一种检测少见型β‑珠蛋白生成障碍性贫血突变的引物及试剂盒的制作方法

本发明涉及一种基因突变的引物及试剂盒，特别涉及一种检测少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血突变的引物及试剂盒。
背景技术：
：地中海贫血简称“地贫”，英文名称叫“thalassemia”。这种病是首先由thomascooley和pearllee这两位科学家，于1925年在地中海地区发现的，所以这种病就被命名为“地中海贫血”。实际上，这种病广泛地分布在热带、和亚热带地区，因地中海贫血致病基因的携带者，对疟疾有一定的抵抗能力。疟原虫要通过按蚊传播，按蚊生长在热带、亚热带，所以疟疾也主要出现在热带、亚热带地区。中国的广东省、广西省、海南省地处热带，这些地方也是中国出现疟疾最多的地方。因地中海贫血的携带者对疟疾有一定的抵抗能力，所以通过许多代人被疟疾的选择，广东省、广西省等省的人群当中，携带地中海贫血致病变异的人数比例，就相当高。据现有流行病学调查资料显示，广东省β-珠蛋白生成障碍性贫血为2.54％。一、血红蛋白与地中海贫血的关系一个人患地中海贫血，是因为他的基因当中，编码血红蛋白的基因有致病的变异。血红蛋白是人体的红细胞当中专门负责携带氧气的蛋白。正常成年人的一个血红蛋白，是由两个α珠蛋白、和两个β珠蛋白组成的。每个珠蛋白结合一个亚铁血红素。一个亚铁血红素，是由一个卟啉环结合一个亚铁离子组成的。这个亚铁离子负责直接与氧气分子结合。血红蛋白在肺部与氧气分子结合之后，再通过血液的输送，把氧气输送到全身。当一个人编码血红蛋白的基因发生了变异，血红蛋白的数量就可能减少，血红蛋白的稳定性也可能会降低，进而就会导致供氧不足、黄疸、肝脾肿大、特殊的地中海贫血面容、易患各感染性疾病等症状。二、α型地中海贫血地中海贫血根据致病基因变异的不同，分成两大类：α地贫、和β地贫。α地贫，就是指因为编码α珠蛋白的基因发生致病变异，而导致的地贫。编码α珠蛋白的基因位于第16号染色体上。正常情况下，1条16号染色体上有2个串联排列的α珠蛋白基因拷贝，这两个拷贝是紧挨着的。所以，一个正常人应该有4个α珠蛋白基因的拷贝。α地贫的主要基因变异，是α珠蛋白的基因拷贝数量减少。α地贫的症状的严重程度，是与α珠蛋白基因缺失的拷贝数量呈正相关的，缺失的拷贝数越多，临床症状越严重。α地贫的基因变异，除了基因拷贝数的缺失之外，还有部分的变异是因为α亚基的编码出现了变异。比如单个碱基的替换(snv)、插入缺失变异(indel)，也可能会导致α地贫。三、β型地中海贫血β地贫，就是指编码β珠蛋白的基因发生致病变异，而导致的地贫。β珠蛋白基因位于11号染色体短臂1区2带，β珠蛋白基因的常见变异，是因为β珠蛋白基因的编码序列出现了异常，导致不能合成出β珠蛋白，或者合成出的β珠蛋白不能正常地与α珠蛋白结合，导致不能形成正常的、有功能的血红蛋白。现在已知有200多种β珠蛋白基因的致病变异，中国也发现了30多种突变，一般轻型珠蛋白生成障碍性贫血受测者临床上多无明显症状，无需特殊治疗，但由于地贫的遗传性,可能会将其异常基因遗传给下一代。血液学筛查结合基因诊断是目前筛查诊断珠蛋白生成障碍性贫血的重要手段，但进一步的确认还有赖于dna分析地贫基因分型。四、目前通用的检测方法及局限性目前有关地贫的检测方法中，血液学表型分析在实际的检测过程中能给到很好的提示，有助于进一步地贫检测分析提供线路，故在珠蛋白生成障碍性贫血的实验分析和研究中占有非常重的地位；同时，“基因型和表型相结合”这一操作理念也是进行地贫检测和研究的基本原则，血液学表型和基因检测结果均正常的个体，一般可排除β-珠蛋白生成障碍性贫血基因突变。基因测序作为检测地贫的金标准，但目前国内对于珠蛋白生成障碍性贫血的基因检测方法通常只限于α-珠蛋白生成障碍性贫血的常见3种缺失与常见的点突变，β-珠蛋白生成障碍性贫血的常见17个位点点突变的检测，因此能检测到的突变有限，少部分罕见类型珠蛋白生成障碍性贫血受测者往往被因没有相应的基因引物和试剂盒而不能确定具体是哪种珠蛋白基因的变异。如前所述，广东省、广西省等省的人群当中，携带地中海贫血致病变异的人数比例相当高，据现有流行病学调查资料显示，广东省β-珠蛋白生成障碍性贫血为2.54％。金域检验作为国内第三方医学检验的龙头企业，其主要是为提供更多的大健康一体化检测服务方案。金域检验每天会接收全省2000多家医疗机构的检测样本，其中每天约1000例地贫的检测样本。而目前国内有关的检测方法中，中国人群常见的17种突变位点中，通常采用反向点杂(rdb)法检测β-珠蛋白生成障碍性贫血，能基本检测出绝大多数的β-珠蛋白生成障碍性贫血，但是β珠蛋白基因的致病变异较多，针对少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血突变用rdb检测方法具有很大的局限性，这类携带者常常被漏检。