本发明涉及一种活菌计数法，尤其涉及一种改进的细菌活菌计数方法。
背景技术：
：目前常用的活菌计数法是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计，即取一定容量菌悬液，作一系列10倍倍比稀释，然后选择合适浓度的稀释液吸取定量稀释液，置于琼脂平板中培养，根据各浓度梯度稀释液在琼脂平板中生长繁殖出的细菌菌落的数量，推算出原菌悬液或培养物中的活菌数。该法在实际操作过程中存在以下缺点：1.试管长度较长﹑体积较大，占用灭菌锅的空间也大。试管具有圆形的底部，因此在超净台操作时必须使用试管架，占用了超净台的内部空间，如果试管较多而试管架又较少时，则就必须将试管倾斜放置，操作比较麻烦。2.一个平皿只能对样品一个稀释浓度进行一次测样，如果某个样品具有3种不同的稀释浓度，每个稀释浓度需要进行3个重复样检测，则必须使用9块平皿。3.活菌稀释液取样量为0.1ml-0.2ml，0.1ml-0.2ml菌悬液的含菌量在30-300之间才有计数的意义，也就是说每个重复样平皿上要有30-300个单菌落，计数速度比较慢。4.菌悬液取样量为0.1ml-0.2ml，0.1ml-0.2ml菌悬液含菌量在30-300之间，在操作过程中细菌难以完全分散，分布不均匀、较易出现连片或连线的情况，给计数带来不便。技术实现要素：本发明针对以不足，提供一种操作简单、方便快捷、提高计数效率的改进的细菌活菌计数方法。本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种改进的细菌活菌计数方法，其特征在于，包括操作步骤：使用抗生素药瓶对活菌发酵液或者培养物进行浓度梯度稀释，振荡均匀后，用安装上7号金属针头的注射器垂直滴在相应的琼脂细菌计数平板上，静置后置于恒温培养箱中培养后取出直接计数即可。根据所述的一种改进的细菌活菌计数方法，其特征在于，包括分装抗生素药瓶无菌液体的操作步骤，抗生素药瓶和瓶盖要配套使用，方法是：先将清洗洁净且干燥后的抗生素药瓶和瓶盖经121℃-126℃×30min-60min的灭菌处理，然后40℃-120℃烘干至完全干燥后冷却至室温，再用微量移样器或无菌吸管依次向抗生素药瓶中加入经过121℃-126℃×30min-60min的灭菌处理后冷却至室温的9Bml无菌生理盐水，无菌操作取出瓶盖盖上，放置在超净工作台中备用；再向抗生素药瓶中加入Bml待稀释菌液，使用漩涡振荡器对加有Bml待稀释菌液、总装量为10Bml的抗生素药瓶进行振荡稀释，振荡时间为15s-90s；使用安装上7号金属针头的注射器将振荡后的稀释菌液垂直滴在相应的细菌计数平板上，每个平板中滴入1-100滴，操作完成后平板静置的时间为5min-360min。根据所述的一种改进的细菌活菌计数方法，其特征在于，包括操作步骤：清洗抗生素药瓶和瓶盖，晾干或烘干后分别装入无菌布袋扎好口后备用；清洗培养皿晾干或烘干后以5-11个为一组用报纸包好备用；将7号金属针头装入培养皿中和注射器、镊子、Bml微量移液器、5Bml微量移液器一起用报纸包好备用；用三角烧瓶分别装入固体琼脂培养基与食盐浓度为0.85%的生理盐水，用报纸扎好瓶口后备用；将以上材料依次放入高压灭菌锅中，盖上盖后开启电源升温，设定灭菌条件为121℃-126℃恒温30min-90min；取出自然降温至室温，将其它灭菌后的材料置烘箱中高温恒温置干燥无水分，然后取出放置于无菌室中自然降至室温。