一种草莓成花促进基因FaLFY5、表达载体、构建方法及应用与流程

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种草莓成花促进基因falfy5、表达载体、构建方法及应用。

背景技术：

成花是高等植物生长发育过程中的重要环节，成花代表了生殖生长的启动，能否适时成花对以收获花、果器官作为商品的农作物生产来讲意义重大；因此，植物成花机理方面的有关研究是生命科学领域研究的热点问题。

草莓(fragaria×ananassaduch.)是蔷薇科草莓属植物，果实柔软多汁，营养丰富，经济价值较高，在世界范围内广泛栽培，目前中国的草莓栽培面积和产量均居世界第一。我国草莓生产中促成和半促成栽培方式约占八成，在草莓设施栽培生产过程中，常存在因管理措施不到位而造成植株不能适时、正常花芽分化，从而影响其产量、产期和质量的现象；如何促进植株进行高质量的花芽分化是使其提早上市并提高产量和质量，以最终增加经济效益的关键技术环节。

lfy及其同源基因编码转录因子的激活蛋白，是花形成的最早标记基因之一，它的表达是花形成的充分且必要条件，起基因开关的作用，在从营养生长转入生殖生长的转变过程中发挥重要作用，并且正向调节随后的花器官特征基因如ap1等的启动。因此，开发新的lfy类基因对于研究草莓等植物花形发育具有良好的应用前景。

我们在草莓的花芽分化研究中分离获得了草莓中的一个新lfy类基因falfy5，目前未见其序列信息、载体构建及其基因功能报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种草莓成花促进基因falfy5、表达载体、构建方法及应用，提供一个新的草莓成花促进基因falfy5，促进植物提早成花、完善植物成花通路调控途径中具有良好的应用前景。

本发明提供了一种草莓成花促进基因falfy5，所述草莓成花促进基因falfy5的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了一种含有所述的草莓成花促进基因falfy5的表达载体，所述表达载体是将如seqidno.1所示的核苷酸序列插入植物表达载体pcambia1304中得到的。

本发明还提供了上述草莓成花促进基因falfy5的克隆方法，具体包括以下步骤：

步骤1，提取草莓花芽总rna，然后反转录获得cdna第一链；

步骤2，设计扩增引物，所述扩增引物为：

上游引物f1：5'-atggatccaaacgcgttcact-3'

下游引物r1：5'-tcagtagggaagcggatcagt-3'；

然后以反转录获得cdna第一链为模板，进行pcr扩增，得到草莓成花促进基因falfy5，并将草莓成花促进基因falfy5连接到pgm-t载体保存。

本发明还提供了上述表达载体的构建方法，具体包括以下步骤：

s1，提取草莓花芽总rna，然后反转录获得cdna链

s2，根据植物表达载体pcambia1304的多克隆微点序列特点，设计一对引入ncoⅰ和bglii酶切位点的引物序列，所述引物序列为：

上游引物f2：5'-catgccatggatggatccaaacgcgttcact-3'

下游引物r2：5'-gaagatcttcagtagggaagcggatcagt-3'；

再以步骤s1中的cdna链为模板，进行pcr扩增，得到的扩增产物连接到pgm-t载体，得到重组质粒pgm-t-falfy5；

s3，利用ncoⅰ和bglii双酶切重组质粒pgm-t-falfy5，回收长序列片段的pgm-t-falfy5酶切产物；和利用ncoⅰ和bglii双酶切植物表达载体pcambia1304，回收长序列片段的pcambia1304酶切产物；

s4，将pgm-t-falfy5酶切产物和pcambia1304酶切产物经t4dna连接酶连接，得到表达载体，并将所述表达载体命名为植物表达载体pcambia1304-falfy5。

本发明还提供了一种上述草莓成花促进基因falfy5在促进植物提早成花的分子育种中的应用。

本发明还提供了一种上述表达载体在促进植物提早成花的分子育种中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的一种草莓成花促进基因falfy5、表达载体、构建方法及应用，具有以下有益效果：

1、本发明通过草莓成花促进基因falfy5的表达载体构建与遗传转化，证明其草莓成花促进基因falfy5在植物成花过程中起正向促进调控作用，为深入揭示草莓成花分子调控机制和通过基因工程手段获得早成花草莓品种奠定了基础。

