一种预示和鉴定甜瓜橙色果肉性状的分子标记及其引物与应用的制作方法

本发明涉及一种预示和鉴定甜瓜橙色果肉性状的分子标记及其引物与应用，属于甜瓜分子标记辅助选择育种技术领域。

背景技术：

分子标记辅助选择(molecular marker assisted selection，MAS)是随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，它可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子育种。分子标记辅助选择育种就是利用与作物重要性状连锁的DNA标记或功能基因来改良植物品种的现代分子育种技术，因此，分子标记辅助选择成功的关键在于所获得的分子标记是否与待分析的性状相连锁以及是否在同一物种的不同材料间具有通用性。

甜瓜育种目标涉及对某些经济性状的改进，并且要兼顾到生产者与消费者两方面的需要。当今世界甜瓜育种的主要目标是抗病、品质和特色育种。甜瓜果肉颜色是甜瓜外观品质构成的一项重要指标，尤其当今甜瓜常作为高档水果进入餐桌，使具有艳丽色彩的品种备受青睐。甜瓜果肉的营养成分丰富，除可溶性固形物(13％-15％)居瓜类含糖量之首外，还含有多种人体必需的矿物质(钙、磷、铁等)以及β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质、堇菜黄质等多种色素，甜瓜果肉所含的类胡萝卜素种类及其相对含量的差别造成了果肉颜色的多样性。同时，甜瓜果肉中的色素也具有对人体有益的生理功能，有研究表明，β-胡萝卜素可以消除自由基对机体的损伤，具有抗氧化作用,对于预防癌症有重要的作用。此外，β-胡萝卜素可在人体内转化成维生素A，维生素A是维持实力和皮肤正常状态所必须的物质，缺乏则会导致干眼病和夜盲症(JA Olson.Carotenoids and human health,1999,55(3):207-216；H Nishino,M Murakoshi,et al.Cancer prevention by carotenoids,2015,483(12):165-168)。因此通过分子标记辅助选择的方法高效的选育具有不同果肉颜色的甜瓜品种是当前甜瓜育种工作的重要部分之一。

随着DNA分子标记技术的快速发展，利用与植物相关基因紧密连锁的分子标记进行辅助选择，可以极大的提高对目标性状筛选的效率。近年来，随着高通量测序技术的迅猛发展，通过测序技术获得的甜瓜基因组数据为甜瓜主要性状的基因定位及大量分子标记的开发提供了新的途径。CAPS分子标记是以酶切位点单碱基突变产生多态性的分子标记，以其分布范围广泛、变异稳定成为基因定位及分子生物学研究的新一代标记，CAPS标记操作简便，结果易于观测且在相同物种间具有普遍适用性。

到目前为止，甜瓜育种中主要应用的分子标记为RFLP、SSR、AFLP、RAPD等，CAPS分子标记运用较少。与RFLP相比，CAPS分子标记具有操作简便，多态性高的优点；CAPS分子标记比RAPD的稳定性、可靠性、重复性更好；相对于AFLP来说，CAPS分子标记工作量小、易统计条带；相较于SSR来说，CAPS标记引物设计更为容易。另外，CAPS分子标记对DNA浓度与纯度要求较低，降低DNA提取的工作难度。由此可见，CAPS标记具有巨大的开发前景。本分子标记的发明对于丰富甜瓜育种分子标记的多样性具有重要意义。

技术实现要素：

为提供一种可以用于预示和鉴定甜瓜橙色果肉性状的分子标记，本发明提供了一种预示和鉴定甜瓜橙色果肉性状的分子标记及其引物与应用，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种预示和鉴定甜瓜橙色果肉性状的分子标记HF，所述分子标记HF如SEQ ID NO.1所示，其中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列第640位碱基M为G或A，SEQ ID NO.1所示核苷酸序列第640位碱基m为G，则鉴定为橙色果肉的甜瓜，SEQ ID NO.1所示核苷酸序列第640位碱基m为A，则鉴定为非橙色果肉的甜瓜。

