一种22个短串联重复序列复合扩增方法及其试剂盒与流程

本发明涉及融合蛋白
技术领域：
，涉及检测人类基因组中具有多态性的遗传标记基因，尤其涉及一种22个STR(短串联重复序列)基因座和1个性别基因座的复合扩增方法及其试剂盒。
背景技术：
：短串联重复序列(简称STR)也称为微卫星或简单序列重复(SSR)，是一类广泛存在于真核生物基因组中的DNA串联重复序列，核心序列为2-6个碱基重复单位。STR基因座数量大，分布广泛，约占整个基因组的3％(InternationalHumanGenomeSequencingConsortium，2001)，而且多态性高，其多态性主要源自核心序列重复次数在个体间的差异，并且这种差异在遗传过程中遵循孟德尔遗传规律。因此，STR扩增检测技术被广泛用于法医学个体识别、亲缘鉴定和群体遗传学研究。目前STR复合扩增技术是法医学个体识别和亲子鉴定的主要技术手段，在世界各地的DNA实验室得到了广泛应用(《ForensicDNATyping》secondedition，JohnButler)。早期的STR复合扩增技术能够实现在一个反应体系中扩增10个左右的STR基因座，随着应用的广泛和数据比对的增加，10个基因座提供的信息不能满足要求，国内外的厂家开发出新的更多基因座的产品，比如美国ABI公司的AmpFlSTRIdentifiler试剂盒和美国Promega公司的16试剂盒都是15个STR基因座加性别决定基因座。国内也有类似的产品，比如公安部二所的DNATyper15能够同时实现15个STR基因座扩增(DNATyper15基因座的研究与选择，叶健等，《刑事技术》，2007年03)。但是，近年来随着DNA鉴定的应用越来越广泛，特别是在司法鉴定领域涉及的复杂亲缘关系鉴定中，由于参照样本的缺失，客观上要求检测更多的、多态性更好的STR基因座以提供更多的遗传信息。为了便于各实验室间的数据比较，目前各厂商开发的试剂盒大多包括了美国CODIS标准规定的13个核心基因座(vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、THO1、TPOX)，在此基础上，研究开发出更多的适合中国人群的STR基因座具有重要意义。由于目前法医DNA实验室普遍具有能够检测五色荧光的遗传分析仪，为了避免各STR基因座的排列拥挤、某一基因座稀有等位基因型的出现会造成与相邻基因座等位基因的交错，引起分型错误等隐患，目前最广泛的五色荧光STR试剂盒仍以20个左右的基因座位为主。同时，在法医学实践中对试剂盒获得的数据质量要求也日益提高，一方面不仅需要每个检测基因座的峰形清晰准确而且不能出现杂峰和非特异的偏离峰带；另一方面还要求可以直接扩增不同样品材料(比如：血滤纸片、唾液卡片、FTA卡等材料)，而不必对材料进行预处理，最后还要求扩增的时间尽量缩短。目前传统的STR检测试剂盒扩增时间在3至4小时左右，如果能将扩增时间控制在1.5小时内完成将大大提高检测效率和试剂盒性能。因此，司法鉴定领域需要具有一个反应扩增较多的基因座、提供较多的信息、具有更好兼容性和更快扩增速度的STR复合扩增体系，其对于满足司法鉴定的需求具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，建立了一种一次检测22个STR基因座和一个性别基因座的复合扩增方法及其试剂盒，这些STR基因座既包含了目前国内外各个生产商所采用的19个常染色体STR基因座，又包括了2个在中国人群具有良好法医学应用价值的STR基因座，还包括了1个Y染色体STR基因座，通过合理的设计和排布，进而提高分析多个STR基因座复合扩增系统的可靠性和稳定性。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明提供一种STR基因座复合扩增方法，包括如下步骤：1)制作模板DNA；2)在包含扩增引物的扩增体系中加入步骤1所得的模板DNA，在预定反应条件的热循环仪中进行PCR扩增反应，获得扩增产物；3)将步骤2)所得的扩增产物进行完全变性并保持变性状态，进行电泳检测，分析所得的检测数据，得到图谱和基因分型结果；其中，所述扩增体系用于扩增22个STR基因座和1个性别基因座，所述22个STR基因座包括vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、D1S1656、CSF1PO、PentaD、PentaE、TH01、TPOX、D10S1248、DYS391，所述性别基因座为Amelogenin；所述扩增引物包含SEQIDNO：1-46所示序列。