2、本发明构建的植物表达载体pcambia1304-falfy5，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，创制早花新品种，提早成花结实能力，应用于植物的遗传改良，促进植物提早成花、完善草莓等植物成花通路调控途径中具有良好的应用前景。

附图说明

图1是草莓成花促进基因falfy5的pcr扩增琼脂糖凝胶电泳；

其中，m：marker；1：草莓成花促进基因falfy5的cdna全长；

图2是植物表达载体pcambia1304-falfy5构建过程示意图；

图3是重组质粒pgm-t-falfy5经ncoⅰ和bglii双酶切后的凝胶电泳图；

m：marker；1：重组质粒pgm-t-falfy5；

图4是植物表达载体pcambia1304-falfy5经ncoⅰ和bglii双酶切后的凝胶电泳图；

m：marker；1：植物表达载体pcambia1304-falfy5；

图5是转草莓成花促进基因falfy5拟南芥植株pcr检测；

m：marker；1：植物表达载体pcambia1304-falfy5阳性对照；2：清水阴性对照；3：非转化株对照；4-6：转化株；

图6是转草莓成花促进基因falfy5拟南芥植株与对照株比较；

图6a：转草莓成花促进基因falfy5拟南芥植株；图6b：对照株。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，未注明的实验材料来源均为市售，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

大肠杆菌top10感受态细胞、pgm-t克隆载体购自天根公司(tiangen)，限制性内切酶、primescript^tmtmrtreagentkitwithgdnaeraser(perfectrealtime)试剂盒购自宝生物公司(takara)，axyprepdna凝胶回收试剂盒购自axygen公司。

本发明提供了一种草莓成花促进基因falfy5，所述草莓成花促进基因falfy5的核苷酸序列如seqidno.1所示。本发明还提供了一种含有所述的草莓成花促进基因falfy5的表达载体，所述表达载体是将如seqidno.1所示的核苷酸序列插入植物表达载体pcambia1304中得到的。seqidno.1所示的核苷酸序列即为草莓成花促进基因falfy5的开放阅读框序列。所述草莓成花促进基因falfy5的克隆方法，具体包括以下步骤：

步骤1，提取草莓花芽总rna，然后反转录获得cdna第一链；

(1)将0.05～0.1g草莓花芽在液氮中快速研碎，然后迅速移入1.5ml离心管中。

(2)向离心管中加入600μl预热的2g/100mlctab提取缓冲液，2g/100mlctab提取缓冲液预热前加入12μl的0.4g/100mlβ-巯基乙醇，65℃保温20～30min，期间颠倒混匀几次。

(3)加入600μl氯仿/异戊醇(v/v＝24:1)，轻轻颠倒混匀若干次，10000rpm离心10min。

(4)取约500μl上清液移入新的1.5ml离心管，加入等体积的氯仿/异戊醇(v/v＝24:1)，轻轻颠倒混匀若干次，10000rpm离心10min。

(5)取约400μl上清液移入新的1.5ml离心管中，加入1/4体积(100μl)的10mlicl，颠倒混匀，-20℃放置1h，10000rpm离心10min。

(6)弃上清，加入400μldepc水溶解沉淀，10000rpm离心10min。

(7)加入1/10体积(40μl)的3mol/μlnaac(ph＝5.2)，混匀后再加入2.5倍体积(100μl)的-20℃预冷的无水乙醇，颠倒混匀，-20℃放置30min，10000rpm离心10min。

(8)弃上清，加入300μldepc水，待沉淀溶解后，加入4μlrnase-freednasei(5u/μl)，buffer10μl，1μlrnasin(40u/μl)，轻轻混匀后37℃水浴4h。

(9)加入等体积的氯仿/异戊醇(v/v＝24:1)，轻轻颠倒混匀若干次，10000rpm离心10min。

(10)取70μl上清液加入1/10体积(7μl)的3mol/lnaac(ph＝5.2)，2.5倍体积-20℃预冷的无水乙醇，颠倒混匀几次，混匀后-20℃放置30min，10000rpm离心10min。