技术实现要素：为弥补现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种检测少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血突变的引物及试剂盒，该引物具有特异性好、灵敏度高等优点，用于准确的确定少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血突变的基因序列，对少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血的分析和研究具有重要的作用。本发明所采取的技术方案是：一种检测少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血突变的引物，引物可以扩增含有β珠蛋白转录启动子上游-90位置出现c>t突变beta+(hbb:c.-140c>t)的核酸序列。特别的，针对一种检测少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血基因基因第一对特异性pcr引物的正向引物为：gccaagagatatatcttagag，反向引物为：actgtaccctgttacttatcc；针对一种检测少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血基因基因第二对特异性pcr引物的正向引物为：ggcaatagcaatatctctgcat，反向引物为：aatgcactgacctcccacattc。一种检测少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血突变的试剂盒，试剂盒中含有可以扩增含有β珠蛋白转录启动子上游-90位置c>t突变beta+(hbb:c.-140c>t)的核酸序列的引物。特别的，试剂盒的扩增引物的序列如下：bf1：gccaagagatatatcttagag(seqidno：1)br1：actgtaccctgttacttatcc(seqidno：2)bf2：ggcaatagcaatatctctgcat(seqidno：3)br2：aatgcactgacctcccacattc(seqidno：4)。此外，本发明还提供了检测一种少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血基因的引物在制备检测一种少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血基因试剂盒中的用途。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种检测少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血的引物，可以有效地检出少见型β珠蛋白转录启动子上游-90位置(c>t)beta+(hbb:c.-140c>t)突变，为产前的检测提供了相应依据。同时本发明技术可用于准确的确定少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血突变的基因序列，对少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血的分析和研究具有重要的作用。本发明提供的引物的特异性好，准确性好，提高了检测效率。此外，本发明还提供了一种检测少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血基因的试剂盒，通过使用特异性的引物，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，用于准确的检测一种检测少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血基因序列，促进一种检测少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血基因的功能分析和研究。附图说明图1是琼脂糖凝胶电泳结果图；图2是hplc结果图；图3是毛细管电泳结果；图4是常见α-珠蛋白生成障碍性贫血基因缺失检测结果；图5是常见β-珠蛋白生成障碍性贫血基因突变检测结果；图6是α-珠蛋白生成障碍性贫血基因突变检测结果；图7少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血突变基因测序结果图。具体实施方式下面进一步结合实施例，说明本发明的技术方案。实施例1、引物发明人针对一种检测少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血突变基因特异性pcr引物设计了大量引物，通过引物反应条件的优化和比较，筛选出了特异性好的引物，该引物能检测到突变为β珠蛋白转录启动子上游-90位置(c>t)beta+(hbb:c.-140c>t)的点突变，引物序列如下表1本发明提供的引物实施例2、一种检测少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血突变的试剂盒一种检测少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血突变的试剂盒，突变为β珠蛋白转录启动子上游-90位置(c>t)beta+(hbb:c.