本发明属于医药领域，具体涉及一种具有dna甲基转移酶和组蛋白去乙酰化酶抑制活性的异羟肟酸衍生物及其制备方法与应用。
背景技术：
癌症是当今引起人类死亡的第一病因，研发高效低毒的抗肿瘤药物迫在眉睫。肿瘤的发生和发展既与基因异常密切相关，也与表观遗传改变有着紧密的关系。与基因异常(如癌基因或抑癌基因的扩增、易位、删除及点突变)不同，表观遗传的改变不涉及dna序列的变化，能在细胞分裂中保持亲本的遗传信息，但一定条件下可以发生逆转，使恶性细胞群体转变为正常的细胞。因此在表观遗传中起调控作用的酶被认为是抗肿瘤药物研发的新一代靶点。
dna甲基转移酶(dnamethyltransferases,dnmts)和组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylases,hdacs)分别催化dna的甲基化和组蛋白的去乙酰化，是表观遗传的重要调控方式。dnmts和hdacs在细胞中高表达能沉默抑癌基因，促进肿瘤的发生和发展。大量的dnmts抑制剂和hdacs抑制剂被研发出来以治疗肿瘤，一些dnmts抑制剂和hdacs抑制剂在临床中表现出良好的抗肿瘤效果，目前已有两个dnmts抑制剂(阿扎胞苷，地西他滨)和五个hdacs抑制剂(vorinostat,romidepsin,belinostat,panobinostat,chidamide)上市。
dna甲基化、组蛋白去乙酰化和染色质重塑在生理功能上具有紧密的联系，一起影响抑癌基因的表达。dnmts和hdacs也能通过直接或间接的方式相互影响。一方面，研究发现单用dnmts或hdacs的抑制剂时，另一个酶的高表达仍能导致肿瘤抑癌基因的沉默，这样的代偿机制使得肿瘤细胞产生耐药性，降低了治疗效果。另一方面，临床研究表明低剂量的dnmt抑制剂和hdac抑制剂联合用药具有明显的协同效应。因此同时靶向dnmts和hdacs的抑制剂可能能更有效地使沉默的抑癌基因重新表达，且使肿瘤细胞更难以产生耐药性，但目前还没有这方面的报导。
技术实现要素：
本发明的目的之一是提供一类具有dnmts和hdacs抑制活性的异羟肟酸类多靶点抑制剂及其制备方法。
本发明所提供的异羟肟酸类多靶点抑制剂，其结构式如式ⅰ所示。
上述式i中，ar为芳香基团，所述芳香基团选自取代的或非取代的苯环、取代的或非取代的芳香杂环、取代的或非取代的苯并杂环、取代的或非取代的芳香杂环并杂环；
优选地，所述芳杂环选自4元、5元、6元或7元芳杂环，杂环上包含1、2或3个杂原子，杂原子独立地选自n、s、o；
所述芳杂环选自吡啶基、吡啶基-n-氧化物、嘧啶基、哒嗪基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、咪唑基、吡喃基、吡咯；
所述苯并杂环选自喹啉、异喹啉基、嘌呤基、吲哚基、苯并咪唑、吡咯并吡啶、二氢苯并二噁英、苯并间二氧杂环戊烯；
芳香基团上的取代基为1-5个，优选为1、2、3、4或5个；取代基选自c1-c6的烷基、c1-c6的烯基、c1-c6的炔基、羟基、硝基、甲氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、氨基、丙烯酰胺基、氰基、氟基、氯基、溴基、碘基；
优选地，所述芳香基团选自
n＝1、2、3、4、5或6；
l1的连接位置为苯环的邻位，间位或对位；l1为碳键或烷基链，包括但不限于亚甲基，乙撑基，乙烯基，乙炔基。
上述式i所示化合物药学上可接受的盐也属于本发明的保护范围。
其中，所述药学上可接受的盐为无机酸盐或有机酸盐。
所述无机酸盐选自下述任意一种无机酸形成的盐：盐酸、硫酸或磷酸。
所述有机酸盐选自下述任意一种有机酸形成的盐：乙酸、三氟乙酸、丙二酸、柠檬酸和对甲苯磺酸。
上述式i所示的异羟肟酸衍生物优选为下述任意一种：
上述式i所示的异羟肟酸类化合物是按照包括下述步骤的方法制备得到的；
1)在缩合剂作用下，将式ii所示的化合物与式iii所示的化合物进行反应得到式iv所示的化合物；或将式ii所示的化合物与氯化亚砜、草酰氯或三氯氧磷制备成相应的酰氯衍生物后与式iii所示的化合物进行反应得到式iv所示的化合物；
式ii、iii或iv中的ar、n或l1与式i中对应的ar、n或l1的定义相同；
式iii中，r为c1-c4的烷基。
2)将式ⅳ所示化合物与羟胺或盐酸羟胺在碱性溶液中反应，得到式i所示化合物。
上述方法步骤1)中，所述缩合剂选自下述至少一种：苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯n,n'-羰基二咪唑、二环已基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺等。
所述步骤1)的反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、氯仿、二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃、乙腈等中的一种或多种。
步骤1)所述缩合剂与式ii所示的化合物、式iii所示的化合物的摩尔比可以依次为1-4:1-2:1-4，具体可为1.5:1:1.1。
所述步骤1)的反应的反应温度为20-80℃，反应时间为3-12小时。
上述方法步骤2)中，所述碱选自氨水、三乙胺、二异丙基乙基胺、氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾等中的一种或多种。
所述步骤2)的反应在水溶液或有机溶剂中进行，有机溶剂选自二甲基甲酰胺、氯仿、二氯甲烷、甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、乙腈等中的一种或多种。
式ⅳ所示化合物与羟胺或盐酸羟胺、碱反应的摩尔比为1:1-10:1-20，具体可为1:5:5。
所述步骤2)反应的反应温度为20-80℃，反应时间为0.5-10小时；
本发明制备的化合物经过高分辨质谱，核磁共振，熔点等测试，证明所制备的化合物正确无误，为通式ⅰ所示化合物。
本发明的再一个目的是提供式ⅰ所示化合物及其药学上可接受的盐的应用。
本发明式ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐的的用途是其在下述方面的应用：
1)在制备dna甲基转移酶和/或组蛋白去乙酰化酶抑制剂中的应用；
