一种高效率提取霉菌基因组DNA的方法与流程

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种高效率的提取高质量和高浓度的霉菌基因组提取方法。

背景技术：

自从人类基因组测序计划完成之后，通过dna序列研究生物的遗传性状，已经成为现代生物学研究中不可分割的部分，其中全基因组测序已经是一种常用的研究方法，但现代分子生物学研究技术对dna样品的要求较高，以往的sds法、ctab法作用效果无法满足霉菌全基因组测序的高质量文库的要求。

霉菌与酵母等真菌不同，霉菌菌丝细胞的构造虽然与酵母菌类似，但是其生长都是由菌丝顶端细胞的不断延伸而实现的并且菌体之间连接紧密，在液体培养基中可看到霉菌以聚集的球体呈现，培养基清澈。随着霉菌菌丝顶端不断向前伸展，细胞壁和细胞质的形态、成分都逐渐变化、加厚并趋于成熟，而成熟区，由内至外相应地为几丁质层、蛋白质层、葡聚糖蛋白网层和葡聚糖层组成，一般的sds法和ctab法无法将其大量破坏。由于霉菌在液体培养基中生长时有聚集的特性，这大大降低了裂解试剂与菌体的有效接触面积。在使用传统的sds、ctab法时，主要从上清液中获取基因组dna，无法将霉菌的基因组dna大量提取，样品中有较多的多糖、糖蛋白的残留，这对打断dna样品带来非常大的困难，且很难去除，因此在构建文库时样品一定要将多糖或糖蛋白去除干净。

在样品处理方面，常规的液氮研磨对研磨者的身体素质要求过高，并且耗时耗力，不利于实验的重复。

以上两个问题都直接影响了霉菌基因组dna提取的效率和质量，最终导致传统的提取方法无法满足构建文库等样品要求过高的实验。

技术实现要素：

为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种高效率提取高质量和高浓度的霉菌基因组dna的提取方法，该方法简单快捷，获得的高质量dna能满足构建文库等高要求的实验。

为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种简单高效提取霉菌基因组dna的方法，包括以下步骤：

1)预处理：

将霉菌接种在液体培养基(察氏培养基)中，28℃下培养5-7天，然后将菌体收集，抽滤尽最大可能的去除水分，称重后，取100mg菌体放入研磨器中，按重量比计算石英砂：菌体为0.25-2：1的比例加入石英砂，随后加入研磨器容量约1/2v的液氮，在液氮挥发时，用研磨棒按压菌体，待液氮挥发干净后，利用其中石英砂将冻实的菌体研磨成粉末，该操作重复3-6次，总用时大约2min；

2)细胞洗涤：

将已经研磨成粉末的菌体用勺子盛入2mlep管中，加入1ml溶液a，颠倒4-6次后，12000转离心10min，留下沉淀，丢弃上清液；

3)细胞裂解：

将上一步的沉淀与1ml溶液b混匀，置于65℃水浴锅中，温育30min后，取出，12000转离心10min，收集上清液于2mlep管中，标记为s；

留下沉淀，与1ml溶液c混匀，置于65℃水浴锅，温育60min后，取出，12000转离心10min，收集上清液于2mlep管中，标记为c；

4)去除蛋白质：

将步骤3)中的标记为s和c的上清液与酚氯仿溶液等体积混匀，12000转离心5min，收集上层水相，分别转移至两个新的1.5mlep管中；

5)dna沉淀：

将步骤4)收集的水相按相同体积添加异丙醇，摇匀，12000转离心5min，丢弃上清液；

6)dna洗涤：

加入700ml70％乙醇，用枪头轻刮管壁，使管壁上的dna沉落于管底，12000转离心5min，该步骤重复2次；

7)dna保存

步骤6)处理完毕之后，风干，加入60μl含有0.01g/ml的rna酶的1×te缓冲液溶液溶解沉淀的dna。

所述步骤2)中溶液a组成如下：2-15％sds，50mmedta,100mmtris，0-0.48mnacl，用固体氢氧化钠调ph至9-10；

所述步骤3)中溶液b组成如下：10％sds，50mmedta,100mmtris；溶液c组成如下：2％ctab，0.9mnacl，50mmedta,100mmtris；

所述步骤4)中酚氯仿溶液组成如下：苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1。

所述步骤6)中1×te缓冲液组成如下：5mmedta,10mmtris-hcl

与现有技术相比，本发明具有的有益效果：

1、由于霉菌的生长是由菌丝顶端细胞的不断延伸而实现的，细胞之间结合紧密。在液体培养过程中，霉菌菌体层层加厚，若是简单的液氮研磨，无法轻易将菌块分散为粉末，不利于裂解液与菌体的有效接触，导致dna提取效率低下。所以本发明采用分析纯的石英砂同液氮一起研磨，不仅对霉菌的细胞壁的破坏大大加大，而且可以很轻松的将菌块分散成粉末。