针对上述23个基因座在其重复序列的侧翼分别设计特异性引物。引物设计采用Primer5软件，每条引物退火温度接近或高于60℃。不能产生引物二聚体、其它相互作用或交叉反应，扩增产物长度在90-450bp之间。对每对引物进行扩增测试并优化，直至得到清晰单一扩增条带。引物序列见下表1。表1复合扩增体系各基因座的引物序列为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：优选地，所述复合扩增体系25μL包括扩增引物5ul、反应缓冲液10μL和热启动TaqDNA聚合酶2U～4U。优选地，所述PCR扩增反应的反应条件为：95℃保温5分钟；94℃保温30秒钟，60℃保温40秒钟，70℃保温50秒钟，运行30个循环；60℃保温30分钟；4℃持续保温直至取出样品。优选地，所述STR基因座复合扩增方法的具体操作步骤如下：1)制作模板DNA；2)聚合酶链式反应(PCR)扩增；每25ul扩增体系(5ul扩增引物、10μL反应缓冲液和2U～4U的热启动TaqDNA聚合酶)配成混合液，混匀后分装至PCR反应管中，将2.5ul模板DNA加入PCR反应管中；按照下面的反应条件设置热循环仪：将PCR反应管放入热循环仪中开始扩增基因片段，95℃保温5分钟；94℃保温30秒钟，60℃保温40秒钟，70℃保温50秒钟，运行30个循环；60℃保温30分钟；4℃持续保温直至取出样品；3)电泳、检测取0.5ul分子量内标和10ul去离子甲酰胺，乘以样品数，配成混合液；以每管10ul混合液加入1ul扩增产物和等位基因阶梯，离心将液体收集到离心管的底部；样品95℃变性4分钟，然后迅速冰上冷却4分钟，使DNA完全变性并保持变性状态；将样品放在基因分析仪中开始电泳检测；电泳结束，分析实验数据得到图谱和基因分型结果。本发明还提供一种用于上述方法中的STR基因座复合扩增试剂盒，包含22个STR基因座和1个性别基因座的扩增引物，其中所述22个STR基因座包括vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、D1S1656、CSF1PO、PentaD、PentaE、TH01、TPOX、D10S1248、DYS391；所述性别基因座为Amelogenin。优选地，所述试剂盒中的扩增引物包含SEQIDNO：1-46所示序列。优选地，每个STR基因座和性别基因座各对应一对引物，每一对引物中的其中一个引物的5’端进行荧光素标记。优选地，将所述STR基因座和性别基因座分为四组：第一组包含D3S1358、D5S818、D2S1338、TPOX、CSF1PO、PentaD；第二组包含Amelogenin、TH01、vWA、D7S820、D21S11、PentaE；第三组包含D10S1248、D12S391、D1S1656、D18S51、D8S1179、D6S1043；第四组包含D19S433、D16S539、D13S317、FGA、DYS391。优选地，所述STR基因座和性别基因座的扩增引物为：引物第一组为SEQIDNO：1-12所示序列，引物第二组为SEQIDNO：13-24所示序列，引物第三组为SEQIDNO：25-36，引物第四组为SEQIDNO：37-46。优选地，第一组～第四组中的每个STR基因座和性别基因座各对应一对引物，每一对引物中的其中一个引物的5’端进行荧光素标记，同一组中的引物荧光素标记相同，不同组之间的引物荧光素标记不同。优选地，所述引物第一组～引物第四组的引物分别用蓝色、绿色、黄色和红色荧光素标记；其中，蓝色标记选自5-FAM、6-FAM或相近光谱的荧光素分子；绿色标记选自HEX、JOE或相近光谱的荧光素分子；黄色标记选自TMR或相近光谱的荧光素分子，红色标记选自ROX或相近光谱的荧光素分子。优选地，所述第一组～第四组在STR基因座重复序列的侧翼分别设计特异性引物，使得基因座组内各个片段峰值均衡性达到40％以上。引物第一组～引物第四组分别由不同荧光素标记，第一组～第四组中各基因座扩增产物根据长度差异分开，两个基因座不能有重叠。分别对每组引物进行复合扩增试验。确定该组没有非特异扩增现象，无交叉反应等情况后，调整每对引物的浓度，使组内各个片段峰值均衡性达到40％以上。