2)在制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用；
3)在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。
所述dna甲基转移酶(dnmts)包括在哺乳动物细胞中已知的亚型(dnmt1，dnmt3a，dnmt3b)；所述组蛋白去乙酰化酶(hdacs)包括在哺乳动物细胞中已知的亚型，主要包括但不限于hdac1，hdac2，hdac3，hdac8，hdac4，hdac5，hdac7，hdac9，hdac6，hdac10，hdac11。
所述真核生物为哺乳动物；所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞为白血病癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、脑癌细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞、胃癌细胞、鼻咽癌细胞、结肠癌细胞、膀胱癌细胞或直肠癌细胞；优选为为人慢性髓原白血病细胞和人组织细胞淋巴瘤细胞。
所述白血病癌细胞具体为人慢性粒细胞白血病(cml)细胞系k562，所述淋巴瘤细胞具体为人组织细胞淋巴瘤细胞u937，所述肺癌细胞具体为人肺癌细胞nci-h520，所述人脑胶质瘤细胞具体为u251，所述黑色素癌细胞具体为a375，所述胶质母细胞瘤细胞具体为人胶质母细胞瘤细胞a172和人脑星形胶质母细胞瘤细胞u-118mg，所述宫颈癌细胞具体为人宫颈癌细胞系hela，所述鼻咽癌细胞具体为鼻咽癌细胞株cne-2，所述肝癌细胞具体为人肝癌细胞株hepg2，所述乳腺癌细胞具体为人乳腺癌细胞mcf-7和mda-mb-231。
所述肿瘤为癌；所述癌为白血病、淋巴瘤、肺癌、黑色素癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、鼻咽癌、肝癌、乳腺癌、脑癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、皮肤癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌或直肠癌。
本发明式ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐也可用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物。
以式ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐为有效成分制备的预防和/或治疗肿瘤的药物，也属于本发明的保护范围。
用式ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐制备的dna甲基转移酶和/或组蛋白去乙酰化酶抑制剂、真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂以及预防和/或治疗肿瘤的药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
用式ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐制备的预防和/或治疗肿瘤药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明提供的化合物经过多种肿瘤细胞系测试(包括白血病细胞、淋巴瘤细胞等)以及dna甲基转移酶，组蛋白去乙酰化酶抑制活性测试，证明式ⅰ所示化合物是一种潜在的对dna甲基转移酶和组蛋白去乙酰化酶有抑制活性的抗肿瘤药物。本发明提供的化合物原料易得，制备方法简单，实验证明其有良好的抗癌效果，在抗肿瘤药物设计研发领域有着良好的应用前景。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明的范围并不限定于此。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为有机合成的常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均从商业途径获得。
实施例1
5-氯-n-(4-(3-(羟胺基)-3-丙酰)苯乙基)-2-甲氧基苯甲酰胺(化合物1)
实施例1a
叔丁基(4-溴苯乙基)氨基甲酸酯
将4-溴苯乙胺(10g，50mmol)溶于250毫升二氯甲烷中，加入二碳酸二叔丁酯(12g，55mmol)，室温下搅拌3小时，依次以饱和氯化铵水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、水、饱和食盐水洗涤反应液，有机相经无水硫酸镁干燥后旋干得粗品。乙醚中结晶得到标题化合物(白色固体，14.70g，98％产率)。1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.42(d,j＝8.4hz,2h),7.07(d,j＝8.3hz,2h),4.51(s,1h),3.35(br,2h),2.75(t,j＝7.0hz,2h),1.43(s,9h).
实施例1b
(e)-3-(4-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙基)苯基)丙烯酸甲酯
将实施例1a(3.0g,10mmol)、无水碳酸钾(2.764g，20mmol)，催化量二三苯基膦二氯化钯置于50ml圆底烧瓶中，加入二甲基甲酰胺(dmf)30ml，真空除氧并以氮气置换后加入丙烯酸甲酯(1.8ml，20mmol)。于120～130℃反应过夜。反应结束后加入水并以乙酸乙酯萃取。有机相经无水硫酸镁干燥后旋干，并以去离子水洗涤后得到标题化合物(白色固体，2.53g，83％产率)。1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.68(d,j＝16.0hz,1h),7.47(d,j＝7.8hz,2h),7.22(d,j＝7.8hz,2h),6.42(d,j＝16.1hz,1h),4.59(s,1h),3.81(s,3h),3.43–3.31(m,2h),2.82(t,j＝7.0hz,2h),1.34(s,9h).
