一种高寒草地牧草内生细菌枯草芽孢杆菌菌株、微生物菌剂及其制备方法和应用与流程

本发明属于微生物领域，具体涉及一种内生枯草芽孢杆菌菌株、菌剂及其制备方法和应用。

背景技术：

随着社会发展，人们对食品安全性的要求越来越高，但是，化学农药对环境的污染和农药残留等问题，植物病害的生物防治成为了研究热点，其中尤以植物内生细菌作为拮抗菌的研究得到众多学者的观注。植物内生细菌是指生活在植物体内，但对植物没有任何实质性伤害的细菌，其具有多种生物学功能，特别是抑菌功能使其成为生防菌资源的有力支撑。植物内生细菌除可以通过分泌抑菌物质及与病原菌竞争营养空间等直接作用与病原菌外，还可以诱导植物获得抗病性阻止对植物的侵染或造成的危害。以拮抗内生细菌为菌种资源研制的微生物农药不易产生抗药性，不伤害天敌，且能利用农副产品等广泛生产，更重要的是内生细菌可以定殖于作物体内，甚至可以通过种子(苗木)传播于下一代，长期起作用，省时省力，高效，应用于农业生产后为生产绿色或无公害农产品提供了一个新的途径。

中国作为番茄栽培大国，番茄果实及其加工产品用于鲜食和出口，然而番茄病害同样为其生产带来了显著影响，特别是近年来番茄丁香假单胞叶斑病在番茄栽培区有快速蔓延趋势，给生产造成较大的损失。目前，对于该病害的防治主要通过选育抗病品种以及喷施化学药剂的方式，但农业防治方法耗时耗力，见效慢，且防治效果不太理想，而长期进行化学防治将对人畜和生态环境等的安全造成严重威胁，特别是农药残留影响鲜食番茄的安全性。所以，既高效又安全的生物防治方法迅速引起了国内外学者的关注。

枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属中最常的一个种，其数量多，且很多菌株具有抑菌功能，现有枯草芽孢杆菌报道的是该菌株对香蕉枯萎病菌、棉花枯萎病菌、棉花黄萎病菌和西瓜枯萎病菌等具有良好抑制作用，但对于番茄病害尚无报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种高寒草地牧草内生细菌枯草芽孢杆菌菌株。

本发明的第二个目的是提供一种微生物菌剂，以解决现有化学农药环保性差、易产生抗药性以及安全性差的问题。

本发明的第三个目的是提供了一种微生物菌剂的制备方法。

本发明的第四个目的是提供了一种微生物菌剂的应用。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)qly004，cgmccno.13048，分离自极端环境条件下的高寒草地针茅体内，具有抑制病原菌的能力。

优选地，所述病原菌包括有番茄丁香假单胞叶斑病菌(pseudomonassyringapv.tomato)、番茄灰霉病菌(botrytiscinerea)和番茄枯萎病菌(fusarium.oxysporum)。

一种微生物菌剂，其活性成分为权利要求1所述枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)qly004的菌体，菌株qly004的活菌数为2.48×10¹⁰cfu/ml-6.43×10¹²cfu/ml。

优选地，菌株的活菌数为4.65×10¹²cfu/ml。

优选地，所述微生物菌剂中草芽孢杆菌菌株qly004的重量百分含量为10-18％，余量为培养基。

优选地，所述培养基由以下物质组成，牛肉膏2-4g，玉米淀粉20-30g，cacl22-4g，酵母膏6-8g，蒸馏水或无离子水1000ml，所述培养基的ph值为7.5-8.5。

优选地，所述培养基由以下物质组成，牛肉膏3g、玉米淀粉25g、cacl23g、酵母膏7g，蒸馏水或无离子水1000ml，所述培养基的ph值为8.0。

上述的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：将枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)qly004菌株接入至培养基中发酵，接入量为10-18％，发酵时间为35-43h，发酵温度为28-36℃，发酵转速为170-250r/min，发酵溶氧量为75％-85％。

优选地，发酵时间为39h，发酵温度为32℃，发酵转速为210r/min，发酵溶氧量为80％。

上述的一种微生物菌剂在制备农药中的应用。

本发明枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)qly004，cgmccno.13048，已于2016年09月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。