(11)弃上清，用70％乙醇洗涤rna沉淀2次，在超净工作台上风干rna，加入50μldepc水溶解沉淀。

(12)利用宝生物工程(大连)有限公司的primescript^tmtmrtreagentkitwithgdnaeraser(perfectrealtime)试剂盒将rna反转录为cdna，获得cdna第一链。

步骤2，设计扩增引物，所述扩增引物为：

上游引物f1(如seqidno.2所示)：

5'-atggatccaaacgcgttcact-3'

下游引物r1(如seqidno.3所示)：

5'-tcagtagggaagcggatcagt-3'；

然后以步骤1中反转录获得cdna第一链为模板，进行pcr扩增，得到草莓成花促进基因falfy5，并将草莓成花促进基因falfy5连接到pgm-t载体保存；

pcr扩增体系：1μlcdna，extaqdna聚合酶0.2μl，buffer2μl，dntps(2.5mmol/μl)1.6μl，上游引物f10.5μl，下游引物r10.5μl，最后用灭菌水补足到20μl。其中，上游引物f1和下游引物r1的浓度均为10μmol/l。

pcr扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性40s，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存。

草莓成花促进基因falfy5的pcr扩增琼脂糖凝胶电泳如图1所示，使用axyprepdna凝胶回收试剂盒回收pcr产物，回收后取1μl回收产物与pgm-t载体进行连接，并保存，操作步骤按pgm-t试剂盒说明书进行。连接后转化大肠杆菌top10感受态细胞，在表面涂有iptg和x-gal的amplb培养基平板上37℃培养。挑取单个白色克隆，pcr鉴定后送测序公司测序，得到如seqidno.1所示的草莓成花促进基因falfy5。

所述的草莓成花促进基因falfy5的表达载体，构建过程如图2所示，具体包括以下步骤：

s1，提取草莓花芽总rna，然后反转录获得cdna链

具体实验步骤同“草莓成花促进基因falfy5的克隆方法”的步骤1。

s2，根据植物表达载体pcambia1304的多克隆微点序列特点，设计一对引入ncoⅰ和bglii酶切位点的引物序列，所述引物序列为：

上游引物f2(如seqidno.4所示)：

5'-catgccatggatggatccaaacgcgttcact-3'

下游引物r2(如seqidno.5所示)：

5'-gaagatcttcagtagggaagcggatcagt-3'；

再以步骤s1中的cdna链为模板，进行pcr扩增，得到的扩增产物连接到pgm-t载体，得到重组质粒pgm-t-falfy5；

s3，利用ncoⅰ和bglii双酶切重组质粒pgm-t-falfy5，回收短序列片段的pgm-t-falfy5酶切产物(双酶切后具有长、短两个序列片段产物，回收短序列片段产物)；利用ncoⅰ和bglii双酶切植物表达载体pcambia1304，回收长序列片段的pcambia1304酶切产物(双酶切后具有长、短两个序列片段产物，回收长序列片段产物)；

重组质粒pgm-t-falfy5的酶切体系如下：10×buffer2μl，ncoⅰ和bglii各1μl，bsa2μl，重组质粒pgm-t-falfy510μl，ddh2o4μl；其中，ncoⅰ和bglii的浓度均为10u/μl；酶切条件：37℃酶切反应过夜(12h)。酶切后进行凝胶电泳，电泳结果如图3所示，回收pgm-falfy5酶切产物的短序列片段(1224bp)。

植物表达载体pcambia1304的酶切体系如下：10×buffer2μl，ncoⅰ和bglii各1μl，bsa2μl，植物表达载体pcambia130410μl，ddh2o4μl；其中，ncoⅰ和bglii的浓度均为10u/μl；酶切条件：37℃酶切反应过夜(12h)。酶切后进行凝胶电泳，回收pcambia1304酶切产物的长序列片段。

s4，将短序列片段的pgm-t-falfy5酶切产物和长序列片段的pcambia1304酶切产物经t4dna连接酶连接，得到表达载体，并将所述表达载体命名为植物表达载体pcambia1304-falfy5。

连接体系如下：10×t4dnaligasebuffer1μl，短序列片段的pgm-t-falfy5酶切产物5μl，长序列片段的pcambia1304酶切产物2μl，t4dnaligase1μl，加ddh2o至20μl。