本发明还提供所述分子标记HF在甜瓜分子标记辅助育种、甜瓜果肉性状辅助鉴定和辅助育种、甜瓜果肉性状辅助鉴定、甜瓜果肉性状筛选中的应用。

本发明还提供一种用于PCR检测所述分子标记HF的引物对，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物HF-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的下游引物HF-R。

本发明还提供所述分子标记HF的引物对在甜瓜分子标记辅助育种、甜瓜果肉性状辅助鉴定和辅助育种、甜瓜果肉性状筛选中的应用。

本发明还提供一种鉴定甜瓜橙色果肉性状的方法，包括以下步骤：

1)提取待检测甜瓜样品的基因组DNA；

2)以步骤1)所得的待检测甜瓜样品基因组DNA为模板，利用权利要求3所述的分子标记HF的引物对进行PCR扩增反应，获得PCR产物；

3)对步骤2)所得PCR产物用限制性内切酶HinfⅠ进行酶切反应，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测；若检测得到长度为640bp和306bp的两个片段，则待测甜瓜具有橙色果肉性状；若检测得到长度为946bp的单一片段，则待测甜瓜具有非橙色果肉性状。

优选地，步骤2)中20μL所述PCR扩增反应的体系如下：

优选地，步骤3)所述的PCR扩增反应为TD-PCR扩增反应。

更优选地，所述TD-PCR扩增反应的具体程序为：94℃预变性7min，94℃变性1min，60℃退火30s，每循环降低0.5℃，72℃延伸90s，30个循环；94℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；72℃延伸10min。

本发明还提供一种含有所述的引物对的检测甜瓜果肉颜色的试剂盒。

本发明还提供一种所述试剂盒在检测甜瓜果肉颜色中的应用。

本发明所述的分析标记HF位于甜瓜CmOr基因上，并且在第640个碱基处发生基因突变，由G突变为A，导致氨基酸由精氨酸突变为组氨酸，提高类胡萝卜素含量，尤其是β-胡萝卜素含量，使得果肉呈现橙色。

本发明利用CAPS分子标记引物通过PCR扩增获得与甜瓜果肉颜色相关的DNA片段，再利用限制性内切酶对获得的片段进行酶切反应，由于两种不同颜色的甜瓜材料在所获得的DNA片段中存在酶切位点单碱基突变的差异。因此，存在单碱基突变的位点不会被限制性内切酶切开而获得一条大小为946bp的片段，不存在碱基突变位点的片段会被限制性内切酶切开，获得640bp及306bp的两个片段，通过琼脂糖凝胶电泳可以清晰的将两中不同果肉颜色的甜瓜材料进行区分。

本发明有益效果：

1、本发明根据得到的甜瓜基因组数据，设计并开发了与甜瓜果肉颜色相关的CAPS分子标记，所开发CAPS分子标记在不同材料中具有通用性，获得了一个可用于鉴别甜瓜果肉颜色的分子标记。本发明方法在甜瓜的幼苗期即可对甜瓜果肉颜色进行辅助选择，操作简便结果明确，大大提高了育种效率缩短育种年限，加快育种工作效率。

2、本发明获得的CAPS分子标记，在不同的果肉颜色的甜瓜材料中可以进行很好的区分，因此，本发明获得了一个可以高效区分不同甜瓜果肉颜色的分子标记。

3、本发明可在甜瓜幼苗期(三叶一心期)判断果肉颜色，时间约为20天；而常规育种需要果实完全成熟才能进行判断，时间约为90天至140天，由此可见，利用本发明可有效缩短育种时间，加快育种速度。本发明特异性良好，准确率为83.3％。

附图说明

图1为CAPS标记HF在MR-1(橙色果肉材料)和X191(绿色果肉材料)中的酶切情况；(0，D2000marker Plus；1-2号泳道分别为X191、MR-1植株的DNA通过CAPS标记HF进行PCR反应所获得的PCR产物(946bp)；3号泳道为X191的酶切产物，片段大小为946bp；4号泳道为MR-1的酶切产物，片段大小为640bp和306bp；Marker为D2000marker Plus，条带大小由上至下依次为：5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。图2为70种甜瓜材料的PCR产物；