-140c>t)的点突变，包括：dna抽取试剂、扩增试剂，扩增试剂中使用的引物序列如下：bf1：gccaagagatatatcttagagbr1：actgtaccctcgtacttatccbf2：ggcaatagcaatatctctgcatbr2：aatgcactgacctcccacattc。下面结合实验，进一步验证本发明的技术方案。一、检测流程1.对象：为到广州金域医学检验中心进行体检的男性青年，22岁，籍贯为广东省阳江市。2.方法：2.1血液学检查：各项血液指标分析采用全自动血球分析仪(型号：lh750)及配套试剂(美国beckmancoulter公司提供)进行红细胞参数计数。血红蛋白电泳及定量分析采用全自动快速电泳系统(美国helenaspife3000)、hplc(美国primusclc385)、毛细管电泳(法国sebiacapillarys)，及配套试剂进行检测(电泳法)。2.2珠蛋白生成障碍性贫血基因检测2.2.1α-珠蛋白生成障碍性贫血基因检测：基于跨跃断裂点pcr(gap-pcr)，以多重pcr并结合电泳和凝胶成像系统，检测受测者标本中常见的α-珠蛋白--sea、-α3.7、-α4.2等三类缺失型α-地中海贫血，采用深圳亚能公司的α-珠蛋白生成障碍性贫血基因检测试剂盒，按照说明书进行检测。2.2.2β-珠蛋白生成障碍性贫血基因检测：采用膜反向杂交技术，采用24条探针，检测17种常见的β-地中海贫血基因突变位点，试剂盒由深圳益生堂生物公司提供。2.2.3.β-珠蛋白基因测序：根据ncbi中国人正常珠蛋白基因序列设计引物扩增全mrna序列进行测序，3.判断标准：根据《血液病诊断及疗效标准》(黄有文。珠蛋白生成障碍性贫血//张之南。血液病诊断及疗效标准。2版。北京：科学出版社，1998：49-58)电泳法结果诊断a-珠蛋白生成障碍性贫血时hba2临界值为≤2.6％，诊断β-珠蛋白生成障碍性贫血时hba2临界值为≥3.8％，hplc&ce结果诊断前者为≤1.9％，后者为≥3.0％，以基因检测为金标准。4.实验流程：采用经典的全血细胞计数(fbc)和血红蛋白成分分析(琼脂糖凝胶电泳或高效液相色谱和毛细管电泳)，血液学表型分析方法能筛出绝大多数珠蛋白生成障碍性贫血基因携带者，对于血液表型筛出异常结果的受测者，经珠蛋白生成障碍性贫血基因检测或dna序列分析进一步明确。二、结果1.血液学表型分析结果：血液学结果见表2。表2、血液学表型分析结果1.1受测者血常规显示：mcv(平均红细胞体积)76.6fl，呈小细胞低色素；rbc(红细胞计数)6.04×1012/l；hb(血红蛋白)139g/l。1.2碱性血红蛋白电泳第2号位发现受测者hba2增高占4.95％(见图1)；高效液相(hplc)和毛细管电泳(ce)结果均为5.3％(见图2～3)。发明人通过对全自动电泳琼脂糖凝胶电泳进行地贫初筛检测，结果hba2增高，结合红细胞数参数及形态学镜检结果，根据发明人对于地贫检测20年的从业经验，高度怀疑受检都为轻型β-地贫，鉴于此，发明人对此进行了地贫基因检测。2.珠蛋白生成障碍性贫血基因检测结果2.2.1常见α-珠蛋白生成障碍性贫血基因缺失检测结果：检测缺失型α珠蛋白生成障碍性贫血(--sea/αα，--α3.7/αα，--α4.2/αα)，通过条带与对照比较得出结果，未检验到缺失基因；(见图4)2.2.2常见β-珠蛋白生成障碍性贫血基因突变检测结果：检测β珠蛋白生成障碍性贫血中国人常见的17个突变(β0包括int,cd41-42，cd31，cd14-15，cd17，cd71-72，ivs-i-1，cd43，cd27/28；β+包括ivs-ii-654,-28，-29，-30，-32，cap，ivs-i-5,βe)，根据膜条上的杂交斑点判断突变位点，未检测到突变基因(见图5)。2.2.3.α-珠蛋白生成障碍性贫血基因突变检测结果：鉴于在实验过程中，未检测到常见的α-珠蛋白生成障碍性贫血基因缺失和β-珠蛋白生成障碍性贫血基因突变，发明人同时还加做了α珠蛋白生成障碍性贫血点突变(αwsα/，αcsα/，αqsα/)，结果均未发现突变(见图6)。2.2.4.一种少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血基因测序结果：根据珠蛋白生成障碍性贫血血液学表型分析结果与以上所测珠蛋白生成障碍性贫血基因不符的现象，对该受测者样本加做β珠蛋白基因测序。对此，发明人根据ncbi(nationalcenterforbiotechnologyinformation)美国国立生物技术信息中心有关中国人正常珠蛋白基因序列设计引物，针对β-珠蛋白基因特异性pcr引物设计了大量引物，通过引物反应条件的优化和比较，筛选出了特异性好的引物，同时扩增全mrna序列进行测序。