一种复合菌剂及其在降解禽畜粪便中纤维素的应用的制作方法

本发明涉及禽畜粪便处理领域，特别涉及一种复合菌剂及其在降解禽畜粪便中纤维素的应用。

背景技术：

我国每年产生的禽畜粪便多达30亿吨，禽畜粪便中纤维素含量高，是可再生资源的重要组成部分。通过自然堆肥禽畜粪便的熟化速度慢，并且不易起温，达不到我国堆肥无害化处理标准，在堆肥中加入发酵菌剂可以促进堆肥的熟化进程，并能提高堆肥的质量，其原理是通过发酵菌剂产生纤维素酶(cellulase)，纤维素酶分解纤维素成葡萄糖，将丰富的纤维素废资源转化为再生资源，如此不仅可以实现禽畜粪便无害化，而且可解决农村环境污染并发展绿色农业，有效解决能源、饲料和食品供应不足问题。高效利用纤维素可以为工业生产提供取之不尽的生物原料和生物能源，还能极大地推动生物制品和生物肥料生产等方面的迅速发展，对人类社会意义重大。

然而，禽畜粪便熟化过程是一个温度不断变化的过程，由于发酵菌剂的微生物菌种产生纤维素酶都有某个最适温度，当堆肥温度低于或高于该最适温度时，发酵菌剂产酶效率低下甚至不产酶，导致禽畜粪便堆肥过程中纤维素的降解效率较低，费时较长。

因此，如何高效降解禽畜粪便中的纤维素，提高其使用和转化效率，在污染废弃物的利用、开辟新的环境治理和能源开发思路具有重要的理论和实践意义，特别是对环境保护和可持续发展将会起到决定性的作用。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种复合菌剂及其在降解禽畜粪便中纤维素的应用，本发明复合菌剂中的各菌种的最适产酶温度与堆肥发酵不同阶段温度相对应，两者的变化曲线相拟合匹配，各菌种协同生长，持续产酶，形成较为稳定的产纤维素酶环境，酶活稳定，堆肥过程不同发酵温度阶段都能持续产酶，可促进禽畜粪便中纤维素的分解，由于各菌种持续利用反应底物，还可提前提高禽畜粪便发酵堆肥纤维素酶活性的水平及其峰值，缩短堆肥发酵时间，对堆肥的适应性及腐熟效果好。

实现本发明目的的技术方案是，一种复合菌剂，由培养在牛肉膏蛋白胨培养基中的细菌菌种、培养在pda培养基中的真菌菌种组成，其中，所述细菌菌种的各菌种浓度为10⁸－10⁹/ml，所述真菌菌种的各菌种有效活菌数为10⁴－10⁶cfu／g。

所述细菌菌种：真菌菌种的体积比1：1。

所述细菌菌种由最适低温产酶菌、最适常温产酶菌、最适高温产酶菌组成，最适低温产酶菌、最适常温产酶菌、最适高温产酶菌的数量比为1-1.5：1：1。

所述最适低温产酶菌为假单孢菌，所述最适常温产酶菌为枯草芽孢杆菌枯草亚种，所述最适高温产酶菌为嗜热液化芽孢杆菌。

所述真菌菌种由最适低温产酶菌、最适常温产酶菌、最适高温产酶菌组成，最适低温产酶菌、最适常温产酶菌、最适高温产酶菌的数量比为1-1.5：1：1。

所述最适低温产酶菌为里氏木霉，所述最适常温产酶菌为近平滑假丝酵母菌，所述最适高温产酶菌为烟曲霉。

上述复合菌剂在降解禽畜粪便中纤维素的应用。

上述技术方案中，假单孢菌、枯草芽孢杆菌枯草亚种、嗜热液化芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨培养基中培养60－72h，培养温度28℃；里氏木霉、近平滑假丝酵母菌、烟曲霉在pda培养基中培养96－120h，培养温度26℃。