图3为70种甜瓜材料的酶切鉴定结果；

图2和图3中：0，Marker为D2000marker Plus，条带大小由上至下依次为：5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；1，X073；2，X024；3，M4-53；4，X006；5，X206；6，X021；7，X200；8，X011；9，X121；10，X190；11，X198；12，X176；13，M4-72；14，X237；15，X047；16，M4-2；17，X194；18，X161；19，M4-123；20，M4-4；21，M4-133；22，X157；23，M4-129；24，X149；25，M4-1；26，X222；27，X088；28，X101；29，X167；30，M4-127；31，X095；32，X136；33，X071；34，M4-126；35，X156；36，X045；37，X058；38，X089；39，X239；40，X109；41，M4-83；42，M4-5；43，X201；44，M4-61；45，X015；46，X193；47，M4-58；48，X205；49，X210；50，X233；51，X053；52，M4-90；53，M4-115；54，X177；55，X197；56，M4-18；57，X072；58，M4-70；59，M1-101；60，M1-33；61，M1-20；62，X033；63，M1-96；64，X208；65，X208；66，X039；67，X023；68，X038；69，X150；70，X206。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例1：分子标记及其引物的的开发

本实施例选用橙色甜瓜品系MR-1及绿色甜瓜品系X191为实验材料开发CAPS分子标记。利用高通量测序技术对MR-1和X191甜瓜品系进行测序，并通过GenBank网站获取甜瓜CmOr基因编码区序列，通过该序列与测序材料的比对，得到了甜瓜CmOr基因编码区存在SNP突变的区间，在该区间内，挖掘测序数据存在SNP突变位点的碱基区段，分析SNP位点的酶切信息，获得存在CAPS突变的序列，即CAPS分子标记HF。

甜瓜CmOr基因序列位于9号染色体5207122-5214439之间。分子标记HF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中SEQ ID NO.1所示序列第640位碱基m为G或A，SEQ ID NO.1所示序列第640位碱基m为G，甜瓜果肉性状体现为橙色，SEQ ID NO.1所示序列第640位碱基M为A，则甜瓜果肉性状体现为非橙色。

利用Primer 6软件在存在CAPS位点的序列上设计CAPS引物。引物长度为18bp-26bp，退火温度为56-60℃，GC含量为40％-60％。

CAPS分子标记HF的碱基序列的正向引物HF-F核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物HF-R核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体如表1所示：

表1用于PCR反应的CAPS分子标记HF的引物名称、序列及预期片段大小

实施例2：基因组DNA的提取及PCR反应

采集MR-1，X191甜瓜材料群体叶片，利用改良的CTAB法提取基因组DNA。

利用所获得的CAPS引物及基因组DNA进行PCR反应，PCR反应体系如表2所示(20μL)：

表2 PCR反应体系

采用降落PCR(touchdown PCR,TD-PCR)进行扩增，程序为：94℃预变性7min，94℃变性1min，60℃退火30s，每循环降低0.5℃，72℃延伸90s，30个循环；94℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

实施例3：对PCR产物进行酶切验证

按照HinfⅠ的限制性内切酶操作指南进行酶切反应，对所获得的PCR产物进行酶切验证，酶切体系如表3所示：(15.3μL)

表3酶切反应体系

37℃水浴酶切3-4h，酶切产物采用1％琼脂糖电泳进行检测，检测结果如图1所示。X191(绿色)由于不存在酶切位点，没有被限制性内切酶切开仍为946bp，MR-1(橙色)中由于存在酶切位点，被HinfⅠ切开并获得了640bp和306bp的片段。结果如图1所示。

实施例4：利用所获得的CAPS标记对不同果肉颜色的甜瓜品种进行种质资源的筛选

为鉴别所开发的CAPS标记对其它甜瓜材料的适用性，我们选择70份具有橙色、绿色及白色果肉的甜瓜材料，利用该引物对其进行PCR扩增和酶切验证。表4为70份甜瓜材料的名称及颜色等描述。