实施例1c
3-(4-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙基)苯基)丙酸甲酯
将实施例1b(3.05g，10mmol)溶于200ml甲醇中，加入300mg10％质量分数的钯碳，在2个大气压的氢气下于高压反应釜中回流3h。之后过滤，旋除滤液后得到标题化合物(白色固体，3.00g，98％得率)。1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.24–6.96(m,4h),4.54(s,1h),3.67(s,3h),3.36(d,j＝6.3hz,2h),2.93(t,j＝7.8hz,2h),2.76(t,j＝7.0hz,2h),2.70–2.55(m,2h),1.43(s,9h).
实施例1d
3-(4-(2-氨乙基)苯基)丙酸甲酯
将实施例1c(2.54g，8.28mmol)溶于二氯甲烷(40ml)中，冰浴下滴加三氟乙酸(12ml,165mmol)，之后室温反应3h。以旋转蒸发仪旋除液体，加入碳酸氢钠水溶液并以乙酸乙酯萃取。有机相经无水硫酸钠干燥后除去乙酸乙酯，粗品在乙醚中重结晶得到标题化合物(淡黄色固体，1.42g，83％得率)。1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.16–7.08(m,4h),3.67(s,3h),2.99–2.88(m,4h),2.72(t,j＝6.9hz,2h),2.64–2.60(m,2h).
实施例1e
3-(4-(2-(5-氯-2-甲氧基苯甲酰胺基)乙基)苯基)丙酸甲酯
将实施例1d(621mg，3mmol)、2-甲氧基-5-氯-苯甲酸(839mg，4.5mmol)、缩合剂hbtu(2.56g，6.75mmol)以及dmap(73mg，0.6mmol)溶于dmf中，室温反应过夜。反应结束后硅胶柱色谱分离得标题化合物(白色固体，844mg，75％得率)。1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ8.17(d,j＝2.8hz,1h),7.81(s,1h),7.36(dd,j＝8.8,2.8hz,1h),7.18(s,4h),6.85(d,j＝8.8hz,1h),3.75(s,3h),3.72(t,j＝6.8hz,3h),3.67(s,3h),2.95(t,j＝7.8hz,2h),2.89(t,j＝6.8hz,2h),2.63(t,j＝7.8hz,2h)；13cnmr(101mhz,cdcl3)δ172.71,163.27,155.35,138.12,136.56,131.60,131.40,128.46,127.91,126.15,122.42,112.19,55.49,51.06,40.34,35.11,34.54,29.94.
实施例1f
5-氯-n-(4-(3-(羟胺基)-3-丙酰)苯乙基)-2-甲氧基苯甲酰胺
将实施例1e(100mg，0.26mmol)加入到甲醇(2ml)中，接着加入盐酸羟胺(180mg，2.6mmol)和叔丁醇钠(375mg，3.9mmol)，室温下反应过夜。反应结束后除去反应溶剂并柱色谱分离得标题化合物(淡黄色固体，31mg，32％得率)。熔点170～172℃，1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.36(s,1h),8.70(s,1h),8.23(t,j＝5.6hz,1h),7.66(d,j＝2.8hz,1h),7.50(dd,j＝8.9,2.8hz,1h),7.20–7.11(m,5h),3.81(s,3h),3.48(q,j＝6.8hz,2h),2.78(t,j＝7.5hz,4h),2.25(t,j＝7.7hz,2h)；13cnmr(101mhz,dmso)δ168.15,163.33,155.63,138.77,136.79,131.42,129.48,128.51,128.14,124.61,124.24,114.09,56.18,40.67,34.40,33.76,30.36.hrms(esi)m/z计算值[m-h]-375.1112,实测值375.1122.
实施例2
(e)-5-氯-n-(4-(3-(羟氨基)-3-氧代丙基-1-烯基)苯乙基)-2-甲氧基苯甲酰胺(化合物2)
实施例2a
(e)-3-(4-(2-氨乙基)苯基)丙烯酸甲酯
将实施例1b(2.53g，8.28mmol)溶于二氯甲烷(40ml)中，冰浴下滴加三氟乙酸(12ml,165mmol)，之后室温反应3h。以旋转蒸发仪旋除液体，加入碳酸氢钠水溶液并以乙酸乙酯萃取。有机相经无水硫酸钠干燥后除去乙酸乙酯，粗品在乙醚中重结晶得到标题化合物(淡黄色固体，1.15g，67％得率)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.75(br,2h),7.74–7.60(m,3h),7.32(d,j＝8.0hz,2h),6.64(d,j＝16.0hz,1h),3.73(s,3h),3.06(t,j＝7.8hz,1h),2.88(t,j＝7.9hz,2h)；13cnmr(101mhz,dmso)δ166.57,144.11,139.98,132.49,129.19,128.52,117.37,51.34,33.12,33.05.
实施例2b
(e)-3-(4-(2-(5-氯-2-甲氧基苯甲酰胺)乙基)苯基)丙烯酸甲酯
将实施例2a(615mg，3mmol)、2-甲氧基-5-氯-苯甲酸(839mg，4.5mmol)、缩合剂hbtu(2.56g，6.75mmol)以及dmap(73mg，0.6mmol)溶于dmf中，室温反应过夜。反应结束后硅胶柱色谱分离得标题化合物(白色固体，908mg，81％得率)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.26(t,j＝5.6hz,1h),7.73–7.57(m,4h),7.50(dd,j＝8.8,2.8hz,1h),7.32(d,j＝8.0hz,2h),7.15(d,j＝8.9hz,1h),6.62(d,j＝16.1hz,1h),3.81(s,3h),3.72(s,3h),3.52(dt,j＝5.6,7.1hz,2h),2.87(t,j＝7.1hz,2h)；13cnmr(101mhz,dmso)δ166.62,163.44,155.61,144.31,142.20,131.96,131.37,129.43,129.22,128.32,124.73,124.24,117.01,114.08,56.17,51.29,40.29,34.65.