根据所述的一种改进的细菌活菌计数方法，其特征在于，包括操作步骤：配制新洁尔灭消毒液对环境和空间消毒后，开启紫外灯管进行紫外线消毒。根据所述的一种改进的细菌活菌计数方法，其特征在于，包括细菌计数操作步骤：其中，（1）倒平板将固体琼脂培养基重新加热融化后降温至45-100℃倒平板；（2）分装9Bml无菌生理盐水于抗生素瓶中并塞好瓶塞点燃超净工作台中的酒精灯，用无菌镊子夹取浸泡在75%酒精中的棉花团擦拭双手及超净工作台台面，取出5Bml的微量移液器，将移液量设定为4.5Bml，将抗生素瓶取出排放在超净工作台台面，用微量移液器依次吸取两次共9Bml无菌生理盐水于抗生素瓶中，然后用无菌镊子夹取瓶塞轻轻盖上抗生素瓶；点燃超净工作台中的酒精灯，用无菌镊子夹取浸泡在75%酒精中的棉花团擦拭双手及超净工作台台面，取出无菌吸管，将抗生素瓶取出排放在超净工作台台面，用吸管吸取9Bml无菌生理盐水于抗生素瓶中，然后用无菌镊子夹取瓶塞轻轻盖上抗生素瓶；（3）样品准备粉末样品：利用百分之一或万分之一天平准确的称取样品X克加入到10Xml无菌生理盐水的三角烧瓶中，置摇床上0r/min-300r/min振荡0-120min；半固体样品、膏状样品：将灭过菌的烧杯放在百分之一或万分之一天平上，清零后，用无菌取样匙取X1克膏状样品于烧杯中，将烧杯移至超净工作台中，准确的加入样品重量10倍的无菌生理盐水，然后放入经过灭菌的搅拌子，开启磁力搅拌器进行搅拌，搅拌时间0-120min；液体样品：用微量移液器定量移取X2ml液体样品于无菌三角烧瓶中，用微量移液器或无菌吸管准确的加入液体样品体积9倍的无菌生理盐水，然后放入经过灭菌的搅拌子，开启磁力搅拌器进行搅拌，搅拌时间0-120min；以上样品搅拌或振荡均匀后记为10-1；（4）10倍浓度梯度稀释取微量移液器吸取Bml10-1稀释液于含9Bml生理盐水的抗生素瓶中，置漩涡振荡器中振荡25秒，记为10-2；用微量移液器吸取Bml10-2的菌悬液放入含9Bml生理盐水的抗生素瓶中，置漩涡振荡器中振荡25秒，记为10-3；用微量移液器吸取Bml10-3的菌悬液放入含9Bml生理盐水的抗生素瓶中，置漩涡振荡器中振荡25秒，记为10-4；用微量移液器吸取Bml10-4的菌悬液放入含9Bml生理盐水的抗生素瓶中，置漩涡振荡器中振荡25秒，记为10-5；依次类推，分别得到10-6、10-7、10-8、10-9、10-10的活菌稀释液；（5）细菌计数滴定选取合适梯度的菌悬液，如10-A、10-(A+1)、10-(A+2)，取一块固体琼脂平板，在底部用记号笔将平皿平均分成120度的三个扇形区域，并依次标记10-A、10-(A+1)、10-(A+2)；用安装有7号金属针头的注射器吸取1ml10-(A+2)菌悬液，往超净工作台中的废液缸中排出0.2ml菌悬液清洗金属针头，然后将注射器垂直放置于固体琼脂平板正上方，轻压注射器活塞将10-(A+2)菌悬液0.01ml滴入固体琼脂平板10-(A+2)区域，依次滴三滴，完成10-(A+2)菌悬液三个重复样测定；滴定完后，将注射器内残留的10-(A+2)菌悬液排入超净工作台中的废液缸中，然后用此注射器吸取1ml10-(A+1)菌悬液全部排入到超净工作台中的废液缸中清洗注射器及针头，然后吸取1ml10-(A+1)菌悬液，将注射器垂直放置于固体琼脂平板正上方，轻压注射器活塞将10-(A+1)菌悬液0.01ml滴入固体琼脂平板10-(A+1)区域，依次滴三滴，完成10-(A+1)菌悬