表3本发明提供的引物根据本发明设计的引物，通过业内公认的一代测序的金标准的abi3730测序仪进行基因测序，得到以下测序结果(见图7)：通过第一对特异性pcr引物所扩增的基因序列如下：1gccaagagatatatcttagagggagggctgagggtttgaagtccaactcctaagccagtg61ccagaagagccaaggacaggtacggctgtcatcacttagacctcaccctgtggagccaca121ccctagggttggccaatctactcccaggagcagggagggcaggagccagggctgggcata181aaagtcagggcagagccatctattgcttacatttgcttctgacacaactgtgttcactag241caacctcaaacagacaccatggtgcatctgactcctgaggagaagtctgccgttactgcc301ctgtggggcaaggtgaacgtggatgaagttggtggtgaggccctgggcaggttggtatca361aggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagac421tcttgggtttctgataggcactgactctctctgcctattggtctattttcccacccttag481gctgctggtggtctacccttggacccagaggttctttgagtcctttggggatctgtccac541tcctgatgctgttatgggcaaccctaaggtgaaggctcatggcaagaaagtgctcggtgc601ctttagtgatggcctggctcacctggacaacctcaagggcacctttgccacactgagtga661gctgcactgtgacaagctgcacgtggatcctgagaacttcagggtgagtctatgggacgc721ttgatgttttctttccccttcttttctatggttaagttcatgtcataggaaggggataag781taacagggtacagt(seqidno：5)。通过第二对特异性pcr引物所扩增的基因序列如下：1ggcaatagcaatatctctgcatataaatatttctgcatataaattgtaactgatgtaaga61ggtttcatattgctaatagcagctacaatccagctaccattctgcttttattttatggtt121gggataaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacc181tcttatcttcctcccacagctcctgggcaacgtgctggtctgtgtgctggcccatcactt241tggcaaagaattcaccccaccagtgcaggctgcctatcagaaagtggtggctggtgtggc301taatgccctggcccacaagtatcactaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaa361ggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagc421atctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaatgatgtatttaaattatt481tctgaatattttactaaaaagggaatgtgggaggtcagtgcatt(seqidno：6)。三、一种少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血基因测序的具体技术方案1.dna测序模板处理1)exosap-it和h2o以2.0μl：3.0μl混合，震荡混匀后，分装5.0μl至新的8连管中；2)每孔加入pcr产物2.0μl，混匀微离心；3)在pcr仪中进行酶切反应，程序：37℃,15min；80℃,15min；4℃,infinite。2.测序pcr体系配制按以下比例准备测序pcr反应体系：reaction1/4×bdtv3.11.0μl5xseqbuffer1.5μlprimer3.2μm1.0μlh2o5.5μltemplate1.0μl处理方式：a)取出引物、无dnaase和rnaase的h2o、bdtv3.1和buffer，室温溶解后微离心；b)选择合适的体系，1/4×，按表格中比例配制好，加入顺序为h2o、buffer、primer，最后为bdtv3.1，震荡混匀后微离心，分装每孔9.0μl至96孔板相应位置。3.测序pcr反应a)向每管中加入经exosap-it处理的dna测序模板1.0μl；b)盖好上盖后，振荡混匀后，微离，使混合物沉入管底；c)在pcr仪中进行测序反应，反应程序：96℃,1min→(96℃,10sec→50℃,5sec→60℃,4min),25个循环→4℃保温。4.