实施例2c
(e)-5-氯-n-(4-(3-(羟氨基)-3-氧代丙基-1-烯基)苯乙基)-2-甲氧基苯甲酰胺
将实施例1e(100mg，0.27mmol)加入到甲醇(2ml)中，接着加入盐酸羟胺(180mg，2.6mmol)和叔丁醇钠(375mg，3.9mmol)，室温下反应过夜。反应结束后除去反应溶剂并柱色谱分离得标题化合物(淡黄色固体，37mg，37％得率)。熔点158～160℃，1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.74(s,1h),9.04(s,1h),8.26(t,j＝5.6hz,1h),7.63(d,j＝2.8hz,1h),7.56–7.48(m,3h),7.44(d,j＝15.7hz,1h),7.30(d,j＝7.8hz,2h),7.15(d,j＝8.9hz,1h),6.43(d,j＝15.8hz,1h),3.82(s,3h),3.51(q,j＝6.7hz,2h),2.85(t,j＝7.1hz,2h)；13cnmr(101mhz,dmso)δ163.43,155.62,140.93,132.82,131.37,129.44,129.19,127.41,124.77,124.26,118.37,114.11,56.18,40.36,34.61.hrms(esi)m/z计算值[m+h]+375.1112,实测值375.1122.
实施例3
(e)-5-氯-n-(3-(3-(羟氨基)-3-氧代丙基-1-烯基)苯乙基)-2-甲氧基苯甲酰胺(化合物3)
实施例3a
叔丁基(3-溴苯乙基)氨基甲酸酯
以间溴苯乙胺为原料，制备方法同实施例1a。得率为97％。1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.36(dd,j＝7.5,1.4hz,2h),7.21–7.15(m,1h),7.12(d,j＝7.7hz,1h),4.55(s,1h),3.36(q,j＝6.8hz,2h),2.77(t,j＝7.1hz,2h),1.44(s,9h).
实施例3b
(e)-3-(3-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙基)苯基)丙烯酸甲酯
以实施例3a为原料，制备方法同实施例1b。得率为86％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.64(d,j＝16.1hz,1h),7.58–7.48(m,2h),7.34(t,j＝7.8hz,1h),7.26(d,j＝7.6hz,1h),6.92(t,j＝5.6hz,1h),6.63(d,j＝16.0hz,1h),3.73(s,3h),3.26–3.04(m,2h),2.72(t,j＝7.3hz,2h),1.36(s,9h)；13cnmr(101mhz,dmso)δ166.54,155.41,144.55,140.14,133.84,130.83,128.72,128.34,126.10,117.56,77.38,54.78,51.34,40.97,34.99,28.13.
实施例3c
(e)-3-(3-(2-氨乙基)苯基)丙烯酸甲酯
以实施例3b为原料，制备方法同实施例2a。得率为72％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.98(br,2h),7.72–7.56(m,3h),7.39(t,j＝7.6hz,1h),7.33(d,j＝7.6hz,1h),6.68(d,j＝16.1hz,1h),3.73(s,1h),3.07(t,j＝7.9hz,1h),2.91(br,1h)；13cnmr(101mhz,dmso)δ166.52,144.31,138.12,134.19,130.78,129.07,128.39,126.74,117.94,51.39,32.84.
实施例3d
(e)-3-(3-(2-(5-氯-2-甲氧基苯甲酰胺基)乙基)苯基)丙烯酸甲酯
以实施例3c为原料，制备方法同实施例2b。得率为77％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.26(t,j＝5.7hz,1h),7.69–7.56(m,4h),7.50(dd,j＝8.8,2.8hz,1h),7.38(t,j＝7.5hz,1h),7.33(t,j＝7.6hz,1h),7.15(d,j＝8.9hz,1h),6.65(d,j＝16.0hz,1h),3.79(s,3h),3.73(s,3h),3.54(dt,j＝5.7,7.1hz,2h),2.86(t,j＝7.1hz,2h)；13cnmr(101mhz,dmso)δ166.54,163.49,155.56,144.48,140.10,133.94,131.32,130.88,129.36,128.84,128.45,126.28,124.88,124.22,117.67,114.05,56.14,51.36,40.23,34.45.
实施例3e
(e)-5-氯-n-(3-(3-(羟氨基)-3-氧代丙基-1-烯基)苯乙基)-2-甲氧基苯甲酰胺
以实施例3d为原料，制备方法同实施例2c。得率为35％。熔点124～126℃，1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.27(t,j＝5.6hz,1h),7.63(d,j＝2.8hz,1h),7.50(dd,j＝8.8,2.8hz,1h),7.48–7.38(m,3h),7.36(t,j＝7.5hz,1h),7.27(d,j＝7.5hz,1h),7.15(d,j＝8.9hz,1h),6.47(d,j＝15.8hz,1h),3.80(s,3h),3.53(q,j＝6.7hz,2h),2.85(t,j＝7.1hz,2h)；13cnmr(101mhz,dmso)δ163.45,162.59,155.59,139.98,137.80,134.92,131.36,129.71,129.41,128.85,127.56,125.38,124.76,124.24,119.25,114.07,56.15,40.44,34.63.hrms(esi)m/z计算值[m-h]-373.0955,实测值373.0954.