表4 70种甜瓜品种介绍

按照实施例2的方法提取基因组DNA和PCR反应，并且按照实施例3中的酶切方法进行酶切验证，鉴定70种甜瓜材料的果肉性状，具体方法如下：

1)分别提取70种待检测甜瓜样品中的基因组DNA；

2)分别以步骤1)所得的70种待检测甜瓜样品基因组DNA为模板，利用分子标记HF的引物对(实施1中HF-R和HF-F)进行PCR扩增反应，获得PCR产物；

3)对步骤2)所得PCR产物用限制性内切酶HinfⅠ进行酶切反应，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测；若检测得到长度为640bp和306bp的两个片段，则待测甜瓜具有橙色果肉性状；若检测得到长度为946bp的单一片段，则待测甜瓜具有非橙色果肉性状。

上述步骤2)中获得的PCR产物采用1％琼脂糖电泳对PCR产物进行检测，检测结果如图2所示，供试的70种材料均扩增出一条946bp大小的条带。

上述步骤3)中酶切验证的结果如图3所示。

结合图3和表4可以看出：PCR产物经酶切后产物均获得640bp和306bp两条带，田间表型分别为橙色或浅橙；PCR产物经酶切后均呈现出一条946bp大小的条带，田间表型为绿色或白色。

结合图3与表4可分析出共有67个品种酶切结果与田间果肉性状相一致，符合率达95.7％；其中于表4中可查询具有橙色果肉性状的品种18个，图3中明确具有两个条带的品种15个，符合率达到83.3％，其中不符合的3个品种为X021、X088、X089。因此，利用本发明方法能够很好的鉴定甜瓜是否具有橙色果肉性状，本发明方法特异性好，准确率高。

本发明的鉴定方法可以以不同时期的甜瓜幼苗为材料，为不影响后续生长最佳时期是以甜瓜幼苗期(三叶一心期)为材料提取DNA。

利用本发明的鉴定方法可在甜瓜幼苗期(三叶一心期)判断果肉颜色，时间约为20天；而常规育种需要果实完全成熟才能进行判断，时间约为90天至140天，由此可见，利用本发明可有效缩短育种时间，加快育种速度。

实施例5

本实施例提供一种含有所述的引物对的检测甜瓜果肉颜色的试剂盒，该试剂盒可以用于检测甜瓜果肉颜色，其中包含如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种预示和鉴定甜瓜橙色果肉性状的分子标记及其引物与应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 946

<212> DNA

<213> 分子标记HF

<400> 1

ttactgttgg agcacttgtt tcacttccag gttgaattct ggtaaagaac ggcagaagtt 60

gagctcgagg tggcgatggc gatccatggc ctcggattct actgactctt cttcttcttc 120

ttcttttgct ccgtctgttg aatctgatcc ttcggataaa acttcagcca ggttggtgaa 180

ttcttgcttc tggtacctct gtatctggtt gtggttgaag cattttgagg caacgtctag 240

gaagtgaaat gaatgttggt ttgttgtgtt tgatgttgat ttacgtgatg gaattgtaaa 300

atgactggat agtttcttgt gttctttact ttttgagcac tgctacttga aaatgctcgt 360

gttatggttg aaggtttgga ttggattgat tggtcgtttt tgtcgtgatg atttgaagaa 420

tttgttatca gttcaatatt gcgaatacca taagttctgt tcttatccta caaacttttt 480

tatgcttatt aagtcggcca tctccttggt tttcttcatg tgacaattag gaataattta 540

tctgtaaatt aaatgttaac ttaacatgat tttatgcagt ttttgtatca tagagggacc 600

ggaaacagta caagattttg caaaaatgga actgcaagam attcaggaga acattcgaag 660

tcgtcgaaac aaaattttct tgcatatgga agaggtgaga cttagtggac attttgcgta 720

gtagtacgga ctattctcat gaactgattg attattcgcg catatgaaat tttaagtttt 780

tagatgtgtc caagatttcg ttaccttgaa aaatccttac ccagccaaag ccgtcatttg 840

gggggaccac tgccaagtat tagcattatt tttctgtgat gagagtgata aatatgtgtc 900

agacacttgg atttgggcta ttgatccttc ttcatcgttc tctatc 946

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> HF-F

<400> 2

ttactgttgg agcacttgt 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> HF-R

<400> 3

gatagagaac gatgaagaag g 21