测序pcr产物纯化方案：10μl化反应体系，96孔板，酒精/edta/naac法a)每管加入1.0μl125mmedta到管底，每管加入1.0μl3mnaac到管底；b)每管加入35.0μl100％酒精，铝箔或胶盖封严密，震荡混匀4次，室温放置15min；c)3700rpm离心30min，马上倒置96孔板，离心至850rpm停止离心；d)每管加入50.0μ0的-20入预冷70％酒精，3700rpm离心15min；马上倒置96孔板，离心至850rpm停止离心；e)重复用预冷70％酒精洗涤1次；f)室温挥发净酒精，加入10.0μlhi-diformamide溶解dna；g)溶解后的样品需要在95℃变性4min，迅速置冰中冷却4min后(取出后置于-20℃冰箱)，上样电泳。5.电泳参考基因分析仪abi3730标准操作流程。6.结果分析方法打开软件sequencinganalysis5.2，载入测序结果，察看lor值、rawdata、bcstatus、ppstatus。原则上应该尽量使质控品的结果达到最佳，详细的软件操作说明参考《appliedbiosystemsdnasequencinganalysissoftwarev5.1》，根据具体的测序要求评价测序结果，应满足以下情况：6.1.测序目的信号强度应该在500-2000fu，噪音信号应该控制在0-15fu；6.2.对所有测序序列进行评估，依照以下评分标准，如下：7.测序结果发明人采用上述引物对基因进行扩增，有效地扩增了该待测对象的β珠蛋白基因。通过第一对特异性pcr引物所扩增的基因序列如下：1gccaagagatatatcttagagggagggctgagggtttgaagtccaactcctaagccagtg61ccagaagagccaaggacaggtacggctgtcatcacttagacctcaccctgtggagccaca121ccctagggttggccaatctactcccaggagcagggagggcaggagccagggctgggcata181aaagtcagggcagagccatctattgcttacatttgcttctgacacaactgtgttcactag241caacctcaaacagacaccatggtgcatctgactcctgaggagaagtctgccgttactgcc301ctgtggggcaaggtgaacgtggatgaagttggtggtgaggccctgggcaggttggtatca361aggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagac421tcttgggtttctgataggcactgactctctctgcctattggtctattttcccacccttag481gctgctggtggtctacccttggacccagaggttctttgagtcctttggggatctgtccac541tcctgatgctgttatgggcaaccctaaggtgaaggctcatggcaagaaagtgctcggtgc601ctttagtgatggcctggctcacctggacaacctcaagggcacctttgccacactgagtga661gctgcactgtgacaagctgcacgtggatcctgagaacttcagggtgagtctatgggacgc721ttgatgttttctttccccttcttttctatggttaagttcatgtcataggaaggggataag781taacagggtacagt。通过第二对特异性pcr引物所扩增的基因序列如下：1ggcaatagcaatatctctgcatataaatatttctgcatataaattgtaactgatgtaaga61ggtttcatattgctaatagcagctacaatccagctaccattctgcttttattttatggtt121gggataaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacc181tcttatcttcctcccacagctcctgggcaacgtgctggtctgtgtgctggcccatcactt241tggcaaagaattcaccccaccagtgcaggctgcctatcagaaagtggtggctggtgtggc301taatgccctggcccacaagtatcactaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaa361ggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagc421atctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaatgatgtatttaaattatt481tctgaatattttactaaaaagggaatgtgggaggtcagtgcatt。测序结果表明，发现待测对象的β珠蛋白基因中，β珠蛋白转录启动子上游-90位置出现c>t突变，即β珠蛋白转录启动子上游-90位置(c->t)beta+杂合突变(hbb:c.-140c>t)。