实施例4
(e)-2-氯-n-(4-(3-(羟氨基)-3-氧代丙基-1-烯基)苯乙基)-5-(三氟甲基)苯甲酰胺(化
合物4)
实施例4a
(e)-3-(4-(2-(2-氯-5-(三氟甲基)苯甲酰胺基)乙基)苯基)丙烯酸甲酯
以2-氯-5-(三氟甲基)苯甲酸和实施例2a为原料，制备方法同实施例2b。得率为65％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.70(t,j＝5.6hz,1h),7.81(dd,j＝8.5,2.2hz,1h),7.74(d,j＝8.4hz,1h),7.70–7.56(m,4h),7.33(d,j＝7.9hz,2h),6.61(d,j＝16.1hz,1h),3.72(s,3h),3.51(td,j＝5.6,7.1hz,2h),2.88(t,j＝7.1hz,2h)；19fnmr(376mhz,dmso)δ-61.17；13cnmr(101mhz,dmso)δ166.61,164.75,144.30,142.00,137.68,134.33,131.98,130.73,129.30,128.25,127.74,127.22,125.49,124.77,116.98,51.30,40.05,34.49.
实施例4b
(e)-2-氯-n-(4-(3-(羟氨基)-3-氧代丙基-1-烯基)苯乙基)-5-(三氟甲基)苯甲酰胺
以实施例4a为原料，制备方法同实施例2c。得率为29％。熔点162～163℃，1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.72(s,1h),9.03(s,1h),8.69(t,j＝5.6hz,1h),7.81(dd,j＝8.4,2.3hz,1h),7.74(d,j＝8.4hz,1h),7.63(d,j＝2.2hz,1h),7.50(d,j＝7.8hz,2h),7.43(d,j＝15.7hz,1h),7.31(d,j＝7.8hz,2h),6.43(d,j＝15.8hz,1h),3.50(q,j＝6.7hz,2h),2.87(t,j＝7.2hz,2h)；13cnmr(101mhz,dmso)δ164.74,140.73,137.98,137.70,134.32,132.82,130.72,129.28,127.75,127.42,127.33,125.50,125.46,124.78,122.07,118.31,39.15,38.97,34.45.hrms(esi)m/z计算值[m-h]-411.0723,实测值411.0717.
实施例5
(e)-4-羟基-n-(4-(3-(羟氨基)-3-氧代丙基-1-烯基)苯乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺(化合物5)
实施例5a
(e)-3-(4-(2-(4-羟基-3-甲氧基苯甲酰胺基)乙基)苯基)丙烯酸甲酯
以4-羟基-3-甲氧基苯甲酸和实施例2a为原料，制备方法同实施例2b。得率为69％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.56(s,1h),8.36(t,j＝5.6hz,1h),7.77–7.55(m,3h),7.47–7.21(m,4h),6.80(d,j＝8.3hz,1h),6.61(d,j＝16.0hz,1h),3.80(s,3h),3.72(s,3h),3.47(dt,j＝5.6,7.3hz,2h),2.87(t,j＝7.3hz,2h)；13cnmr(101mhz,dmso)δ166.63,165.76,149.28,146.98,144.35,142.48,131.84,129.17,128.31,125.50,120.47,116.90,114.67,111.18,55.54,51.30,40.40,35.01.
实施例5b
(e)-4-羟基-n-(4-(3-(羟氨基)-3-氧代丙基-1-烯基)苯乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺
以实施例5a为原料，制备方法同实施例2c。得率为34％。熔点150～152℃，1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.33(s,1h),7.46(d,j＝7.8hz,2h),7.42–7.13(m,5h),6.78(d,j＝8.2hz,1h),6.39(d,j＝15.8hz,1h),3.79(s,3h),3.50–3.41(m,2h),2.83(t,j＝7.4hz,2h)；13cnmr(101mhz,dmso)δ165.82,162.81,149.88,147.10,140.93,137.03,132.94,129.11,127.27,125.09,120.54,119.00,114.75,111.22,55.54,40.51,35.01.hrms(esi)m/z计算值[m-h]-355.1294,实测值355.1303.
实施例6
(e)-n-(4-(3-(羟氨基)-3-氧代丙基-1-烯基)苯乙基)苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-甲酰胺(化合物6)
实施例6a
(e)-3-(4-(2-(苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-甲酰胺)乙基)苯基)丙烯酸甲酯
以胡椒酸和实施例2a为原料，制备方法同实施例2b。得率为73％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.39(t,j＝5.6hz,1h),7.75–7.54(m,3h),7.40(dd,j＝8.2,1.7hz,1h),7.34(d,j＝1.7hz,1h),7.28(d,j＝7.9hz,2h),6.97(d,j＝8.1hz,1h),6.60(d,j＝16.1hz,1h),6.08(s,2h),3.72(s,3h),3.47(td,j＝5.6,7.2hz,2h),2.86(t,j＝7.2hz,2h)；13cnmr(101mhz,dmso)δ166.64,165.14,149.46,147.15,144.35,142.40,131.85,129.17,128.43,128.31,121.92,116.91,107.70,107.08,101.50,51.31,40.45,34.84.