优选地，所述引物第一组～引物第四组分别用蓝色、绿色、黄色和红色荧光素标记；每对引物中只标记一条链，标记在引物的5’端；其中，蓝色标记选自5-FAM(5-羧基荧光素)、6-FAM(6-羧基荧光素)或相近光谱的荧光素分子；绿色标记选自HEX(六氯-6-甲基荧光素)、JOE(6-羧基-4,5-二氯-2,7-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯)或相近光谱的荧光素分子；黄色标记选自TMR(4-甲基-6-羧基-罗丹明)或相近光谱的荧光素分子，红色标记选自(羧基-X-罗丹明)或相近光谱的荧光素分子。优选地，将第一组～第四组中的22个STR基因座和1个性别基因座复合扩增，根据产物峰高情况调整各基因座的引物浓度，使各基因座峰值整体均衡性达到30％以上。上述复合扩增系统中采用的扩增引物或扩增引物的组合物，所述扩增引物包含SEQIDNO：1-46所示序列，其也在本发明的保护范围之内。本发明的PCR扩增反应可在一定的缓冲体系中进行。缓冲体系中包括：50mMKCl，10mMTris-HCl(pH8.3，25℃)，2.0mMMgCl2，0.2mg/mlBSA(牛血清白蛋白)和各0.2mM的dNTP。dNTP是四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)等摩尔混合物。反应所需的DNA聚合酶为热启动耐热DNA聚合酶，抗体封闭修饰或化学修饰的均可。本发明的每个扩增体系(25μl)需要2U至4U的耐热DNA聚合酶。扩增体系在各种反应热循环仪上(如ABI9700、ABI9600、ABI2720、Bio-RadiCycler、Bio-RadC1000等)采用以下的程序可以得到较好的结果：95℃保温5分钟；94℃保温30秒钟，60℃保温40秒钟，70℃保温30秒钟，该步骤运行30个循环；60℃保温30分钟；4-10℃持续保温。本发明中的模板DNA为人类基因组DNA。由各种常规方法，比如磁珠法、酚氯仿法、树脂纯化等方法(《分子克隆实验手册》第三版，冷泉港出版社)提取的模板DNA均可以得到较好的结果。DNA可以由以下组织或细胞制备：血液(血斑)、精液(精斑)、骨骼、毛发、唾液(唾液斑)、汗液、含有胎儿细胞的羊水等。DNA模板量优选在0.5ng至4ng的范围内能够得到较好的扩增结果，模板量太低可能导致某些基因座位检测不出，模板量太高会导致非特异性的扩增产物产生。在上述反应缓冲体系中按照指定的反应程序扩增模板DNA，可以得到各基因座混合的扩增产物。本发明由于采用了荧光标记的引物，扩增产物也带有荧光标记物，并且标记物可以在激光激发下发出可以通过测序仪(如ABI377、310DNAsequencer)或遗传分析仪(如ABI3130、3100geneticanalyzer)识别的光信号，所以扩增产物可以通过测序仪或遗传分析仪等仪器上进行电泳和检测分析。在测序仪或遗传分析仪上进行检测的时候，扩增产物与分子量内标(marker，internallanestandard)、甲酰胺按照一定比例混合，进入仪器毛细管或凝胶中电泳分离。分子量内标是由多条已知长度的荧光标记DNA片段组成，用来计算PCR扩增产物片段长度，从而可以判断基因分型以及与等位基因阶梯比对。电泳后的数据可以在GeneMapper、GeneMarker、GeneScan等数据分析软件上分析，得到STR基因分型图谱和数据。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明研发的同时检测22个STR基因座和1个性别基因座Amelogenin的复合扩增体系，这些STR基因座既包含了目前国内外各个生产商所采用的19个常染色体STR基因座，又包括了2个在中国人群具有良好法医学应用价值的STR基因座，还包括了1个Y染色体STR基因座。通过国内多家单位试用，结果表明利用该体系可以一次扩增就得到22个具有良好多态性和高个体识别力的STR基因座和1个性别基因座Amelogenin信息，这些基因座组合的复合扩增系统平衡性好，灵敏度高，特异性高，分型结果准确，能够在1.5小时内实现一次反应扩增23个有效的基因座，完全能满足司法鉴定的需要。附图说明图1为DNA样本采用本发明所述的试剂盒扩增后的分析图谱；图2为DNA样本采用基点认知公司Goldeneye20A试剂盒扩增后的分析图谱。