一种海洋软体动物原代细胞分离与培养试剂盒及其用途的制作方法

本发明涉及海洋软体动物细胞培养，尤其是涉及一种海洋软体动物原代细胞分离与培养试剂盒及其用途。

背景技术：

细胞培养是现代生物工程技术中的重要技术与常用方法之一，广泛应用于细胞代谢、基因转录、蛋白质表达、细胞环境应急与免疫机制、药物筛选与生物药物表达生产等研究领域。在植物、哺乳动物、鱼类和昆虫的研究中，细胞与组织培养已经成为不可或缺的研究手段，特别是在相关基因表达调控机制、细胞信号转导通路、细胞环境应激机制、以及遗传与突变研究等方面，细胞培养已经成为无法替代的手段，也是促进现代生物技术快速发展的重要技术。但是，在海洋软体动物细胞培养领域，因为海洋软体动物细胞形态、功能分化、结构与营养需求等方面的特殊性，至今仍然没有建立起永生细胞系，原代细胞培养仍然是主要依托的方法([1]villenaaj.revfishbiolfish,2003,13:111；[2]李建军，黄宝玉.海洋通报,2015(3):247-251)。然而，即使是原代细胞培养，目前可选择用于海洋软体动物细胞分离与原代培养的试剂盒相关产品依然十分有限，严重影响了海洋软体动物细胞学相关研究与应用技术的发展。

软体动物因为应用广泛，其细胞培养研究是无脊椎动物中开展的最早最广泛的，培养对象包括一些养殖的经济贝类，组织细胞包括胚胎、鳃、外套膜、血细胞和心肌等多种组织来源。在20世纪70年代，hansen等([3]rinkevichb.jbiotechnol,1999,70:133)从淡水蜗牛成功建立了胚胎细胞系bge，这也是水生无脊椎动物中唯一细胞系。但是，几十年过去了，海洋软体动物至今还没有成功建立一个细胞系，其细胞培养遭遇长期的失败，大部分细胞培养的尝试，通常在体外只能培养比较短的时间，同时微生物污染一直威胁着原代细胞培养，也是最终培养失败的主要原因之一。

至今，海洋软体动物细胞培养主要集中在原代细胞培养条件的改进方面，特别是培养基的优化。相对较为成功的例子包括，merwe等([4]vandermerwem，auzoux-bordenaves，nieslerc.cytotechnology，2010，62(3):265－277.)报道成果原代培养了鲍外套膜血淋巴等组织细胞。odintsova等([5]odintsovana，dyachukva，nezlinlp.cellandtissueresearch，2010，339(3):625-637)报道将mytilustrossulus的幼体细胞原代培养了70多天。

目前，研究人员普遍认识到海洋软体动物细胞的营养需求和生长条件与脊椎动物差异显著。海洋软体动物原代细胞培养条件优化多集中改善原代细胞培养的营养因子与细胞生长因子。l15基础培养基是公认的相对比较适合软体动物细胞培养的基础培养基，胎牛血清也普遍被用于海洋软体动物的细胞培养，小牛血清或者待培养动物的组织提取液或血淋巴液也被报道能促进原代细胞的生长与分裂，他们的使用量大多控制在5-20％([6]chensnetal.methodscellsci,1999,21:183)。

虽然研究者们对海洋软体动物细胞培养开展了大量探索性的研究工作，但是目前仍然没有适用于海洋软体动物细胞培养的普适性方法、培养基以及试剂盒，海洋软体动物细胞培养工作进展十分缓慢。多种海洋软体动物是我国重要的海洋经济养殖种类，具有重要的食用价值和经济价值，有些还有很好的药用价值，在基础海洋水产生物的研究中也具有重要地位。因此，海洋软体动物的基础生物学、分子生物学、遗传学、基因功能学、育种学等各领域的研究方兴未艾，非常需要稳定的细胞培养体系提供不可或缺的研究手段，在缺乏细胞系的情况下，发明可用于快速建立海洋软体动物细胞分离与原代细胞培养的方法和相应的快捷试剂盒，具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种海洋软体动物原代细胞分离与培养试剂盒及其用途，

所述海洋软体动物原代细胞分离与培养试剂盒设有包装盒、洗液i瓶、洗液ii瓶、洗液iii瓶、溶液a瓶、溶液b瓶、溶液c瓶、使用说明书；

所述洗液i瓶、洗液ii瓶、洗液iii瓶、溶液a瓶、溶液b瓶、溶液c瓶、使用说明书设在包装盒内；

所述洗液i瓶内装有洗液i，所述洗液i含有100μg/ml氨苄青霉素、100μg/ml链霉素、60μg/ml青霉素、8μg/ml制霉素、50μg/ml庆大霉素的无菌滤过海水；