实施例6b
(e)-n-(4-(3-(羟氨基)-3-氧代丙基-1-烯基)苯乙基)苯并[d][1,3]间二氧杂环二烯-5-
甲酰胺
以实施例6a为原料，制备方法同实施例2c。得率为41％。熔点186～187℃，1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.72(s,1h),9.02(s,1h),8.40(t,j＝5.6hz,1h),7.52–7.37(m,4h),7.35(d,j＝1.7hz,1h),7.27(d,j＝7.8hz,2h),6.97(d,j＝8.1hz,1h),6.41(d,j＝15.8hz,1h),6.09(s,2h),3.46(q,j＝6.7hz,2h),2.84(t,j＝7.3hz,2h)；13cnmr(101mhz,dmso)δ165.16,162.76,149.45,147.16,141.15,138.08,132.68,129.14,128.50,127.39,121.92,118.29,107.69,107.09,101.49,40.53,34.82.hrms(esi)m/z计算值[m-h]-353.1137,实测值353.1129.
实施例7
(e)-n-(4-(3-(羟氨基)-3-氧代丙基-1-烯基)苯乙基)-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁英-6-甲酰胺(化合物7)
实施例7a
(e)-3-(4-(2-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁英-6-甲酰胺)乙基)苯基)丙烯酸甲酯
以2,3-二氢-1,4-苯并二烷-6-羧酸和实施例2a为原料，制备方法同实施例2b。得率为69％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.37(t,j＝5.6hz,1h),7.76–7.56(m,3h),7.46–7.18(m,4h),6.90(d,j＝8.1hz,1h),6.59(d,j＝16.1hz,1h),4.40–4.13(m,4h),3.72(s,3h),3.46(td,j＝5.6,7.2hz,2h),2.85(t,j＝7.2hz,2h)；13cnmr(101mhz,dmso)δ166.62,165.21,145.79,144.33,142.76,142.43,131.85,129.16,128.28,127.52,120.42,116.93,116.56,116.02,64.21,63.90,51.28,40.36,34.85.
实施例7b
(e)-n-(4-(3-(羟氨基)-3-氧代丙基-1-烯基)苯乙基)-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁英-6-
甲酰胺
以实施例7a为原料，制备方法同实施例2c。得率为35％。熔点187～189℃，1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.39(t,j＝5.6hz,1h),7.48(d,j＝7.9hz,2h),7.42(d,j＝15.7hz,1h),7.37–7.30(m,2h),7.26(d,j＝7.9hz,2h),6.90(d,j＝8.1hz,1h),6.42(d,j＝15.8hz,1h),4.32–4.23(m,4h),3.45(q,j＝6.7hz,2h),2.84(t,j＝7.3hz,2h)；13cnmr(101mhz,dmso)δ165.20,162.68,145.78,142.76,141.15,137.96,132.69,129.13,127.53,127.37,120.42,118.32,116.56,116.02,64.21,63.90,40.45,34.82.hrms(esi)m/z计算值[m-h]-367.1294,实测值367.1302.
实施例8
(e)-5-氟-n-(4-(3-(羟氨基)-3-氧代丙基-1-烯基)苯乙基)烟酰胺(化合物8)
实施例8a
(e)-3-(4-(2-(5-氟代烟酰胺)乙基)苯基)丙烯酸甲酯
以5-氟烟酸和实施例2a为原料，制备方法同实施例2b。得率为65％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.87(t,j＝5.6hz,1h),8.84(t,j＝1.8hz,1h),8.74(d,j＝2.8hz,1h),8.03(ddd,j＝9.6,2.9,1.7hz,1h),7.76–7.54(m,3h),7.31(d,j＝8.1hz,2h),6.61(d,j＝16.0hz,1h),3.72(s,3h),3.53(dt,j＝5.6,7.2hz,2h),2.89(t,j＝7.2hz,2h)；19fnmr(376mhz,dmso)δ-126.86；13cnmr(101mhz,dmso)δ167.18,163.86,160.49,157.96,145.00,144.96,144.87,142.65,140.69,140.47,132.52,132.09,132.06,129.76,128.91,122.23,122.03,117.56,51.87,41.08,35.19.
实施例8b
(e)-5-氟-n-(4-(3-(羟氨基)-3-氧代丙基-1-烯基)苯乙基)烟酰胺
以实施例8a为原料，制备方法同实施例2c。得率为33％。熔点189～190℃，1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.74(s,1h),9.07(s,1h),8.88(t,j＝5.6hz,1h),8.85(s,1h),8.74(d,j＝2.8hz,1h),8.04(d,j＝9.4hz,1h),7.50(d,j＝7.8hz,2h),7.43(d,j＝15.8hz,1h),7.29(d,j＝7.8hz,2h),6.42(d,j＝15.8hz,1h),3.52(q,j＝6.8hz,2h),2.88(t,j＝7.2hz,2h).19fnmr(376mhz,dmso)δ-126.86；13cnmr(101mhz,dmso)δ163.28,162.66,159.93,157.39,144.44,144.40,140.82,140.12,139.90,137.98,132.78,131.54,131.51,129.18,127.42,121.67,121.48,118.34,40.60,34.59.hrms(esi)m/z计算值[m+h]+330.1254,实测值330.1261.