本发明枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)qly004为内生菌，一方面由于内生枯草芽孢杆菌可定殖于植物体内，受外界环境影响小，生防作用稳定持久，甚至通过种子等途径传播于下一代，另一方面本发明内生枯草芽孢杆菌不仅对番茄灰霉病菌和番茄枯萎病菌等病原真菌有拮抗作用，且对番茄丁香假单胞叶斑病菌等细菌也有较好抑制作用；其中，对番茄丁香假单胞叶斑病菌抑菌带宽达到0.67cm以上，对番茄灰霉病菌(botrytiscinerea)的抑菌达60％，对番茄枯萎病菌抑菌率达61％。可以一菌多防，且克服现有技术中化学农药环保性差、易产生抗药性和安全性差的缺陷，具有环保性好、不易产生抗药性和安全性好的优点。

附图说明

图1是草芽孢杆菌菌株qly004的菌落形态图；

图2是草芽孢杆菌菌株qly004的菌体形态图；

图3是草芽孢杆菌菌株qly004对番茄丁香假单孢叶斑病菌的抑菌作用图；

图4是草芽孢杆菌菌株qly004的碳源筛选图；

图5是草芽孢杆菌菌株qly004的氮源筛选图；

图6是草芽孢杆菌菌株qly004的无机盐筛选图。

具体实施方式

下面的实施例可以进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：微生物菌剂

其活性成分为枯草芽孢杆菌菌株(bacillussubtilis)qly004，cgmccno.13048的菌体，其中，枯草芽孢杆菌qly004的重量百分含量为10％，余量为培养基，培养基由以下物质组成：牛肉膏2g、玉米淀粉20g、cacl22g、酵母膏6g，蒸馏水或无离子水1000ml，所述培养基的ph值为7.5，枯草芽孢杆菌qly004的活菌数为2.48×10¹⁰cfu/ml。

上述微生物菌剂的制备方法，是将枯草芽孢杆菌菌株qly004接入至培养基中发酵，接入量为10％，发酵时间为35h，发酵温度为28℃，发酵转速为170r/min，发酵溶氧量为75％。

实施例2：一种微生物菌剂

其活性成分为枯草芽孢杆菌菌株qly004的菌体，其中，枯草芽孢杆菌菌株qly004的重量百分含量为14％，培养基余量，培养基由以下物质组成：牛肉膏3g、玉米淀粉25g、cacl23g、酵母膏7g，蒸馏水或无离子水1000ml，所述培养基的ph值为8.0，草芽孢杆菌菌株qly004(cgmccno.13048)的活菌数为4.65×10¹²cfu/ml。

上述微生物菌剂的制备方法，是草芽孢杆菌菌株qly004接入至培养基中发酵，接入量为14％，发酵时间为39h，发酵温度为32℃，发酵转速为210r/min，发酵溶氧量为80％。

实施例3：一种微生物菌剂

活性成分为草芽孢杆菌菌株qly004的菌体，其中，枯草芽孢杆菌qly004的重量百分含量为18％，培养基余量，培养基由以下物质组成：牛肉膏4g、玉米淀粉30g、cacl24g、酵母膏8g，蒸馏水或无离子水1000ml，所述培养基的ph值为8.5，草芽孢杆菌菌株qly004的活菌数为6.43×10¹¹cfu/ml。

上述微生物菌剂的制备方法，是将草芽孢杆菌菌株qly004接入至培养基中发酵，接入量为18％，发酵时间为43h，发酵温度为36℃，发酵转速为250r/min，发酵溶氧量为85％。

实施例1-3的微生物菌剂可用作制备农药。

下面通过试验一至试验二，分别对本发明提供的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)qly004菌株在形态、16srdna基因序列进行鉴定。

试验一：对枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)qly004菌株的形态鉴定：

将枯草芽孢杆菌菌株qly006接种于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，28℃培养3d的培养性状为：菌落圆形，边缘隆起和光滑，中心下陷，淡红色，大小1.5-2.5mm(图1)；qly004(cgmccno.13048)菌体呈兰氏阳性，杆状(图2)，大小为0.53～1.07μm×0.61～1.90μm。

试验二：对枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)qly004菌株的16srdna基因序列鉴定：

将枯草芽孢杆菌菌株qly006的16srdna基因序列在genebank中与枯草芽孢杆菌(b.subtilis)(hq443223和hq143563)的同源性在99％以上，并在系统发育树上聚在一起，结合形态特征，将qly004鉴定为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。

下面通过试验三和试验四对枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)qly004菌株的室内抑菌活性和田间防治效果进行测定。