16℃过夜(12h)连接后进行大肠杆菌top10感受态细胞转化，铺kan抗性lb平板，过夜培养后挑菌进行pcr检测，对检测正确的菌点摇菌后提取质粒，用ncoⅰ和bglii内切酶进行酶切，可获得大小分别对应长序列片段的pcambia1304酶切产物和短序列片段的pgm-t-falfy5酶切产物的两条带(图4)，测序后证明获得重组后的植物表达载体质粒pcambia1304-falfy5。

下面以拟南芥为例，利用植物表达载体pcambia1304-falfy5对拟南芥进行遗传转化，具体包括：

1.农杆菌菌株eha105感受态制备

挑取农秆菌菌株eha105单个菌落接种于4mlyep培养基中(含抗生素rif100mg/l+str50mg/l)，28℃，200rpm振荡培养至od值至0.5；用1.5ml离心管取1.5ml摇好的菌液，冰上冷却10min后4℃，5000rpm离心5min，弃去上清液，沉淀用等体积的预冷的25mmcacl2悬浮，冰上放置20min后4℃，5000rpm离心5min，每管用50μl的预冷的25mm的cacl2重新悬浮沉淀，冰上放置20min后保存备用。

2.含植物表达载体pcambia1304-falfy5的eha105工程菌菌株获得

含重组植物表达载体质粒的eha105工程菌采用冻融法制备，具体步骤如下：

取1管保存的农杆菌eha105菌株感受态细胞，加入1μg纯化的植物表达载体pcambia1304-falfy5，摇匀后置-20℃冰箱内30min，使其结冰；然后取出置于42℃水浴2min，冰上2min，加入800μlyep液体培养基；再在42℃水浴2min，离心管侧放于摇床，28℃，175-190rpm培养4-5h；4500rpm离心浓缩至100μl，涂布于含100mg/lrif和50mg/lkan的lb平板上，28℃培养直至形成单菌落。

对获得的单菌落进行pcr鉴定，pcr采用的引物、pcr扩增体系、程序同步骤1.2，能扩增出长度为1224bp片段的单菌落即为含植物表达载体pcambia1304-falfy5的eha105工程菌菌株。

3.拟南芥遗传转化

播种野生哥伦比亚型拟南芥种子，培养至大部分植株花朵露白，但未张开时进行农杆菌的侵染转化。

转化前两天挑取含植物表达载体pcambia1304-falfy5的eha105工程菌菌株的新鲜单菌落，于附加kan50mg/l、rif100mg/l的yep液体培养基中。28℃振荡培养至od600为0.6～0.8，于超净台上按照1：100比例取2ml菌液于灭菌的新鲜yep液体培养基中继续培养，培养至od600为1.5～3.0时收集菌液，于低温高速离心机上4℃，4000rpm离心10min收集菌体。用10％蔗糖(含0.02％silwet)的1/2ms溶液稀释至od600约为0.8～1.0左右备用。

拟南芥转化采用花序浸染法，将野生型拟南芥露白花序在上述菌液中浸泡50s左右后进行避光保湿处理，20h后至于人工气候箱内正常培养。3-4天后用同样方法再次转化、暗培养，如新开的花多可再重复转化。正常培养至果颊成熟，断水，收获t0代种子。

4.拟南芥转化株筛选及鉴定

收获的t0代种子晒干后于4℃避光保存，筛选时在超净台上用70％乙醇消毒后用无水乙醇脱去多余水分，超净台吹干后播于含hyg50mg/l的1/2ms培养基上培养筛选。

挑选根系正常、叶片绿色的抗性株系转移至营养钵中，抗性株系和野生型对照植株均于非诱导性的短日照培养条件下(12h光照/12h黑暗，22～24℃)生长。

提取不同抗性株系及野生型对照植株拟南芥的基因组dna，以其为模板分别进行pcr扩增，鉴定是否含有草莓成花促进基因falfy5。以植物表达载体pcambia1304-falfy5为阳性对照，以野生型拟南芥和无菌水为阴性对照进行pcr扩增。pcr采用的引物、pcr扩增体系、程序同步骤1.2。对pcr产物进行电泳，根据目的基因1024bp条带的有无来鉴定是否为转化株，转草莓成花促进基因falfy5拟南芥植株pcr检测结果如图5所示，其中m：marker；1：植物表达载体pcambia1304-falfy5阳性对照；2：清水阴性对照；3：非转化株对照；4-6：转化株，含有草莓成花促进基因falfy5的样品可检测到1224bp大小的条带，说明草莓成花促进基因falfy5以成功转入拟南芥。