液三个重复样测定；滴定完后，将注射器内残留的10-(A+1)菌悬液排入超净工作台中的废液缸中，然后用此注射器吸取1ml10-A菌悬液全部排入到超净工作台中的废液缸中清洗注射器及针头，然后吸取1ml10-A菌悬液，将注射器垂直放置于固体琼脂平板正上方，轻压注射器活塞将10-A菌悬液0.01ml滴入固体琼脂平板10-A区域，依次滴三滴，完成10-A菌悬液三个重复样测定；（6）培养将固体琼脂平板在超净工作台中静置10-120min后，倒置用报纸包好放入蜡烛缸中置恒温箱中培养24h-48h；（7）细菌计数经过24h-48h培养后，取出固体琼脂平板计数；三个浓度梯度三个重复细菌计数结果如下表：10-A10-(A+1)10-(A+2)多不可计454447454,该样品细菌总数为：（（45+44+47）/3）×10(A+1)×100=4.53×10(A+4)CFU/ml，或（（45+44+47）/3）×10(A+1)×100=4.53×10(A+4)CFU/g。本发明所述方法使用抗生素药瓶代替试管，减少了灭菌锅的占用空间，由于抗生素药瓶的底部是水平的，因此可直接放置在超净工作台内，节省了空间。本发明使用安装上7号金属针头的注射器将振荡后的稀释菌液垂直滴在相应的细菌计数平板上，在直径为9cm的培养皿中可滴入1-100滴，在一块平皿上可实现对某个具有3种不同稀释浓度的样品进行每个稀释浓度3个重复样的检测，而不必使用9块平皿。本发明使用7号金属针头代替微量移样器，经过上万次的滴定试验证明，当针头垂直于地面时，缓慢推动活塞时7号金属针头自然滴落液体的体积为0.01ml，相应的其中含有3-30个活菌即可满足细菌计数的要求。直接使用7号金属针头实现自然滴落，方便快捷、提高了计数效率。本发明使用7号金属针头自然滴落0.01ml，液体分布的面积约为0.5-2cm2，细菌数量少故分布均匀，很难出现细菌连片或连线生长的现象，使用效果好。具体实施方式以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。一种改进的细菌活菌计数方法，包括操作步骤：使用抗生素药瓶对活菌发酵液或者培养物进行浓度梯度稀释，振荡均匀后，用安装上7号金属针头的注射器垂直滴在相应的琼脂细菌计数平板上，静置后置于恒温培养箱中培养后取出直接计数即可。所述的一种改进的细菌活菌计数方法包括分装抗生素药瓶无菌液体的操作步骤，抗生素药瓶和瓶盖要配套使用，方法是：先将清洗洁净且干燥后的抗生素药瓶和瓶盖经121℃-126℃×30min-60min的灭菌处理，然后40℃-120℃烘干至完全干燥后冷却至室温，再用微量移样器或无菌吸管依次向抗生素药瓶中加入经过121℃-126℃×30min-60min的灭菌处理后冷却至室温的9Bml无菌生理盐水，无菌操作取出瓶盖盖上，放置在超净工作台中备用；再向抗生素药瓶中加入Bml待稀释菌液，使用漩涡振荡器对加有Bml待稀释菌液、总装量为10Bml的抗生素药瓶进行振荡稀释，振荡时间为15s-90s；使用安装上7号金属针头的注射器将振荡后的稀释菌液垂直滴在相应的细菌计数平板上，每个平板中滴入1-100滴，操作完成后平板静置的时间为5min-360min。