一种CD3ε×CD19双特异性纳米抗体及其制备方法与流程

本发明涉及免疫技术领域，具体的涉及一种双特异性纳米抗体的制备方法以及双特异性纳米抗体。

背景技术：

双特异性抗体是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，是基因工程抗体的一种，现已成为抗体工程领域的热点，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。其特点是双特异性抗体能够同时结合肿瘤相关抗原和免疫效应细胞上的靶分子，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。

纳米抗体是存在于驼类外周血里面的天然缺失轻链的重链抗体的的可变区片段。是目前已知的能够结合抗原的最小结构单位。纳米抗体具有免疫原性低、分子量小，可溶性高的优点。目前国内还没有针对肿瘤治疗的双特异性纳米抗体药物的临床治疗数据。

以下针对所研究的免疫效应细胞抗原和肿瘤细胞抗原做简单介绍，并介绍相关背景技术的发展。

1.cd3

在免疫学中，cd3分子由四个不同的亚基组成。分别是γ，δ，ε，ζ。cd3仅存在于t细胞表面，由6条肽链组成，常与tcr紧密结合形成含有8条肽链的tcr-cd3复合体。，具体示意图见图一。cd3胞质段含免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,itam)，tcr识别并结合由mhc(majorhisto-compatibilitycomplex)分子提呈的抗原肽，导致cd3的itam的保守序列的酪氨酸残基被t细胞内的酪氨酸蛋白激酶p56lck磷酸化，然后可募集其他含有sh2(scrhomology2)结构域的酪氨酸蛋白激酶(如zap-70)。itam的磷酸化和与zap-70的结合是t细胞活化信号传导过程早期阶段的重要生化反应之一。因此，cd3分子的功能是转导tcr识别抗原所产生的活化信号。cd3ε或γ链基因缺陷可致t细胞信号传导缺陷。

2.cd19

cd19表达于b系细胞(不包括成熟浆细胞)及滤泡树突状细胞上，cd19是一种重要的信号传导分子，调节b淋巴细胞的生长激活和活化，在调节b淋巴细胞抗原受体或其他表面受体的信号阈值中起重要作用，是与b淋巴细胞分化、活化、增殖及抗体产生有关的重要膜抗原，是诊断b淋巴细胞系肿瘤和鉴定b淋巴细胞的最好标志。

3.双特异性抗体制备方法

制备双特异抗体有化学偶联法、杂交瘤方法和基因工程方法等三种方法。化学偶联法可快速、大量制备双特异抗体,但这种双特异抗体用于体内时易被清除,影响其应用；杂交瘤方法制备的双特异抗体生物活性高,但制备时要经过融合、筛选等繁琐的步骤,耗时长,所得双特异抗体不易与同时产生的其它单抗分离；基因工程方法制备的双特异抗体分子量小,易于大量制备,具有广阔的应用前景。

技术实现要素：

术语和缩略语：

vhh：重链可变区

rna：核糖核苷酸

cdna：互补脱氧核糖核酸

pcr：聚合酶链反应

nanobite:双特异性纳米抗体

tumorcell:肿瘤细胞

tcell：t细胞

pbmc：外周血单个核细胞

本发明提供了一种双特异性纳米抗体，针对常规单克隆抗体或者单克隆纳米抗体的缺点以及人工改造的双克隆抗体的缺点进行研发的双特异性纳米抗体，所述的双特异性纳米抗体具有稳定性高，可溶性好，抗原结合力强的特点。该双特异性纳米抗体通过介导特异性t细胞杀伤作用，大大提高了肿瘤的杀伤功效。具体地，本发明提供了以下的技术方案：

在一种实施方式中，一种双特异性纳米抗体，其特征在于：所述双特异性纳米抗体包含3部分，a)一种抗cd19的纳米抗体，针对肿瘤细胞表面抗原具有特异性结合能力，优选的该肿瘤细胞表面抗原是cd19，cd20，cd30和cd133，更优选地，是该肿瘤细胞表面抗原是cd19；b)一种抗cd3ε纳米抗体，针对的免疫细胞选自t细胞，nkt细胞或者cik细胞，优选的，对免疫细胞表面抗原cd3具有特异性结合能力；c)连接短肽，连接两种纳米抗体。