5.转基因植物鉴定

(1)转基因拟南芥

非转基因的拟南芥设为对照组，转入含有草莓成花促进基因falfy5的植物表达载体pcambia1304-falfy5的拟南芥转化株为试验组，将生长大小一致的两组材料同时移栽至光照培养箱中，在处于对拟南芥成花来讲为非诱导性条件的短日照光照条件下生长，开花结果如图6所示，结果表明转草莓成花促进基因falfy5的拟南芥植株明显早花，其成花时间平均比对照组约提前2周左右。说明草莓成花促进基因falfy5的表达调控了拟南芥的生长发育进程，促进了提早成花。

(2)转基因烟草

我们以烟草作为研究对象，转入草莓成花促进基因falfy5的植物表达载体pcambia1304-falfy5的烟草转化株为试验组，以非转基因的烟草为对照组，将生长大小一致的两组材料同时移栽至光照培养箱中，在处于对烟草成花来讲为非诱导性条件的短日照光照条件下生长，结果表明转草莓成花促进基因falfy5的烟草植株明显早花，其成花时间平均比对照组约提前2周左右。

综上所述，本发明构建了含有草莓成花促进基因falfy5的植物表达载体pcambia1304-falfy5，可导入植物中调控植物提早成花。其中草莓成花促进基因falfy5的核苷酸序列为首次报道。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110>沈阳农业大学

<120>一种草莓成花促进基因falfy5、表达载体、构建方法及应用

<160>5

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1224

<212>dna

<213>草莓（fragaria×ananassa）

<400>1

atggatccaaacgcgttcactgcgagtttgttcaagtgggacctccgtggcatgacggtt60

ccgcctaaccggcttccgctcgaggcggcggccacagttgctccccaacaagccgcgggt120

tattcggtgcgggcgccgagggagattggggggctggaggagatgttccgggcttatgga180

gtgaggtactacacggcggcaagaatagcggagctcgggttcactgtgagcacgcttttg240

gacatgagggatgaggagcttgacgacatgatgaacagcgtgtgtcagtttttccgggtg300

gagctactcgtcggggagaggtacggcatcaagtctgccatccgagctgagaagagacga360

cttgaggaggaggaggactcgcggcggcgccacgctctctccggtgacaccgacgctatg420

gatgctccctcacaagaagggctgtcggaggagccggtgcaacaagagagggagatggtg480

gggagtggcggaggagcagcatgggaagggggtacggcggcggagaggcggaagaagctg540

aggaggattgggagaggtgatgggcataggagtagcaacgagggtattgatgatgacgag600

gatgaagagaacgatgacgggatcaatggaggaggaggggagcgcccgggtagggcatta660

ggtatgaggggtaccggtggtgggagagagagacagagggagcaccccttcgtcgtgacg720

gaggctggggaggtggcacgtggcaaaaagaacggactggattacctcttccatctctac780

gagcagtgccatcagtttttgacccaggtgcggaacattgccaaggagcgcggtgaaaaa840

tgtcccaccaaggtcacaaaccaggtgtttagatatgcgaaagaggaaggagcgaactac900

atcaacaagccgaaaatgcggcactacgttcactgctacgcgctgcattgtctggacgag960

gagcgttcaattgagctgaggcgtgagtgcaagctgcgaggagagaacatcggggcatgg1020

aggcaggcgtgctacaggcctgttgtggaaatagctgcaggccaaggttgggacattgac1080

gccattttcagtgcacatcctcgactatctgtttggtatgttcctaccaaacttcgtcag1140

ctttgtcacgccgagcgcaaccatgctgctgcctctagctccgcctcaggtggaagcggt1200

actactgatccgcttccctactga1224

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

atggatccaaacgcgttcact21

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tcagtagggaagcggatcagt21

<210>4

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

catgccatggatggatccaaacgcgttcact31

<210>5

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gaagatcttcagtagggaagcggatcagt29