2、菌体的细胞壁表面多呈电负性，会吸附阳离子，虽然察式培养基中的镁离子含量不算高，但是在霉菌成团生长过程中会被富集。按传统的方法操作，在研磨之后，直接加入裂解液处理，试剂中的edta量无法满足中和镁离子的要求，在该情况下按操作要求直接温育，其中的dna水解酶依旧可以发挥作用，导致基因组dna降解。本发明，对应该情况，特异添加了洗涤液溶液a，在经过实验改良之后，可以去除研磨后的菌体粉末中的大部分疏水性蛋白和培养液中的金属离子，尽可能将dna在洗涤液中的溶解量降到最小，使残留的菌体碎片中的dna含量达到总产量的90％。

3、本发明采用常见的试剂，除rna酶之外，未使用蛋白酶k等其他酶类，方便霉菌dna大量提取，易于实现和放大生产。

4、本发明使用范围广泛，可适用于所有霉菌的基因组dna提取，得到的dna基因组的纯度高，满足于后续的构建文库、dna测序等实验。

附图说明

图1为实施例1的方法提取获得的青霉素基因组dna的电泳图

泳道1:15000maker；泳道2：标记为s的管中的基因组dna；泳道3：标记为c的管中的基因组dna。

图2为实施例2的方法提取获得的青霉素基因组dna的电泳图

泳道1：15000maker；泳道2：标记为s的管中的基因组dna；泳道3：标记为c的管中的基因组dna。

图3为实施例3的方法提取获得的青霉素基因组dna的电泳图

泳道1:15000maker；泳道2：标记为c的管中的基因组dna。

图4为本发明方法、传统的ctab法、某公司基因组提取试剂盒dnaisoreagent和某公司的ezup柱式真菌基因组dna抽提试剂盒提取获得的青霉菌基因组dna的电泳图

a为本发明方法；b为传统的ctab法；c为某公司基因组提取试剂盒dnaisoreagent；d为某公司的ezup柱式真菌基因组dna抽提试剂盒。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

实施例所用的霉菌为青霉菌。实施例中察式培养基成分按质量百分数计，包括nano30.3％、na2hpo40.1％、mgso4﹒7h2o0.05％、kcl0.05％、feso40.0001％、蔗糖3％，ph自然，余量为水，121℃灭菌30min。

【实施例1】

1)预处理：

将青霉菌接种在液体培养基(察氏培养基)中，28℃下培养6天，然后将菌体收集，抽滤，尽最大可能的去除水分，称重后，取99mg菌体放入研磨器中，加入石英砂30mg，随后加入研磨器容量约1/2v的液氮。在液氮挥发时，用研磨棒按压菌体，待液氮挥发干净后，利用其中石英砂将冻实的菌体研磨成粉末。该操作重复4次，总用时大约2min。

2)细胞洗涤：

将已经研磨成粉末的菌体用勺子盛入2mlep管中，加入1ml溶液a(2％sds，50mmedta,100mmtris，0.07mnacl，ph9-10)，颠倒4次后，12000转离心10min，留下沉淀，丢弃上清液。

3)细胞裂解：

将上一步的沉淀与1ml溶液b混匀，置于65℃水浴锅中，温育30min后，取出，12000转离心10min，收集上清液于2mlep管中，标记为s。

留下沉淀，与1ml溶液c混匀，置于65℃水浴锅，温育60min后，取出，12000转离心10min，收集上清液于2mlep管中，标记为c。

4)去除蛋白质：

将步骤3)中的标记为s和c的上清液与等体积的酚氯仿混匀，12000转离心5min，收集上层水相，分别转移至两个新的1.5mlep管中。

5)dna沉淀：

将步骤4)收集的水相按相同体积添加异丙醇，摇匀，12000转离心5min，丢弃上清液。

6)dna洗涤：

加入700ml70％乙醇，用枪头轻刮管壁，使管壁上的dna沉落于管底，12000转离心5min，该步骤重复2次。

7)dna保存

步骤6)处理完毕之后，风干，加入60μl含有0.01g/ml的rna酶的1×te缓冲液溶液溶解沉淀的dna。

如图1所示，第2泳道和第3泳道分别为标记为s和c，s中共获得2.3μg，c中共获得3.5μg，a260/a230在2.0与2.5之间，碳水化合物污染较少。

【实施例2】

1)预处理：

将青霉菌接种在液体培养基(察氏培养基)中，28℃下培养6天，然后将菌体收集，抽滤，尽最大可能的去除水分，称重后，取50mg菌体放入研磨器中，加入石英砂77mg，随后加入研磨器容量约1/2v的液氮。在液氮挥发时，用研磨棒按压菌体，待液氮挥发干净后，利用其中石英砂将冻实的菌体研磨成粉末。该操作重复4次，总用时大约2min。