在一种实施方式中，所述双特异性纳米抗体取自驼类体内。

在一种实施方式中，所述双特异性纳米抗体是抗人源抗原的抗体。

在一种实施方式中，所述的双特异性纳米抗体的连接短肽序列为ggggsggggsggggs。

在一种实施方式中，所述的抗cd19的纳米抗体的氨基酸序列是序列号1所示的序列。

在一种实施方式中，所述的抗cd3的纳米抗体的氨基酸序列是序列号2所示的序列。

在一种实施方式中，所述的双特异性纳米抗体的制备方法包括如下步骤：

1)羊驼外周血单个核细胞(pbmc)的分离的过程

2)流式细胞分选抗体阳性克隆的过程

3)提取阳性细胞rna,反转录成cdna的过程

4)抗人cd3ε和cd19纳米抗体序列的扩增过程

5)cd3εvhh－cd19vhh双特异性抗体原核表达载体的构建鉴定过程

6)pet32a-cd3εvhh-cd19vhh的原核表达及鉴定过程

在一种实施方式中，所述的双特异性纳米抗体的制备方法中，所用的连接载体是pet32a(+)。

在一种实施方式中，所述的双特异性纳米抗体的制备方法中，把两个纳米抗体连接起来的方法是重叠pcr方法。

在一种实施方式中，所述的双特异性纳米抗体或者按照权利要求7制备双特异性纳米抗体的方法制备的双特异性纳米抗体在制备药物中的用途，所述的药物用于治疗cd19特异性表达所引起的肿瘤，或者特异性杀伤表达cd19的细胞。

本发明的技术方案的有益效果有：

1本发明提供了一种双特异性纳米抗体以及制备方法，相对于现有的双特异性抗体来说，其分子量小，可溶性好，高表达性以及高抗原结合特性。

2本发明结合流式细胞分选技术加高通量筛选的方法来制备双特异性纳米抗体，制作周期短，抗体得率高。

附图说明

图1.cd3分子结构示意图。

图2.双特异性纳米抗体作用机制示意图。

图3.第一步cd3ε片段获得

1.阴性对照；2.cd3ε第一步pcr扩增；3.dl2000marker

图4.第一步cd19片段获得

4.阴性对照；5，6.cd19第一步pcr扩增；7.dl2000marker

图5.第二步cd3ε和cd19片段获得

7.空白对照；8.dl2000marker；9.cd3ε第二步pcr扩增；10.cd19第二步pcr扩增。

图6.cd3εvhh与cd19你vhh的琼脂糖凝胶电泳

11.cd3ε-vhh与cd19-vhh的连接产物12.dl2000dnamarker13.阴性对照

图7.pet32a-cd3εvhh-cd19vhh重组载体的构建

14.dl2000dnamarker15.pet32a-cd3εvhh-cd19vhh的pcr扩增产物16.阴性对照

图8.pet32a-cd3εvhh-cd19vhh重组蛋白的获得

17.蛋白分子量marker18.pet32a-cd3εvhh-cd19vhh诱导表达19.菌液对照

图9.cd3ε蛋白与双特异性纳米抗体的结合趋势图

图10.cd19蛋白与双特异性纳米抗体的结合趋势图

具体实施方式

实施例1.羊驼外周血单个核细胞(pbmc)的分离的过程

整个实验过程无菌操作：

1.用cd3ε和cd19免疫羊驼后，使用15ml的离心管进行采血，将血液带回实验室后直接将离心管放入离心机中离心，整个过程室温即可。根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，离心时间越长。

2.吸取上层血清，血清800μl每管分装标记，保存在-80℃冰箱备用。

3.将吸取上清后的血液吸到一个50ml的离心管内，用2-3ml的灭菌的pbs洗净原15ml离心管，吸到50ml离心管。再加入5ml的pbs稀释。另取一个无菌的50ml离心管，倒入15ml的ficoll分离液，将稀释好的血液缓慢平稳的平铺在ficoll分离液上，离心。

4.离心后此时离心管中由上至下分为四层。第一层为血浆层，第二层为环状乳白色单个核细胞层，第三层为分离液层，第四层为红细胞层。

5.用吸头小心吸取上层的血浆层弃去(因为血清已经分出，所以血浆层液体不多)，收集中间第二层环状乳白色单个核细胞层到一个50ml离心管中，在离心管中加pbs到45ml，混匀，离心10分钟。

6.在超净台内快速倒掉pbs，将离心管底部pbmc轻轻敲起，再加入pbs至45ml，混匀，离心10分钟。7.加2ml的细胞冻存液，取10μl混匀细胞的细胞冻存液加入10μl台盼蓝混匀在显微镜下用细胞计数板计数。用细胞冻存液调节pbmc浓度，保存浓度为2×10⁶/ml。