所述洗液ii瓶内装有洗液ii，所述洗液ii含有200μg/ml氨苄青霉素、200μg/ml链霉素、120μg/ml青霉素、16μg制霉素、100μg/ml庆大霉素的无菌滤过海水；

所述洗液iii瓶内装有洗液iii，所述洗液iii用无菌超纯水配制含20.8g/l葡萄糖、22.5g/l氯化钠、3.36g/ledta-2na、8g/l枸盐酸钠ph＝7.25的与海水等渗的螯合缓冲液；

所述溶液a瓶内装有溶液a，所述溶液a是用氯化钠调节渗透压摩尔浓度为1000mosmol/kg的胰蛋白酶消化液；

所述溶液b瓶内装有溶液b，所述溶液b是在l-15细胞培养液中添加氨苄青霉素100μg/ml、青霉素60μg/ml、链霉素100μg/ml、制霉素8μg/ml、庆大霉素50μg/ml、葡萄糖20.8g/l、氯化钠20.2g/l、氯化钾0.54g/l、氯化镁3.9g/l、氯化钙0.6g/l、硫酸镁1g/l、人重组表皮生长因子10ng/ml、海绵吡咯醛烷烃100ng/ml、谷氨酰胺2mmol/l；

所述溶液c瓶内装有溶液c，所述溶液c是含透析fbs与透析血淋巴液体积比为2︰1的血清系统。

所述洗液i最好分装入3瓶100ml无菌密封瓶，贴上标签，-20～4℃保存。

所述洗液ii最好分装入3支100ml无菌密封瓶，贴上标签，-20～4℃保存。

所述洗液iii最好分装入50ml无菌密封瓶，贴上标签，-20～4℃保存。

所述溶液a最好分装入15ml无菌密封瓶，贴上标签，-20～4℃保存。

所述溶液b最好分装入50ml无菌密封瓶，贴上标签，-20～4℃保存。

所述溶液c最好分装入10ml无菌密封瓶，贴上标签，-20～4℃保存。

所述海洋软体动物原代细胞分离与培养试剂盒可在多种海洋软体动物多种体细胞的无菌分离与体外原代培养中应用，所述多种海洋软体动物多种体细胞包括牡蛎、鲍、文蛤、扇贝、贻贝等软体动物的鳃、外套膜、肌肉、血淋巴等多种组织细胞。

本发明通过对海洋软体动物细胞分离和原代培养的条件进行优化，获得了适合海洋软体动物细胞分离与原代培养适合条件，解决了现有技术无法实现的海洋软体动物细胞快速分离与原代细胞无菌培养体系快速建立的问题，建立海洋软体动物原代细胞快速分离与原代细胞无菌方法，给出海洋软体动物原代细胞分离与培养试剂盒。

本发明的有益效果：使用本发明可以快速简便地将海洋软体动物细胞进行体外分离制备与培养，培养的细胞存活率高，受微生物污染率低，细胞可传代和继代培养时间长达20～90天。本发明的主要技术原理是通过使用含有多种广谱抗生素联用的无菌滤过海水经8次短(30s)时间剧烈震荡，对海洋软体动物组织进行清洗即可除去几乎所有附着于组织上的微生物，大大减少微生物污染的概率；海水等渗的金属离子螯合缓冲液和与海水等渗的胰蛋白酶消化液，都能够保证在分离培养过程中，使海洋软体动物细胞处于稳定性渗透压环境中；添加细胞生长因子及与细胞相近渗透压和ph的细胞培养液为细胞提供了合适的生长条件，且培养过程仅用少量无菌离心管、无菌滤纸等常用耗材，使得细胞培养实验易准备，使原本复杂的原代细胞制备和培养实验，变得非常简便，同时还能保障原代细胞的高活性和低污染率。

附图说明

图1是本发明中试剂盒包装与内含物示意图。

图2是用本发明制备的牡蛎鳃细胞体外原代培养1-7天细胞密度变化显微图。

图3是使用本发明制备的牡蛎鳃细胞体外原代培养1-7天细胞密度变化趋势图。

图4是用本发明分离牡蛎鳃细胞体外原代培养传代21天细胞活力变化趋势图。

图5是使用本发明分离杂色鲍鳃细胞体外连续原代培养30天细胞状态显微图(100×)。在图5中，a为刚分离并滤过的细胞；b为培养3天的细胞；c为培养6天的细胞；d为培养9天的细胞；e为培养15天的细胞；f为培养25天的细胞；g为培养30天的细胞。