试验三：枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)qly004菌株室内抑菌活性测定：

首次筛选出内生细菌枯草芽孢杆菌菌株(bacillussubtilis)qly004，cgmccno.13048拮抗菌株，将该拮抗菌株接种于qly004培养基中进行培养；同时，将番茄丁香假单胞叶斑病菌接种于牛肉膏蛋白胨(即na)平板培养基中进行培养。当拮抗菌株和指示菌株在各自的培养基中培养活化后，在100ml溶解后冷却至45℃左右的na培养基中加入lml指示菌(病原菌菌液)(含菌量cfu/10⁸ml)混匀，后在含菌平板上分别等距离接种拮抗菌株，3次重复，28℃恒温培养，48h后用十字法重复测量其抑菌透明圈宽度并记录数据，在本试验中重复测定3次。将番茄灰霉病菌和番茄枯萎病菌接种于马铃薯琼脂糖培养基(即pda培养基)进行活化。当拮抗菌株、番茄灰霉病菌和番茄枯萎病菌在各自的培养基中培养活化后，分别用打孔器打成直径为6mm的菌饼。选取番茄灰霉病菌的菌饼一块，置于pda培养基中；具体的，可以将该菌饼接种于盛装pda培养基的平皿的中央位置(平皿直径9cm)；再选取由拮抗菌株得到的菌饼四块，根据对峙法，将该四块菌饼等距接种于距该平皿中央位置为2.5cm的圆周上。将该培养皿在25℃的环境温度下培养5天后，测定该pda培养基中上述菌株的抑菌圈直径并记录数据，在本试验中重复测定3次。

枯草芽孢杆菌菌株qly004对番茄丁香假单胞叶斑病菌的抑菌带宽为0.67cm(图3)，且拮抗效果强且稳定，对番茄灰霉病菌的抑菌率达60％，对番茄枯萎病菌的抑菌率达61％，说明枯草芽孢杆菌菌株qly004具有开发为防治番茄细菌性叶斑病、番茄灰霉病和番茄枯萎病的生物农药的潜力。

试验四：枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)qly004，cgmccno.13048菌剂对番茄细菌性叶斑病的的防治效果测定：

在室内将枯草芽孢杆菌菌株qly004和番茄丁香假单胞叶斑病菌分别经na摇瓶液体培养24h后，先将番茄丁香假单胞叶斑病菌通过伤口接种法接种于健康的番茄植株叶片上，24h后再接种枯草芽孢杆菌菌株qly004菌悬液，保湿48h后在室内条件下待其发病，12d后观察发病情况，计算发病率、病情指数及枯草芽孢杆菌菌株qly004对番茄叶斑病的相对防治效果。叶斑病病情指数分级标准为：0级：叶片无病斑；1级：0＜病斑面积占总叶片面积≤10％；2级：10％＜病斑面积占总叶片面积≤25％；3级：25％＜病斑面积占总叶片面积≤50％；4级：50％＜病斑面积占总叶片面积≤75％；5级：75％＜病斑面积占总叶片面积≤100％。计算方法如下：

发病率＝发病叶片数/调查总叶片数×100％

病情指数＝∑(各级发病数×各级代表值)/(调查总叶数×最高代表值)×100

防病效果＝(病原菌对照的病情指数-生防菌处理的病情指数)/病原菌对照的病情指数

×100％

结果表明，将枯草芽孢杆菌菌株qly004发酵液接种12d后，番茄丁香假单孢叶斑病的病情指数为28.33％，对照组病情指数55.06％，枯草芽孢杆菌菌株qly004对番茄丁香假单孢叶斑病的防效为59％，说明枯草芽孢杆菌菌株qly004对番茄丁香假单孢叶斑病表现出较好的防治效果，具备良好的开发潜力。

下面通过试验五和实验六对枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)qly004，cgmccno.13048菌株的最适培养基及其微生物菌剂的性能进行检测。

试验五：确定枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)菌株qly004的最适培养基：

1.种子液制备

将已活化的新鲜枯草芽孢杆菌菌株qly004菌株接至na培养液(80ml/150ml三角瓶)中，振荡培养(210r/min，28℃)32h，制得种子液。

2.碳、氮源及无机盐离子的筛选

供试碳源为a蔗糖；b玉米淀粉；c水溶性淀粉；d麦芽糖；e乳糖；f不加糖；ck基础培养基。将以上碳源分别替换基础培养液(40ml/150ml三角瓶)中的葡萄糖，灭菌后接入种子液2ml，振荡培养(180r/min，28℃)24h，每处理设3次重复，测定发酵液吸光度值(od600)，结果表明，枯草芽孢杆菌菌株qly004(cgmccno.13048)菌株的最适碳源为玉米淀粉，促生作用显著大于其他碳源(p<0.05)(图4)。