实施例9
(e)-n-(4-(3-(羟氨基)-3-氧代丙基-1-烯基)苯乙基)喹啉-6-甲酰胺(化合物9)
实施例9a
(e)-3-(4-(2-(喹啉-6-甲酰胺)乙基)苯基)丙烯酸甲酯
以喹啉-6-羧酸和实施例2a为原料，制备方法同实施例2b。得率为71％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.99(dd,j＝4.2,1.7hz,1h),8.85(t,j＝5.5hz,1h),8.47(td,j＝4.2,1.7hz,2h),8.14(dd,j＝8.8,2.0hz,1h),8.08(d,j＝8.8hz,1h),7.71–7.57(m,4h),7.33(d,j＝8.1hz,2h),6.61(d,j＝16.1hz,1h),3.72(s,3h),3.57(td,j＝5.5,7.2hz,2h),2.93(t,j＝7.2hz,2h)；13cnmr(101mhz,dmso)δ166.63,165.63,151.88,148.52,144.34,142.32,136.94,132.28,131.91,129.20,128.87,128.35,127.67,127.54,126.98,122.04,116.95,51.30,40.58,34.82.
实施例9b
(e)-n-(4-(3-(羟氨基)-3-氧代丙基-1-烯基)苯乙基)喹啉-6-甲酰胺
以实施例9a为原料，制备方法同实施例2c。得率为38％。熔点186～188℃，1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.98(dd,j＝4.2,1.7hz,1h),8.83(t,j＝5.6hz,1h),8.51–8.43(m,2h),8.15(dd,j＝8.8,1.9hz,1h),8.07(d,j＝8.8hz,1h),7.61(dd,j＝8.3,4.2hz,1h),7.50(d,j＝7.8hz,2h),7.43(d,j＝15.8hz,1h),7.32(d,j＝7.8hz,2h),6.42(d,j＝15.8hz,1h),3.62–3.52(m,2h),2.92(t,j＝7.3hz,2h)；13cnmr(101mhz,dmso)δ165.64,162.70,151.86,148.53,141.05,137.98,136.92,132.76,132.33,129.18,128.86,127.66,127.55,127.42,126.99,122.03,118.35,40.66,34.80.hrms(esi)m/z计算值[m-h]-360.1348,实测值360.1350.
实施例10
(e)-n-(4-(3-(羟氨基)-3-氧代丙基-1-烯基)苯乙基)-1h-苯并[d]咪唑-5-甲酰胺(化合物10)
实施例10a
(e)-3-(4-(2-(1h-苯并[d]咪唑-5-甲酰胺基)乙基)苯基)丙烯酸甲酯
以1h-苯并咪唑-5-羧酸和实施例2a为原料，制备方法同实施例2b。得率为76％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ12.71(s,1h),8.54(t,j＝5.6hz,1h),8.33(s,1h),8.20–8.07(m,1h),7.75–7.56(m,5h),7.32(d,j＝7.9hz,2h),6.60(d,j＝16.1hz,1h),3.72(s,3h),3.53(q,j＝6.8hz,2h),2.95–2.87(m,2h)；13cnmr(101mhz,dmso)δ167.75,166.62,166.58,144.34,143.62,142.52,131.84,129.18,128.29,127.07,124.31,121.18,118.99,116.92,109.53,51.27,40.50,34.93.
实施例10b
(e)-n-(4-(3-(羟氨基)-3-氧代丙基-1-烯基)苯乙基)-1h-苯并[d]咪唑-5-甲酰胺
以实施例10a为原料，制备方法同实施例2c。得率为32％。熔点179～181℃，1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ12.68(s,1h),10.74(s,1h),9.03(s,1h),8.54(t,j＝5.5hz,1h),8.32(s,1h),8.14(s,1h),7.72(br,1h),7.62(br,1h),7.49(d,j＝7.8hz,2h),7.42(d,j＝15.8hz,1h),7.30(d,j＝7.8hz,2h),6.42(d,j＝15.8hz,1h),3.57–3.47(m,2h),2.89(t,j＝7.3hz,2h)；hrms(esi)m/z计算值[m-h]-349.1301,实测值349.1306.
实施例11
(e)-n-(4-(3-(羟氨基)-3-氧代丙基-1-烯基)苯乙基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酰
胺(化合物11)
实施例11a
(e)-3-(4-(2-(1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酰胺基)乙基)苯基)丙烯酸甲酯
以7-氮杂吲哚-3-羧酸和实施例2a为原料，制备方法同实施例2b。得率为61％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ12.13(s,1h),8.47(dd,j＝8.0,1.6hz,1h),8.29(d,j＝4.7hz,1h),8.18(t,j＝5.7hz,1h),8.14(d,j＝2.5hz,1h),7.68–7.61(m,3h),7.32(d,j＝8.1hz,2h),7.19(dd,j＝7.9,4.7hz,1h),6.60(d,j＝16.1hz,1h),3.72(s,3h),3.54–3.49(m,2h),2.90(t,j＝7.3hz,2h).
实施例11b
(e)-n-(4-(3-(羟氨基)-3-氧代丙基-1-烯基)苯乙基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酰
胺
以实施例11a为原料，制备方法同实施例2c。得率为27％。熔点196～198℃，1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ12.06(s,1h),10.73(s,1h),9.04(s,1h),8.43(dd,j＝7.9,1.7hz,1h),8.26(dd,j＝4.7,1.7hz,1h),8.15–8.08(m,2h),7.49(d,j＝7.7hz,2h),7.42(d,j＝15.8hz,1h),7.30(d,j＝7.7hz,2h),7.16(dd,j＝7.9,4.7hz,1h),6.42(d,j＝15.8hz,1h),3.49(q,j＝6.8hz,2h),2.87(t,j＝7.3hz,2h)；13cnmr(101mhz,dmso)δ163.79,162.69,148.27,143.29,141.27,137.99,132.69,129.16,129.07,127.72,127.40,118.31,116.68,109.48,35.26.hrms(esi)m/z计算值[m-h]-349.1301,实测值349.1293.