8.将调好浓度的pbmc分装在细胞冻存管内，放于缓冻盒内-80℃过夜，第二天放入液氮中保存。

9.阴性对照的获取

购买羊驼并进行标记，在免疫前颈脉取血30ml，放入预先准备好的加有抗凝剂的50ml离心管内。(抗凝剂用量20-50u/ml)分离外周血单个核细胞(pbmc)，液氮保存备用。

实施例2.流式细胞分选抗体阳性克隆的过程

所需原料为生物素标记的cd19蛋白即cd19-biotin储备液，分子量为56.3kda，sds-page结果显示糖基化后分子量为56-66kda，在100μl体系中每百万个细胞加入藻红蛋白-链霉亲和素即pe-streptavidin的量为0.015μg，阴性对照为不标记任何荧光素偶联抗体cd19免疫后的细胞，空白对照为未免疫的天然羊驼pbmc。

实施例3.提取阳性细胞rna,反转录成cdna的过程

整个实验过程所用到的试剂，枪头，离心管均无核糖核酸酶。

1.第一次流式分选后得到50000个阳性细胞，分选后从收集管中将收集液转移到1.5ml的离心管中，12000r/分钟，离心5分钟弃上清。

2.向步骤1中的阳性细胞中加入1ml的trizol液，用枪来回吹打几次使细胞充分裂解。加200μl氯仿后剧烈震荡30s，静置5分钟，12000r/分钟，离心10分钟，分层，吸取上层液体相到另一1.5ml管中，加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃沉淀20分钟。

3将沉淀液体转移到rna提取柱中，静置3分钟，用700μlbufferw2洗两遍，再用60μl无核糖核酸酶水洗脱，得到阳性细胞rna。

4rna反转录成cdna

取0.2ml的pcr管，加入模板rna8μl，oligodt1μl，rnase-freewater1.45μl，混匀后瞬时离心，放入pcr仪内，65℃孵育5分钟，然后将样品取出冰浴3分钟，瞬时离心，加入5×reactionbuffer4μl，rnaseinhibitor(20u/μl)0.55μl，10mmdntp4μl，revert-m-mμlvrt1μl，放入pcr仪中，42℃反应60分钟。反应完成后，将得到的cdna转移到已灭菌的1.5mlep管中，-80℃保存备用

实施例4.抗人cd3ε和cd19纳米抗体序列的扩增

通过两步pcr扩增获得羊驼抗人cd3ε和cd19纳米抗体

1.第一步pcr的引物为vhh-fp-f(caggtgaaggtcatcgartc)，vhh-fp-r(gatgctcttgtgactcaggaatc)。按表1中的反应体系进行第一步pcr扩增，反应程序为预变性94℃，4分钟；变性94℃，30s；退火53℃，30s；延伸72℃，40s；反应循环完成后延伸72℃，10分钟；4℃，∞，共30循环。

表1：第一步pcr扩增获得羊驼单链和双链抗体体系

2.第二步pcr的上游引物为flag-vhh-f(gattataaagatgatgatgacaagcgcagagacagtgaccagagt)，下游引物为vhh-07r(ttaatccagctgactcagcc)，vhh-08r(ttaattgttctcwcccagtc)。按表2中的反应体系进行第二步pcr扩增。反应程序为预变性94℃，4分钟；变性94℃，30s；退火53℃，30s；延伸72℃，40s；反应循环完成后延伸72℃，10分钟；4℃，∞，共30循环。

表2第二步pcr扩增获得羊驼单链抗体反应体系

实施例5.cd3ε-vhh－cd19-vhh双特异性抗体原核表达载体的构建鉴定过程

1.cd3ε-vhh与cd19-vhh的连接

以ggggsggggsggggs为连接肽，利用overlappcr方法连接cd3ε-vhh与cd19-vhh序列。overlappcr引物序列如表3所示，以步骤五中第二步pcr产物为模板进行分步pcr，反应体系如表4，表5所示，反应程序为预变性94℃，4分钟；变性94℃，30s；退火58℃，30s；延伸72℃，1分钟；反应循环完成后延伸72℃，10分钟；4℃，∞，共30循环。将cd3ε-vhh和cd19-vhh的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳并胶回收后，作为模板进行overlappcr，反应体系如表6所示，反应程序为预变性94℃，4分钟；变性94℃，30s；退火58℃，30s；延伸72℃，2分钟；反应循环完成后延伸72℃，10分钟；4℃，∞，共30循环。将overlappcr后的产物进行琼脂糖凝胶电泳并胶回收，保存进行下一步实验。