所述的一种改进的细菌活菌计数方法还包括操作步骤：清洗抗生素药瓶和瓶盖，晾干或烘干后分别装入无菌布袋扎好口后备用；清洗培养皿晾干或烘干后以5-11个为一组用报纸包好备用；将7号金属针头装入培养皿中和注射器、镊子、Bml微量移液器、5Bml微量移液器一起用报纸包好备用；用三角烧瓶分别装入固体琼脂培养基与食盐浓度为0.85%的生理盐水，用报纸扎好瓶口后备用；将以上材料依次放入高压灭菌锅中，盖上盖后开启电源升温，设定灭菌条件为121℃-126℃恒温30min-90min；取出自然降温至室温，将其它灭菌后的材料置烘箱中高温恒温置干燥无水分，然后取出放置于无菌室中自然降至室温。所述的一种改进的细菌活菌计数方法还包括操作步骤：配制新洁尔灭消毒液对环境和空间消毒后，开启紫外灯管进行紫外线消毒。所述的一种改进的细菌活菌计数方法还包括细菌计数操作步骤：其中，（1）倒平板将固体琼脂培养基重新加热融化后降温至45-100℃倒平板；（2）分装9Bml无菌生理盐水于抗生素瓶中并塞好瓶塞点燃超净工作台中的酒精灯，用无菌镊子夹取浸泡在75%酒精中的棉花团擦拭双手及超净工作台台面，取出5Bml的微量移液器，将移液量设定为4.5Bml，将抗生素瓶取出排放在超净工作台台面，用微量移液器依次吸取两次共9Bml无菌生理盐水于抗生素瓶中，然后用无菌镊子夹取瓶塞轻轻盖上抗生素瓶；点燃超净工作台中的酒精灯，用无菌镊子夹取浸泡在75%酒精中的棉花团擦拭双手及超净工作台台面，取出无菌吸管，将抗生素瓶取出排放在超净工作台台面，用吸管吸取9Bml无菌生理盐水于抗生素瓶中，然后用无菌镊子夹取瓶塞轻轻盖上抗生素瓶；（3）样品准备粉末样品：利用百分之一或万分之一天平准确的称取样品X克加入到10Xml无菌生理盐水的三角烧瓶中，置摇床上0r/min-300r/min振荡0-120min；半固体样品、膏状样品：将灭过菌的烧杯放在百分之一或万分之一天平上，清零后，用无菌取样匙取X1克膏状样品于烧杯中，将烧杯移至超净工作台中，准确的加入样品重量10倍的无菌生理盐水，然后放入经过灭菌的搅拌子，开启磁力搅拌器进行搅拌，搅拌时间0-120min；液体样品：用微量移液器定量移取X2ml液体样品于无菌三角烧瓶中，用微量移液器或无菌吸管准确的加入液体样品体积9倍的无菌生理盐水，然后放入经过灭菌的搅拌子，开启磁力搅拌器进行搅拌，搅拌时间0-120min；以上样品搅拌或振荡均匀后记为10-1；（4）10倍浓度梯度稀释取微量移液器吸取Bml10-1稀释液于含9Bml生理盐水的抗生素瓶中，置漩涡振荡器中振荡25秒，记为10-2；用微量移液器吸取Bml10-2的菌悬液放入含9Bml生理盐水的抗生素瓶中，置漩涡振荡器中振荡25秒，记为10-3；用微量移液器吸取Bml10-3的菌悬液放入含9Bml生理盐水的抗生素瓶中，置漩涡振荡器中振荡25秒，记为10-4；用微量移液器吸取Bml10-4的菌悬液放入含9Bml生理盐水的抗生素瓶中，置漩涡振荡器中振荡25秒，记为10-5；依次类推，分别得到10-6、10-7、10-8、10-9、10-10的活菌稀释液；（5）细菌计数滴定选取合适梯度的菌悬液，如10-A、10-(A+1)、10-(A+2)，取一块固体琼脂平板，在底部用记号笔将平皿平均分成120度的三个扇形区域，并依次标记10-A、10-(A+1)、10-(A+2)；用安装有7号金属针头的注射器吸取1ml10-(A+2)菌悬液，往超净工作台中的废液缸中排出0.2ml菌悬液清洗金属针头，然后将注射器垂直放置于固体琼脂平板正上方，轻压注射器活塞将10-(A+2)菌悬液0.01ml滴入固体琼脂平板10-(A+2)区域，依次滴三滴，完成10-(A+2)菌悬液三个重复样测定；滴定完后，将注射器内残留的10-(A+2)菌