酸合成途径受组成型启动子控制，发酵过程无需添加诱导剂、效应剂，节约了发酵成本，且发酵过程控制更加简单。

本发明的酿酒酵母工程菌可利用酵母自身代谢提供甘草次酸合成的前体物，能够以葡萄糖或乙醇为原料合成甘草次酸，原料成本低。

附图说明

图1为甘草次酸标准品的组分分析离子流图；

图2为本发明中酿酒酵母工程菌发酵生产甘草次酸的组分分析离子流图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。

实施例1

一种能够合成甘草次酸的酿酒酵母工程菌的构建方法，首先利用来源于光果甘草的β-香树脂醇合酶ggbas基因(genbank注册序列号为ab037203)、来源于乌拉尔甘草的细胞色素p450氧化酶cyp88d6基因(genbank注册序列号为ab433179)和细胞色素p450氧化酶cyp72a154基因(genbank注册序列号为ab558146)、以及来源于拟南芥的细胞色素还原酶cpr1基因(genbank注册序列号为ab433179)和细胞色素还原酶cpr2基因(genbank注册序列号为ab558146)制备获得ggbas基因片段、cyp88d6基因片段、cyp72a154基因片段、cpr1基因片段以及cpr2基因片段，分别上述基因片段与酵母启动子和酵母终止子通过两步重叠延伸pcr连接，得到基因表达盒fba1p-ggbas-fba1t、pgk1p-cyp88d6-gmp1t、ala1p-cpr1-ala1t、eno2p-cyp72a154-tys1t和gpm1p-cpr2-cyc1t；然后将共转化上述基因表达盒于酿酒酵母cen.pk2-1c中，利用酵母同源重组能力组装形成具有完整甘草次酸生物合成途径的酿酒酵母工程菌。

其中，酿酒酵母作为真核微生物，具有合成萜类化合物所必需的前体物，且遗传背景清楚，遗传操作简单，具有完整蛋白质翻译后修饰功能，因此是表达植物源基因合成甘草次酸的优秀潜在宿主。通过引入甘草次酸合成必需的β-香树脂醇合酶、细胞色素p450氧化酶和细胞色素p450氧化还原酶实现酿酒酵母生产三萜化合物，将为其它复杂结构萜类化合物的微生物人工高效合成提供技术支持。

所述构建方法具体包括如下步骤：

1.基因表达盒的构建

(1)从genbank基因库中查询获得光果甘草β-香树脂醇合酶ggbas基因序列(genbank注册序列号为ab037203)，利用酿酒酵母密码子偏好性进行密码子优化，化学合成后扩增获得ggbas基因片段(如seq.idno.1所示)。

引物序列为：

5’>ttgtcatatataaccataaccaagtaatacatattcaaaatgtggagattgaagatcgc<3’(如seq.idno.2所示)；和

5’>atactcattaaaaaactatatcaattaatttgaattaacttaagtcaaacaaactggag<3’(如seqidno.3所示)；

(2)从genbank基因库中查询获得乌拉尔甘草细胞色素p450氧化酶cyp88d6基因序列(genbank注册序列号为ab433179)，利用酿酒酵母密码子偏好性进行密码子优化，化学合成后扩增获得cyp88d6基因片段(如seqidno.4所示)。引物序列为：

5’>aggaagtaattatctactttttacaacaaatataaaacaatggaagtacattgggtttg<3’(如seqidno.5所示)；和

5’>gagggaaaaagaaatcatcaaatcattcattcttcagacttaagcacaagaaaccttga<3’(如seqidno.6所示)。

(3)从genbank基因库中查询获得乌拉尔甘草细胞色素p450氧化酶cyp72a154基因序列(genbank注册序列号为ab558146)，利用酿酒酵母密码子偏好性进行密码子优化，化学合成后扩增获得cyp72a154基因片段(如seqidno.7所示)。引物序列为：

5’>cataacaccaagcaactaatactataacatacaataataatggacgcttcttctactcc<3’(如seqidno.8所示)；和

5’>ttattatattatgaatcgtgaaaacggattaagctatgcttacaacttgtgcaagatga<3’(如seqidno.9所示)；

(4)从新鲜的拟南芥叶中提取总rna，反转录成cdna，以genbank基因库中查询获得的拟南芥细胞色素还原酶cpr1基因序列(genbank注册序列号为ab433179)设计引物，利用cdna为模板扩增获得cpr1基因片段(如seqidno.10所示)。引物序列为：

5’>tctttcaagaagcaattaactacatcaactagaaccataatgacttctgctttgtatgc<3’(如seqidno.11所示)；和

5’>agaactcctatgcattatttttcgttttattttaacttctcaccagacatctctgaggt<3’(如seqidno.12所示)；

(5)从新鲜的拟南芥叶中提取总rna，反转录成cdna，以genbank基因库中查询获得的拟南芥细胞色素还原酶cpr2基因序列(genbank注册序列号为ab558146)设计引物，利用cdna为模板扩增获得cpr2基因片段(如seqidno.13所示)。引物序列为：

5’>ttcttcttaataatccaaacaaacacacatattacaataatgtcctcttcttcttcttc<3’(如seqidno.14所示)；和

5’>gagggcgtgaatgtaagcgtgacataactaattacatgattaccatacatctctaagat<3’(如seqidno.15所示)。