本发明的实验结果表明，若基因型诊断结果正常，受测者具有明显小细胞低色素且hba2＞3.5％的个体，则应考虑受试者具有除17种β-珠蛋白生成障碍性贫血突变以外的罕见或少见基因型突变，须进一步做β-珠蛋白生成障碍性贫血基因序列分析，这些技术的联合应用能有效地检测出稀有珠蛋白生成障碍性贫血基因并明确具体的基因型。本发明技术可用于准确的检测一种检测少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血基因序列，促进一种检测少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血基因的功能分析和研究。sequencelisting<110>广州金域医学检验中心有限公司<120>一种检测少见型β-珠蛋白生成障碍性贫血突变的引物及试剂盒<130>hbb<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>21<212>dna<213>人工引物<400>1gccaagagatatatcttagag21<210>2<211>21<212>dna<213>人工引物<400>2actgtaccctgttacttatcc21<210>3<211>22<212>dna<213>人工引物<400>3ggcaatagcaatatctctgcat22<210>4<211>22<212>dna<213>人工引物<400>4aatgcactgacctcccacattc22<210>5<211>794<212>dna<213>人类<400>5gccaagagatatatcttagagggagggctgagggtttgaagtccaactcctaagccagtg60ccagaagagccaaggacaggtacggctgtcatcacttagacctcaccctgtggagccaca120ccctagggttggccaatctactcccaggagcagggagggcaggagccagggctgggcata180aaagtcagggcagagccatctattgcttacatttgcttctgacacaactgtgttcactag240caacctcaaacagacaccatggtgcatctgactcctgaggagaagtctgccgttactgcc300ctgtggggcaaggtgaacgtggatgaagttggtggtgaggccctgggcaggttggtatca360aggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagac420tcttgggtttctgataggcactgactctctctgcctattggtctattttcccacccttag480gctgctggtggtctacccttggacccagaggttctttgagtcctttggggatctgtccac540tcctgatgctgttatgggcaaccctaaggtgaaggctcatggcaagaaagtgctcggtgc600ctttagtgatggcctggctcacctggacaacctcaagggcacctttgccacactgagtga660gctgcactgtgacaagctgcacgtggatcctgagaacttcagggtgagtctatgggacgc720ttgatgttttctttccccttcttttctatggttaagttcatgtcataggaaggggataag780taacagggtacagt794<210>6<211>524<212>dna<213>人类<400>6ggcaatagcaatatctctgcatataaatatttctgcatataaattgtaactgatgtaaga60ggtttcatattgctaatagcagctacaatccagctaccattctgcttttattttatggtt120gggataaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacc180tcttatcttcctcccacagctcctgggcaacgtgctggtctgtgtgctggcccatcactt240tggcaaagaattcaccccaccagtgcaggctgcctatcagaaagtggtggctggtgtggc300taatgccctggcccacaagtatcactaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaa360ggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagc420atctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaatgatgtatttaaattatt480tctgaatattttactaaaaagggaatgtgggaggtcagtgcatt524当前第1页12