具体实施方式本发明提供了一种22个短串联重复序列复合扩增方法及其试剂盒，用于扩增22个STR基因座(包括vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、D1S1656、CSF1PO、PentaD、PentaE、TH01、TPOX、D10S1248、DYS391)和1个性别基因座(Amelogenin)；该复合扩增方法及其试剂盒中采用的扩增引物包含SEQIDNO：1-46所示序列。下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。实施例1血液由志愿者提供。模板DNA由采用chelex-100方法提取。扩增反应在ABI9700热循环仪上进行，电泳及检测在ABI31XL遗传分析仪上进行，数据分析采用GeneMapperIDv3.2软件。样品同时采用基点认知公司的Goldeneye20A试剂盒检测，操作方法按照试剂盒说明书进行，结果作为对照。本发明所用的试剂和材料诸如等位基因阶梯(ladder)均为本领域技术人员常用的常规材料。1.1.chelex-100方法提取DNA(具体方法参考《ForensicDNAProtocol》，HumanaPress，1998)；1)取3μl加抗凝剂的血液于500μl离心管中；2)振荡混匀chelex溶液，使chelex充分悬浮，每管加195μl5％的chelex-100(100-200mesh，购自Bio-Rad公司)，再加入5μl蛋白酶K(20mg/ml，购自天根生化科技有限公司)；3)振荡样品，恒温金属浴上56℃温浴2小时后，取出样品振荡2分钟；4)煮沸8-10分钟，13000rpm离心3分钟；5)小心吸出约150μl上清，转移至新管中，10μlPCR反应体系取1μl作为模板。1.2.聚合酶链式反应(PCR)扩增；1)取缓冲液、引物混合物、耐热聚合酶，按照下表配成混合液，振荡混匀后分装至PCR反应管中，每管25μl，加入模板DNA；表225μll扩增体系2)按照下面的反应条件设置热循环仪增仪(ABI9700PCR仪)，将PCR反应管放入仪器中开始扩增基因片段。95℃保温5分钟；94℃保温30秒钟，60℃保温40秒钟，70℃保温50秒钟，运行30个循环；60℃保温30分钟；4℃持续保温，直至取出样品。1.3.扩增反应结束后，取出反应管，用ABI3100遗传分析仪进行电泳和检测；1)取(0.5μl分子量内标+10μl去离子甲酰胺)×(样品数)配成混合液；2)混匀后分装，每管10μl，再分别加入1μl扩增产物和等位基因阶梯(ladder)，简短离心将液体收集到离心管管子底部；3)样品95℃变性4分钟，然后迅速冰上冷却4分钟，使DNA完全变性并且保持变性状态；4)将样品放入基因分析仪的样品托盘中，设置仪器参数(进样电压3kV，进样时间10秒钟)，开始电泳检测；5)大约40分钟后，电泳结束，用GeneMapper软件分析实验数据得到图谱及分型结果(见图1、图2及表2)。表3本发明与商品试剂盒扩增同一样本的基因分型结果基因座本发明Goldeneye20AD21S1129,3229,32FGA19,2419,24vWA15,1815,18TH016,96,9D3S135816,1716,17D8S117913,1513,15D18S5113,1813,18D16S53911,1211,12TPOX11,1111,11CSF1PO12,1212,12D13S3178,88,8D7S82010.1,1110.1,11D5S81811,1111,11AMELX,YX,YD2S133817,2217,22D19S43313,1413,14PentaD12,1312,13PentaE12,1512,15D6S104311,1311,13D12S39118,2018,20D10S124813,15无DYS39110无D1S165615,16无由上述实施例可知，本发明所述的复合扩增体系可以一次扩增就得到22个具有良好多态性和高个体识别力的STR基因座和1个性别基因座Amelogenin信息，这些基因座组合的复合扩增系统平衡性好，灵敏度高，特异性高，分型结果准确，完全能满足司法鉴定的需要。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。当前第1页1 2 3