实施例12、mtt法细胞增殖抑制活性测试
体外细胞增殖抑制实验采用mtt法，采用以下两种细胞系：人慢性粒细胞白血病(cml)细胞系k562，人组织细胞淋巴瘤细胞u937。
k562和u937为悬浮细胞，用含体积分数为10％胎牛血清的rpim-1640培养液，在37℃、体积分数为5％的co2条件下常规培养。
具体操作如下：
首先，将实施例1-26制备获得的化合物(即样品)分别配制成化合物浓度为5mm/l的dmso(二甲基亚砜)溶液，然后将获得的溶液经梯度稀释，得到一系列浓度梯度的样品溶液。
接着，取对数生长期的k562细胞或者u937细胞，以1.5×105个/ml的的细胞密度接种于96孔板中，99μl/孔，接着每孔加入样品溶液1μl，使样品作用终浓度分别为0.01，0.05，0.1，0.5，1，5，10，25，50μm。每种样品、每个浓度设三个复孔，并且设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中，阳性对照组分别加入阳性对照药物组蛋白去乙酰化酶抑制剂saha和dna甲基转移酶抑制剂sgi-027，阴性对照组加入与样品溶液同浓度的dmso，空白对照组不加细胞。作用72h后加入mtt溶液，10μl/孔，继续培养4小时后，于2000rpm、4℃下离心5分钟，吸去上清后加入二甲基亚砜(dmso)，100μl/孔，于37℃保温约10分钟，然后用微量振荡器振荡约5分钟，使结晶溶解完全，用酶标仪于490nm处测量od值。
细胞增殖抑制率(inhibitionrate，ir％)按如下公式计算：
ir％＝(阴性对照od－样品od)/(阴性对照od-空白对照od)×100％，
经过计算，得到本发明所制备的化合物的体外细胞增殖抑制活性，结果见表1。其中，ic50大于50μm以“-”表示，ic50大于10μm并小于50μm以“+”表示，ic50大于5μm并小于10μm以“++”表示，ic50大于1μm小于5μm以“+++”表示，ic50小于1μm以“++++”表示。测试结果表明，大部分化合物显示出良好的抗k562和u937增殖效果，其中，化合物2，3，6对u937增殖抑制的ic50小于1μm。
表1实施例1～11制备的化合物的体外肿瘤细胞增殖抑制活性
注：ic50表示半数抑制浓度。
实施例13、dna甲基转移酶抑制活性试验
使用同位素标记的s-腺苷甲硫氨酸(3h-sam)测试化合物在100mm时对dna甲基转移酶(dnmt1，dnmt3a，dnmt3b)的抑制活性,并以文献报导的dna甲基转移酶抑制剂nsc319745做对照。预先将化合物和相应的一定量的dna甲基转移酶亚型混合，室温下孵育15min后，加入人工合成的生物素标记的寡核苷酸底物和3h-sam并于室温下反应4h。接着将反应体系转移到链霉亲和素包被的高通量孔板中，室温反应1h。放射性活性通过液体闪烁计数法得到。通过和阴性对照组(无抑制剂组)比较得到化合物对酶的抑制活性。化合物对不同亚型dna甲基转移酶酶的抑制百分率(％inhibition)结果如表2所示。测试结果表明化合物对dna甲基转移酶具有一定的抑制活性，且对不同亚型抑制能力不同。大部分化合物对dnmt1的抑制活性与nsc319745活性相当，而dnmt3a/3b抑制活性较弱。化合物9对dnmt3b的抑制活性好于对dnmt1/3a的抑制活性。化合物10对三个亚型的抑制率均大于30％，且对dnmt3b的抑制活性与化合物nsc319745相似。化合物4在所列出的化合物中表现出最强的dnmt1抑制活性(抑制率大于60％)，且对dnmt3b抑制率将近50％，而对dnmt3a抑制活性较弱(抑制率23％)。
表2实施例1～11制备的化合物的dna甲基转移酶抑制活性
实施例14、组蛋白去乙酰化酶抑制活性试验
以组蛋白去乙酰化酶家族的两个亚型hdac1和hdac6为研究对象，测试化合物对组蛋白去乙酰化酶的抑制活性，每个化合物设十个浓度梯度，三个复孔，并以已上市的hdac抑制剂saha做对照。首先将化合物溶解到反应缓冲液中，之后加入一定体积的含组蛋白去乙酰化酶的缓冲溶液，室温孵育15分钟后加入胰蛋白酶和乙酰化的肽缓冲溶液作为反应底物以启动脱乙酰化反应，同时使化合物浓度和酶含量达到设定值，轻轻混合60秒后室温孵育，记录1个小时内一定激发光和发射光波长下反应的动力参数。通过和阴性对照组(无抑制剂组)比较得到化合物对酶的抑制活性，并计算得到化合物对组蛋白去乙酰化酶的半数抑制浓度(ic50)，结果如表3所示，其中，ic50大于10nm且小于100nm以“+”表示，ic50小于10nm以“++”表示。测试结果表明所有化合物对hdac1/6的半数抑制浓度(ic50)小于100nm，表现出具有良好的hdac1/6抑制活性。化合物5,6,7,9,10对hdac1/6的ic50小于10nm，与saha的抑制活性相当。
表3实施例1～11制备的化合物的组蛋白去乙酰化酶抑制活性