上述复合菌剂在降解禽畜粪便中纤维素的应用，具有以下步骤：

1）调节禽畜粪便中水分含量至50%-55%；

2）将复合菌剂添加到上述所得禽畜粪便中，复合菌剂与禽畜粪便的重量比为5－8%左右，混合均匀，覆盖保温，发酵降解至腐熟完毕。

采用上述技术方案具有以下有益效果：

复合菌剂中的里氏木霉、假单胞菌最适产酶温度分别为24℃、25℃，为最适低温产酶菌；近平滑假丝酵母、枯草芽孢杆菌枯草亚种最适产酶温度分别为28-30℃、37℃，为最适常温产酶菌；烟曲霉、嗜热液化芽胞杆菌的最适产酶温度分别为45℃、60℃，为最适高温产酶菌。这些最适高、常、低温产酶菌的添加比例为1：1：1-1.5，最适低温产酶菌的数量较多，使堆肥发酵起温快，各种菌的最适产酶温度与堆肥发酵不同阶段温度相对应，两者的变化曲线相拟合匹配，各菌种协同生长，产酶过程持续和衔接。在禽畜粪便堆肥过程中，随着堆肥温度的变化，每个温度阶段都有最适的产纤维素菌种大量繁殖，使得各菌种在禽畜粪便堆肥过程中各温度阶段均能持续产酶，形成稳定的产纤维素酶的微环境，有效促进堆肥过程中禽畜粪便中的纤维素降解，达到快速高效的腐熟效果。复合菌剂中的各菌种可持续利用反应底物，对堆肥的适应性强，与传统发酵菌剂堆肥方法相比，采用本发明复合菌剂可以提前提高禽畜粪便发酵堆肥纤维素酶活性的水平及峰值，禽畜粪便发酵堆体中纤维素酶活性峰值比传统发酵菌剂堆肥方法提前2-3天，且纤维素酶活性一直维持在较高水平。

本发明中，各菌种来源为：

里氏木霉（trichodermareesei）产纤维素酶，最适产酶温度24℃，购自北京中科质检生物技术有限公司。

假单胞菌（pseudomonadaceae）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：cicc10441。

近平滑假丝酵母（candidaparapsilosis）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：cicc1257。

枯草芽孢杆菌枯草亚种（bacillussubtilissubspecies）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：cicc10832。

烟曲霉（aspergillusfunigatus）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：cicc2434。

嗜热液化芽胞杆菌（bacillusthermoliquefaciens）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：cicc20647。

附图说明

图1为试验组、对照组堆肥温度变化曲线图；

图2为试验组、对照组纤维素酶活性的曲线图。

具体实施方式

一、试验组

材料准备

取养殖场禽畜粪便600kg，其有机质含量为79%，c/n（碳氮比）为16，含水量为65%，ph值为7.21。

取购买的里氏木霉、假单孢菌、近平滑假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌枯草亚种、烟曲霉、嗜热液化芽孢杆菌，其中，假单孢菌、枯草芽孢杆菌枯草亚种、嗜热液化芽孢杆菌分别在牛肉膏蛋白胨培养基中培养60－72h，至浓度均达到10⁸/ml，培养温度为28℃；其中，里氏木霉、近平滑假丝酵母菌、烟曲霉分别在pda培养基中培养96h，至有效活菌数均达到104cfu／g左右，培养温度为26℃。

将上述禽畜粪便用30kg稻壳粉调节600kg禽畜粪便水分含量至50%-55%，堆在2m*1m*0.5m的发酵箱体中。按体积比1.5：1.5：1：1：1：1取调节好浓度的里氏木霉、假单孢菌、近平滑假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌枯草亚种、烟曲霉、嗜热液化芽孢杆菌的培养液，共计30升，混合成复合菌剂后，添加进发酵箱体禽畜粪便中，搅拌均匀，并覆盖薄膜保温。

堆肥过程中，采用乙醇温度计测定堆温，记录堆肥温度变化。

堆肥过程中，每天取样检测分析堆肥物质变化情况，样品为多点混合样。采用k2cr2ｏ7容量法测定各混合样的有机质含量，采用国家农业标准ny525－2011测定各混合样中c/n，采用3.5-二硝基水杨酸显色法测定各混合样中纤维素酶活性。

二、对照组

取对照组相同重量的禽畜粪便并经同样处理后堆在2m*1m*0.5m的发酵箱体中。

取购买的近平滑假丝酵母菌，在pda培养基中培养96h至有效活菌数达到10⁴cfu／g左右，培养温度为26℃；取购买的枯草芽孢杆菌枯草亚种，在牛肉膏蛋白胨培养基中培养60－72h，至浓度均达到10⁸/ml，培养温度为28℃。