供试氮源为a尿素；b(nh4)2so4；ckno3；dnh4cl；e酵母膏；f不加氮；ck基础培养基。将以上氮源分别替换基础培养基中的蛋白胨，灭菌后接入种子液2ml，振荡培养(180r/min，28℃)24h，每处理设3次重复，测定发酵液吸光度值(od600)，结果表明，草芽孢杆菌菌株qly004(cgmccno.13048)菌株的最适氮源为酵母膏，且显著高于其他氮源(p<0.05)，(图5)。

无机盐离子为amgso4；bkh2po4；cmnso4；dcuso4；ecacl2；f不加无机盐离子；ck基础培养基。将以上无机盐离子分别替换基础培养基的nacl，灭菌后接入种子液2ml，振荡培养(180r/min，28℃)24h，每处理设3次重复，测定发酵液吸光度值(od600)，结果表明，草芽孢杆菌菌株qly004菌株的最适无机盐为cacl2，且与其他无机盐差异显著(p<0.05)，(图6)。

在确定玉米淀粉、酵母膏和cacl2为最适草芽孢杆菌菌株qly004的碳源、氮源和无机盐的基础上，进一步按不同浓度进行l9(3³)正交试验(表1)，28℃，180r/min摇床振荡培养24h，通过检测发酵液吸光值(od600)确定枯草芽孢杆菌菌株qly004的最适碳源浓度为玉米淀粉20-30g/l，氮源酵母膏浓度为6-8g/l，无机盐浓度分别为cacl22-4g/l，在此条件下的生物量(od600值)均显著高于其他碳、氮源及无机盐离子浓度条件下的(p<0.05)。

表1

3.发酵条件优化

设定ph参数为6、6.5、7、7.5、8，温度为20、24、28、32和36℃，摇床转速为120、150、180、210、240和270r/min，接种量为2％、6％、10％、14％和18％，最佳供氧量为45％、55％、65％、75％和85％，在最佳培养基的基础上，以上各条件下培养生防菌株，通过检测发酵液吸光度值(od600)确定最适ph值为7.5-8.5、最适温度为28-36℃、最适的接种量为10％-18％、最适溶氧量为75％-85％和最适转速为170-250r/min；在筛选得到的最佳培养基、温度、转速和供氧量等的基础上，对草芽孢杆菌菌株qly004(cgmccno.13048)株进行连续培养，每隔3h取样，3次重复处理，测定发酵液吸光度值(od600)，确定100l发酵罐中最佳发酵时间为35-43h。

试验六：对枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)qly004，cgmccno.13048微生物菌剂的活性进行检测：

在上述试验五中已确定草芽孢杆菌菌株qly004的最适培养基的基础上，将保存在斜面培养基中的草芽孢杆菌菌株qly004在营养琼脂(nutrientagar，简称na)培养基的平皿上培养活化24h后，接种于营养肉汤(nutrientbroth，简称nb)培养基中；培养24h之后，以1％的接种量接入种子发酵罐中培养24h之后，转接种于100l的发酵罐中进行发酵，以发酵液中活菌数为指标，分别对溶氧量、转速、ph值和接种量进行优化，最终草芽孢杆菌菌株qly004(cgmccno.13048)在100l发酵罐中的最适发酵条件为：温度28-36℃，ph值为7.5-8.5，转速为170-250r/min，接种量10％-18％，溶氧量为75％-85％的条件下，进行液体发酵35-43h，活菌数为2.48×10¹⁰cfu/ml-4.65×10¹²cfu/ml。

将草芽孢杆菌菌株qly004(cgmccno.13048)在上述发酵条件的发酵罐中发酵，即可制得到具有良好防病能力的微生物菌剂。其中，在温度为32℃，接种量为14％，ph值为8.0，溶氧量80％，转速为210r/min和培养时间为39h的发酵条件下，发酵液中活菌数可以达到4.65×10¹²cfu/ml。

经试验验证，上述草芽孢杆菌菌株qly004，cgmccno.13048微生物菌剂，适宜于防治番茄丁香假单孢叶斑病、番茄枯萎病和番茄灰霉病病。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。