表3overlappcr引物名称及序列

表4cd3ε-vhh序列的pcr扩增体系

表5cd19-vhh序列的pcr扩增体系

表6overlappcr的反应体系

2.cd3ε-vhh和cd19-vhh的连接产物与pet32a(+)进行连接

将上述overlappcr获得的cd3εvhh-cd19vhh连接产物和pet32a(+)用限制性内切酶ecorⅰ和salⅰ进行双酶切，酶切体系如表7、表8所示。胶回收后，用t4dna连接酶连接pet32a(+)和cd3εvhh-cd19vhh，连接体系如表9所示。连接后，将连接产物转化如bl21(de3)感受态细胞中，挑菌、摇菌进行pcr鉴定，结果如图所示。取300μl菌液送测序公司进行测序，结果显示，cd3ε-vhh-cd19-vhh序列未发生突变、缺失，并且插入载体方向正确，表明h-cd3ε-vhh－cd19-vhh双特异性抗体原核表达载体构建成功。

表7h-cd3εvhh-cd19vhh酶切体系

表8pet32a(+)酶切体系

表9pet32a(+)和cd3εvhh-cd19vhh的连接体系

3.重组原核表达载体的pcr鉴定

将重组的pet32a-cd3εvhh-cd19vhh原核表达载体利用t7(taatacgactcactataggg)和t7ter(tgctagttattgctcagcgg)引物进行pcr扩增，反应体系20μl(见表10)，pcr反应程序为95℃，5分钟；95℃，30s，58℃，30s，72℃，45s(30个循环)；72℃，8分钟；4℃，∞。

将pcr扩增后的产物进行dna电泳实验，结果如图所示。条带大小与预期大小一致，将鉴定后的样品进行测序。测序结果显示，目的序列未发生基因突变、缺失，序列插入方向正确，pet32a-cd3εvhh-cd19vhh重组原核表达载体构建成功。

表10pet32a-cd3εvhh-cd19vhh原核表达载体的pcr鉴定体系

实施例6.pet32a-cd3εvhh-cd19vhh的原核表达及鉴定

1.pet32a-cd3εvhh-cd19vhh的原核表达

取构建成功的pet32a-cd3εvhh-cd19vhh菌液2ml于200ml的2yt培养基中，37℃摇菌至菌液od600nm为0.55～0.65时，加入iptg，终浓度为0.5μm，放入37℃摇菌诱导3h。取出少量菌液，离心加入适量的pbs，吹打混匀，取出20μl，加入20μl2×上样缓冲液，沸水浴3分钟，进行sds-page实验检测表达，结果如图。

2.cd3ε抗原和cd19抗原的elisa鉴定

cd3ε抗原和cd19抗原用包被液(ph9.6)稀释到2ng/μl浓度，按每孔100μl加入到酶标板中，放置于4℃冰箱中过夜，第二天进行elisa实验，elisa步骤如下：

步骤1、按每孔200μl的pbs-t加入包被后的酶标板进行清洗，清洗5次，每次3min，甩掉清洗液，于纸巾上拍板确保洗液全部被吸干；

步骤2、按每孔200μl向酶标板中加入5％的脱脂奶粉，室温封闭1h；

步骤3、按步骤1中清洗步骤进行清洗，然后，依次将100μl的空白对照液、阴性对照、纯化后的cd3e抗体加入到酶标板中，室温孵育2h；

步骤4、按步骤1中清洗步骤进行清洗，然后，按每孔100μl向酶标板加入hrp标记的标签抗体，室温孵育1h；

步骤5按步骤1中清洗步骤进行清洗，然后向每孔加入100μl的tmb，避光放置10min；

步骤6、向每孔加入50μl的2mol/l的硫酸溶液，终止反应，将酶标板放于酶标仪中，于450nm条件下读数。

结果如下：

结果显示：当用elisa方法检测cd3ε-cd19双特异性纳米抗体结合cd3ε和cd19蛋白，结合率较高，均为阳性结果。说明抗体的抗原结合律高。具体线性图见图9和图10。

最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本申请所作的举例，是优选的实施例。而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本申请型的保护范围之中。

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<110>康众（北京）生物科技有限公司

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