按体积比1：1取近平滑假丝酵母菌和枯草芽孢杆菌枯草亚种培养液，共计30升，添加进发酵箱体中，搅拌均匀，并覆盖薄膜保温。

堆肥过程中，采用乙醇温度计测定堆温，记录堆肥温度变化。

堆肥过程中，每天取样检测分析堆肥物质变化情况，样品为多点混合样，采用k2cr2ｏ7容量法测定各混合样的有机质含量，采用国家农业标准ny525－2011测定各混合样中c/n，采用3.5-二硝基水杨酸显色法测定各混合样中纤维素酶活性。

三、结果分析

1、温度变化

试验组

试验组逐渐有腐熟的气味，13d堆肥质地变疏松，堆肥由黑色变为黑褐色，熟化完成。整个堆肥过程中，堆肥温度呈先上升后下降的变化曲线，在3d达到最高温度63℃。

对照组逐渐有腐熟气味，18d堆肥质地变疏松，堆肥由黑色变为黑褐色，完成熟化。整个堆肥过程中，堆肥温度呈先上升后下降的变化曲线，在6d达到最高温温度56℃。

堆肥温度是从表观上判定堆肥腐熟程度的重要指标，温度通过影响微生物活性和有机物降解速率控制发酵进程。试验组与对照组相比，试验组堆肥升温早、升温快，堆肥中加入复合微生物菌剂可提高温度峰值，且高温持续时间较长，腐熟效果更好，试验组堆肥降解速率加快，纤维素降解效率提高，加快了堆肥发酵速度，缩短了堆肥发酵时间，详见图1。

2、纤维素酶活性

试验组

试验组堆肥前3d，堆肥温度升高，至最高温度63℃，堆肥中的纤维素酶活性随之升高，至发酵结束，纤维素酶活性保持在1.3u-1.6u/g，高温（63℃）之后，堆肥中的纤维素酶活性小趋势下降，直至熟化完成，纤维素酶活性保持在1.22u/g。

对照组

试验组堆肥中的纤维素酶活性在第6d达到最高1.2u/g。

酶活性直接影响堆肥的腐熟进程和发酵的强度，畜禽粪便中含有大量难以降解的纤维素，通过对堆肥中纤维素酶活性的测定，可以了解堆肥中纤维素降解的情况。由于试验组提前提高禽畜粪便发酵堆肥纤维素酶活性的水平及峰值，禽畜粪便发酵堆体中纤维素酶活性峰值比传统发酵菌剂堆肥方法提前5d，且纤维素酶活性一直维持在较高水平，详见图2。

3、有机质含量

试验组

试验组堆肥在15d有机质含量为386.3g/kg，堆肥熟化完毕后有机质含量降至61%。

对照组

对照组堆肥在15d有机质含量为436.8g/kg，堆肥熟化完毕后有机质含量降至67%。

由堆肥中有机质的变化量可知，试验组与对照组相比，试验组对禽畜粪便中有机质的降解效果更好，试验组的有机质含量下降幅度较对照组更大，表明本发明复合菌剂可有效促进禽畜粪便中有机质的降解。

4、c/n变化

试验组

试验组堆肥c/n值呈一路下降的变化趋势，熟化完毕后c/n为12.6。

对照组

对照组堆肥c/n值与有机质变化趋势基本一致，熟化完毕后c/n为14.8。

c/n是评价禽畜粪便发酵熟化度的常用方法之一，试验组熟化完毕后的c/n为12.6，对照组熟化完毕后的c/n为14.8，表明本发明复合菌剂可提高禽畜粪便熟化度。

四、结论

采用本发明复合菌剂处理禽畜粪便，与传统发酵菌剂堆肥相比，本发明复合菌剂可以提前提高禽畜粪便发酵堆肥纤维素酶活性的水平及峰值，比传统发酵菌剂堆肥提前2-3d出现，且纤维素酶活性一直持续在较高水平，利于降解禽畜粪便中大量的纤维素。

由于本发明复合菌剂中的最适高、常、低温产酶菌具有协同关系，组成的最适产酶温度与堆肥发酵不同阶段温度相对应，两者的变化曲线相拟合匹配，各菌种协同生长，堆肥发酵过程中，各温度阶段都有最适的产纤维素微生物菌种大量繁殖，持续产生纤维素酶，使复合菌剂在不同发酵温度阶段都能持续产酶，形成稳定的产纤维素酶微环境，酶活较为稳定，可有效促进堆肥过程中纤维素的降解，对堆肥的适应性及腐熟效果都要强于传统发酵菌剂堆肥，因此对农业废弃物资源化利用有着重要的现实意义。