图6是使用本发明进行杂色鲍外套膜原代培养8天后产生的贴壁细胞克隆(200×)。

图7是使用本发明制备的杂色鲍细胞体外原代培养培养20天后,用75％乙醇固定，pi染色，流式细胞仪分析其前散和侧散荧光比例,对细胞类群进行分类。

图8是使用本发明制备的使用本发明制备的杂色鲍细胞体外原代培养20天细胞类群分布与数量的流式分析。

图9是使用本发明制备的杂色鲍细胞体外原代培养20天细胞类群周期分布的流式分析。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

参见图1，所述海洋软体动物原代细胞分离与培养试剂盒实施例设有包装盒1、3支洗液i瓶2、3支洗液ii瓶3、3支洗液iii瓶4、1支溶液a瓶5、1支溶液b瓶6、1支溶液c瓶7、使用说明书8。

所述、3支洗液i瓶2、3支洗液ii瓶3、3支洗液iii瓶4、1支溶液a瓶5、1支溶液b瓶6、1支溶液c瓶7、使用说明书8设在包装盒1内。

所述洗液i瓶内装有洗液i，所述洗液i含有100μg/ml氨苄青霉素、100μg/ml链霉素、60μg/ml青霉素、8μg/ml制霉素、50μg/ml庆大霉素的无菌滤过海水；

所述洗液ii瓶内装有洗液ii，所述洗液ii含有200μg/ml氨苄青霉素、200μg/ml链霉素、120μg/ml青霉素、16μg制霉素、100μg/ml庆大霉素的无菌滤过海水；

所述洗液iii瓶内装有洗液iii，所述洗液iii用无菌超纯水配制含20.8g/l葡萄糖、22.5g/l氯化钠、3.36g/ledta-2na、8g/l枸盐酸钠ph＝7.25的与海水等渗的螯合缓冲液；

所述溶液a瓶内装有溶液a，所述溶液a是用氯化钠调节渗透压摩尔浓度为1000mosmol/kg的胰蛋白酶消化液；

所述溶液b瓶内装有溶液b，所述溶液b是在l-15细胞培养液中添加氨苄青霉素100μg/ml、青霉素60μg/ml、链霉素100μg/ml、制霉素8μg/ml、庆大霉素50μg/ml、葡萄糖20.8g/l、氯化钠20.2g/l、氯化钾0.54g/l、氯化镁3.9g/l、氯化钙0.6g/l、硫酸镁1g/l、人重组表皮生长因子10ng/ml、海绵吡咯醛烷烃100ng/ml、谷氨酰胺2mmol/l；

所述溶液c瓶内装有溶液c，所述溶液c是含透析fbs与透析血淋巴液体积比为2︰1的血清系统。

以下给出具体实施例。

实施例1

所述海洋软体动物原代细胞分离与培养试剂盒由包装盒、3支100ml洗液i、3支100ml洗液ii、50ml洗液iii、15ml溶液a、50ml溶液b、10ml溶液c、使用说明书组成。

其中其中洗液i是含有100μg/ml氨苄青霉素、100μg/ml链霉素、60μg/ml青霉素、8μg/ml制霉素、50μg/ml庆大霉素的无菌滤过海水，分装入3支100ml无菌密封瓶，贴上标签，-20～4℃保存。

洗液ii是含有200μg/ml氨苄青霉素、200μg/ml链霉素、120μg/ml青霉素、16μg制霉素、100μg/ml庆大霉素的无菌滤过海水,分装入3支100ml无菌密封瓶，贴上标签，-20～4℃保存。

洗液iii是用无菌超纯水配制含20.8g/l葡萄糖、22.5g/l氯化钠、3.36g/ledta-2na、8g/l枸盐酸钠ph＝7.25的与海水等渗的螯合缓冲液，分装入50ml无菌密封瓶，贴上标签，-20～4℃保存。

溶液a是用氯化钠调节渗透压为1200mosmol/kg的胰蛋白酶消化液,分装入15ml无菌密封瓶，贴上标签，-20～4℃保存。

溶液b是在l-15细胞培养液中添加氨苄青霉素100μg/ml、青霉素60μg/ml、链霉素100μg/ml、制霉素8μg/ml、庆大霉素50μg/ml、葡萄糖20.8g/l、氯化钠20.2g/l、氯化钾0.54g/l、氯化镁3.9g/l、氯化钙0.6g/l、硫酸镁1g/l、人重组表皮生长因子10ng/ml、吡咯醛烷烃10ng/ml、2mmol/l谷氨酰胺，分装入50ml无菌密封瓶，贴上标签，-20～4℃保存。