2.分别将酵母启动子fba1p、终止子fba1t和所述ggbas基因片段，酵母启动子pgk1p、终止子gmp1t和所述cyp88d6基因片段，酵母启动子eno2p、终止子tys1t和所述cyp72a154基因片段，酵母启动子ala1p、终止子ala1t和所述cpr1基因片段，酵母启动子gpm1p、终止子cyc1t和所述cpr2基因片段通过两步重叠延伸pcr连接，得到基因表达盒fba1p-ggbas-fba1t、pgk1p-cyp88d6-gmp1t、ala1p-cpr1-ala1t、eno2p-cyp72a154-tys1t和gpm1p-cpr2-cyc1t。

3.甘草次酸生物合成途径的构建

(1)重组同源臂的克隆

以酿酒酵母cen.pk2-1c基因组为模板，设计引物5’>gaagtacctcccaactacttttcctcac<3’(如seqidno.16所示)和5’>gccaagtaggcaattatttagtactgtcagtattgttatgatagtttaacggaaacgca<3’(如seqidno.17所示)，扩增rdna序列得到左同源臂nts2(如seqidno.18所示)。设计引物

5’>ttatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacggcggttgcggccatatctacca<3’(如seqidno.19所示)；和

5’>cgttgcaaagatgggttgaaagag<3’(如seqidno.20所示)扩增rdna序列得到右同源臂nts1(如seqidno.21所示)。

(2)抗性筛选标记的克隆

以质粒prs41h为模板，设计引物5’>ttatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacggccagcgacatggaggcccaga<3’(如seqidno.22所示)；和

5’>gacgggaaacggtgctttctggtagatatggccgcaaccgccgtcccaaaaccttctca<3’(如seqidno.23所示)扩增获得潮霉素筛选标记tef1p-hphnt1-cyct。

(3)同源臂与基因表达盒或抗性筛选标记的连接

将左同源臂nts2与β-香树脂醇合酶基因表达盒fba1p-ggbas-fba1t通过重叠延伸pcr连接，得到nts2-fba1p-ggbas-fba1t。

将右同源臂nts1与潮霉素筛选标记tef1p-hphnt1-cyct通过重叠延伸pcr连接，得到tef1p-hphnt1-cyct-nts1。

(4)甘草次酸生物合成途径的组装

将nts2-fba1p-ggbas-fba1t、pgk1p-cyp88d6-gmp1t、ala1p-cpr1-ala1t、eno2p-cyp72a154-tys1t、gpm1p-cpr2-cyc1t和tef1p-hphnt1-cyct-nts1基因表达盒利用电击法转化酿酒酵母cen.pk2-1c，利用酿酒酵母的同源重组能力将甘草次酸合成途径插入到酵母基因组上。

4.酿酒酵母工程菌的鉴定

将上述电击转化后的酿酒酵母cen.pk2-1c涂布在含有潮霉素b抗性筛选平板上，由于重组模块含有潮霉素b抗性基因，转化成功的工程菌株在潮霉素b抗性平板上生长。进一步利用菌落pcr筛选鉴定阳性克隆，获得酿酒酵母工程菌。

实施例2

酿酒酵母工程菌发酵生产甘草次酸的验证

挑选实施例1筛选出的酿酒酵母工程菌，在含有2％的葡萄糖、2％蛋白胨和1％酵母粉的培养基中30℃摇瓶培养，7天后取50ml培养后的酿酒酵母菌液8000rpm离心10min，去掉培养基，用30ml无菌水清洗，8000rpm离心10min，弃上清，用2ml饱和氯化钠溶液重悬细胞。利用细胞柱打破碎仪打碎细胞5次5min，向离心管中加入等体积乙酸乙酯，涡旋震荡3min，充分萃取酵母提取物。8000rpm离心10min，吸取有机相到鸡心瓶中，旋转蒸发仪中蒸干乙酸乙酯，加入1ml甲醇充分溶解，过0.22μm滤膜，将处理完的样品进行液相色谱-质谱(hplc-ms)检测，进行酿酒酵母工程菌发酵生产甘草次酸的分析，在酿酒酵母工程菌细胞提取液离子流图(如图2所示)中与甘草次酸标准品一致的离子流图(如图1所示)，结果说明成功构建生物合成甘草次酸的酿酒酵母工程菌，能够合成甘草次酸。

实施例3

酿酒酵母工程菌发酵生产甘草次酸

挑选实施例1筛选出的酿酒酵母工程菌单菌落，接种于含有2％葡萄糖、2％蛋白胨和1％酵母粉的30ml培养基中，30℃、150rpm振荡培养，36h后的培养液作为种子液。将种子液按照10％的接种量接种至于盛有150ml培养基的500ml摇瓶中，30℃、170rpm振荡培养，24h后每隔12h补加葡糖糖浓度至0.5～1.0％，发酵5天后测定酿酒酵母细胞中甘草次酸含量，发现酿酒酵母工程菌合成甘草次酸35.5μg/l。

发酵24h后利用乙醇为碳源每隔12h补料，发现补加浓度在0.4～0.6％时，发酵5天后测得细胞中甘草次酸浓度为48.6μg/l。

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<110>石河子大学

<120>一种能够合成甘草次酸的酿酒酵母工程菌的构建方法

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