2)细胞洗涤：

将已经研磨成粉末的菌体用勺子盛入2mlep管中，加入1ml溶液a(10％sds，50mmedta,100mmtris，0.48mnacl，ph9-10)，颠倒4次后，12000转离心10min，留下沉淀，丢弃上清液。

3)细胞裂解：

将上一步的沉淀与1ml溶液b混匀，置于65℃水浴锅中，温育30min后，取出，12000转离心10min，收集上清液于2mlep管中，标记为s。

留下沉淀，与1ml溶液c混匀，置于65℃水浴锅，温育30min后，取出，12000转离心10min，收集上清液于2mlep管中，标记为c。

4)去除蛋白质：

将步骤3)中的标记为s和c的上清液与等体积的酚氯仿混匀，12000转离心5min，收集上层水相，分别转移至两个新的1.5mlep管中。

5)dna沉淀：

将步骤4)收集的水相按相同体积添加异丙醇，摇匀，12000转离心5min，丢弃上清液。

6)dna洗涤：

加入700ml70％乙醇，用枪头轻刮管壁，使管壁上的dna沉落于管底，12000转离心5min，该步骤重复2次。

7)dna保存

步骤6)处理完毕之后，风干，加入60μl含有0.01g/ml的rna酶的1×te缓冲液溶液溶解沉淀的dna。

如图2所示，第2泳道和第3泳道分别为标记为s和c，s中共获得2.2μg，c中共获得1.5μg，a260/a230在2.0与2.5之间，碳水化合物污染较少。

【实施例3】

1)预处理：

将青霉菌接种在液体培养基(察氏培养基)中，30℃下培养6天，然后将菌体收集，抽滤，尽最大可能的去除水分，称重后，取134mg菌体放入研磨器中，加入石英砂134mg，随后加入研磨器容量约1/4v的液氮。在液氮挥发时，用研磨棒按压菌体，待液氮挥发干净后，利用其中石英砂将冻实的菌体研磨成粉末。该操作重复6次，总用时大约3min。

2)细胞洗涤：

将已经研磨成粉末的菌体用勺子盛入2mlep管中，加入1ml溶液a(15％sds，50mmedta,100mmtris，ph9-10)，颠倒8次后，12000转离心10min，留下沉淀，丢弃上清液。

3)细胞裂解：

将上一步的沉淀与1ml溶液b混匀，置于65℃水浴锅中，温育30min后，取出，12000转离心5min，收集上清液于2mlep管中，标记为s。

留下沉淀，与1ml溶液c混匀，置于65℃水浴锅，温育60min后，取出，12000转离心10min，收集上清液于2mlep管中，标记为c。

4)去除蛋白质：

将步骤3)中的标记c的上清液与等体积的酚氯仿混匀，12000转离心5min，收集上层水相，分别转移至新的1.5mlep管中。

5)dna沉淀：

将步骤4)收集的水相按相同体积添加异丙醇，摇匀，12000转离心10min，丢弃上清液。

6)dna洗涤：

加入1ml70％乙醇，用枪头轻刮管壁，使管壁上的dna沉落于管底，12000转离心5min，该步骤重复2次。

7)dna保存

步骤6)处理完毕之后，风干，加入60μl含有0.01g/ml的rna酶的1×te缓冲液溶液溶解沉淀的dna。

如图3所示，第2泳道为标记为c的管中的dna，其中共获得3.9μg，a260/a230在2.0与2.5之间，碳水化合物污染较少。

【实施例4】本发明方法与传统的ctab法、某公司基因组提取试剂盒dnaisoreagent和某公司的ezup柱式真菌基因组dna抽提试剂盒进行比较

将本实验方法(图4，a)与传统的ctab法(图4，b)、某公司基因组提取试剂盒dnaisoreagent(图4，c)和某公司的ezup柱式真菌基因组dna抽提试剂盒(图4，d)进行比较。

dnaisoreagent试剂盒的说明书中并未阐述青霉菌的基因组dna提取的特殊处理，便按照其说明书上革兰氏阳性菌的操作方法进行使用，对应图4c可以看到，该试剂盒可较好的提取基因组dna,但是存在明显的降解现象，无法保证高质量的dna。

ezup柱式真菌基因组dna抽提试剂盒的说明书中表明，该试剂盒用于提取新鲜大型真菌(如蘑菇)，按其说明书步骤进行基因组dna提取，如图4d可以看到，该试剂盒无法提取青霉菌的基因组dna。

传统的ctab法应用广泛，不仅可以提取植物的基因组dna也可以提取大部分细菌的基因组dna，但是对于青霉菌的基因组dna的提取却显得不理想。如图4b。

经过改进的青霉菌基因组dna的提取方法不仅可以减少基因组dna的降解，并且可以保证较高的产量，如图4a。与其他三种方法的最大不同之处，可以结合实例1-3便可看出，主要利用溶液a的洗涤作用，将青霉菌进行一次洗涤，以利于后期的裂解处理和dna的质量保证。