溶液c是含透析fbs与透析血淋巴液比例为2:1的血清系统，分装入10无菌密封瓶，贴上标签，-20～4℃保存。

需自准备材料：无菌50ml塑料清洗管6支、无菌15ml离心管2支)、直径35/60mm无菌培养板1个，无菌镊子和眼科剪各2把、20cm无菌镊子1把，0.1/1ml移液枪及灭菌枪头一套，50ml无菌试管、75％消毒酒精适量，15ml、50ml离心管架各一个，小型台式涡旋震荡器一台。

实施例2

先在6支50ml无菌离心管中分别倒入洗液i和洗液ii15ml各3支，再将洗液iii倒入另外两支15ml无菌离心管各5ml，将其按从洗液i到洗液iii的顺序编号1、2、3、4、5、6、7、8，并立刻盖上盖子。

使用无菌眼科手术剪和镊子从软体动物上取下较为洁净的组织块约200mg，剪成1cm2大小，小心放入含10ml洗液i的无菌试管中，充分涡旋震荡清洗30s，重复3次。

小心取出组织块，放入含10ml洗液ii的无菌试管中，充分涡旋震荡清洗30s，重复3次。

小心取出组织块，夹入含5ml洗液iii的15ml无菌试管中，充分涡旋震荡清洗10s，重复2次。

取出组织块放入无菌消化盘中，用无菌眼科手术剪将组织块尽量剪碎，加入1.5ml酶解液，在消化时使用1ml移液器(移液枪头剪去尖端)反复吸打，约5～8min后，组织块消化完全，消化液无明显大颗粒即可。

消化液中加入基础培养液5400μl，血清系统600μl，用移液器吸打混匀。

根据实验需要对以上细胞混悬液用溶液c或培养基进行稀释，分盘培养，或进行过滤、计数等实验。

实施例3

取牡蛎组织标本，操作步骤同实施例2，最终获得悬浮圆球状牡蛎鳃细胞。其连续原代培养、继代、传代21天的细胞密度、细胞活性变化趋势、以及细胞显微图请见图2～4。

利用本发明分离杂色鲍鳃细胞体外连续原代培养30天细胞活性变化如表1所示。

表1

使用本发明分离杂色鲍鳃细胞体外连续原代培养30天细胞状态显微图(100×)参见图5，使用本发明进行杂色鲍外套膜原代培养8天后产生的贴壁细胞克隆(200×)参见图6。

使用本发明制备的杂色鲍细胞体外原代培养培养20天后,用75％乙醇固定，pi染色，流式细胞仪分析其前散和侧散荧光比例,对细胞类群进行分类参见图7，细胞经75％乙醇固定过夜，pi染色30min，rna酶处理30min，流式细胞仪分析前散荧光(反应细胞大小)和侧散荧光(反应细胞内含颗粒大小与数量)比例,据此对细胞类群进行分类分析，表明培养的细胞属于同一类群，同时有少量聚集和细胞碎片产生。

使用本发明制备的使用本发明制备的杂色鲍细胞体外原代培养20天细胞类群分布与数量的流式分析参见图8，细胞经75％乙醇固定过夜，pi染色30min，rna酶处理30min，流式细胞仪分析，fl3通道采集pi荧光信号强度，分析细胞染色体倍性，表明体外培养的细胞具有不同的染色体倍数，处于不同的细胞周期(粉红色为分裂后的单倍体细胞，绿色为处于染色体复制过程中的细胞，尚未到蓝色所表示的染色体复制完成的二倍体阶段，黄色可能为二聚体细胞)。据此进一步表明培养的细胞属于同一类群，而且都在增殖生长中，保持较好的生长状态。

使用本发明制备的杂色鲍细胞体外原代培养20天细胞类群周期分布的流式分析参见图9，细胞经75％乙醇固定过夜，pi染色30min，rna酶处理30min，流式细胞仪分析，细胞大部分处于g0g1期，部分处于亚g1期，并有少量细胞碎片，s期和m期的细胞较少，表明培养的细胞处于同一类群，同时生长节奏较为一致。

本发明克服了当前海洋软体动物细胞制备培养过程费时、活性低、易污染的问题。本发明的海洋软体动物原代细胞分离与培养试剂盒操作简便，在短时间内(30min)即可完成海洋软体动物原代细胞的分离制备与体外培养，极大程度地提高了原代细胞培养的存活率，受微生物污染的概率低，建立原代细胞培养体系成功率高。海洋软体动物原代细胞分离与培养试剂盒适用于多种海洋软体动物多种体细胞的培养，包括牡蛎、鲍、文蛤、扇贝、贻贝等软体动物的鳃、外套膜、肌肉、血淋巴等多种组织细胞的无菌分离与体外原代培养。