悬液排入超净工作台中的废液缸中，然后用此注射器吸取1ml10-(A+1)菌悬液全部排入到超净工作台中的废液缸中清洗注射器及针头，然后吸取1ml10-(A+1)菌悬液，将注射器垂直放置于固体琼脂平板正上方，轻压注射器活塞将10-(A+1)菌悬液0.01ml滴入固体琼脂平板10-(A+1)区域，依次滴三滴，完成10-(A+1)菌悬液三个重复样测定；滴定完后，将注射器内残留的10-(A+1)菌悬液排入超净工作台中的废液缸中，然后用此注射器吸取1ml10-A菌悬液全部排入到超净工作台中的废液缸中清洗注射器及针头，然后吸取1ml10-A菌悬液，将注射器垂直放置于固体琼脂平板正上方，轻压注射器活塞将10-A菌悬液0.01ml滴入固体琼脂平板10-A区域，依次滴三滴，完成10-A菌悬液三个重复样测定；（6）培养将固体琼脂平板在超净工作台中静置10-120min后，倒置用报纸包好放入蜡烛缸中置恒温箱中培养24h-48h；（7）细菌计数经过24h-48h培养后，取出固体琼脂平板计数；三个浓度梯度三个重复细菌计数结果如下表：10-A10-(A+1)10-(A+2)多不可计454447454,该样品细菌总数为：（（45+44+47）/3）×10(A+1)×100=4.53×10(A+4)CFU/ml，或（（45+44+47）/3）×10(A+1)×100=4.53×10(A+4)CFU/g。该方法使用抗生素药瓶代替常规的试管对活菌发酵液或者培养物进行10倍的浓度梯度稀释，利用漩涡振荡器振荡均匀后，用安装上7号金属针头的注射器垂直滴在相应的琼脂细菌计数平板上，静置一段时间后置于恒温培养箱中培养一定时间后取出直接计数即可。该方法是在原有琼脂平板涂布基础改进而来，具有操作方便、节省实验材料、重复数多、重复性好、效率高等优点。在本发明中，抗生素药瓶和瓶盖要配套使用，分装抗生素药瓶无菌液体的方法是：先将清洗洁净且干燥后的抗生素药瓶和瓶盖经121℃-126℃×30min-60min的灭菌处理，然后40℃-120℃烘干至完全干燥后冷却至室温。再用5ml微量移样器依次向抗生素药瓶中加入经过121℃-126℃×30min-60min的灭菌处理后冷却至室温的4.5ml无菌生理盐水（食盐的质量分数为0.85-0.90%），无菌操作取出瓶盖盖上，放置在超净工作台中备用。再向抗生素药瓶中加入0.5ml待稀释菌液，使用漩涡振荡器对加有0.5ml待稀释菌液、总装量为5ml的抗生素药瓶进行振荡稀释，振荡时间为15s-90s。使用安装上7号金属针头的注射器将振荡后的稀释菌液垂直滴在相应的细菌计数平板上，在直径为9cm的培养皿中滴入1-100滴，操作完成后平皿静置的时间为5min-360min。以乳酸菌发酵液液体细菌计数为例，介绍本发明所述方法。1.器械的要求和工艺参数的控制。所需设备与器材要求：2.操作器材及材料准备。清洗抗生素药瓶和瓶塞，晾干或烘干后分别装入无菌布袋扎好口后备用。清洗培养皿晾干或烘干后以5-11个为一组用报纸包好备用。将7号金属针头装入培养皿中与注射器、镊子、1ml微量移液器、5ml微量移液器一起用报纸包好备用。用500ml三角烧瓶分别装入固体琼脂培养基与食盐浓度为0.85%的生理盐水，用报纸扎好瓶口后备用。将以上材料依次放入高压灭菌锅中，盖上盖后开启电源升温，设定灭菌条件为121℃恒温30min。灭菌完成后，分别取出装入固体琼脂培养基与装生理盐水的500ml三角烧瓶自然降温至室温，将其它灭菌完成的材料置烘箱中100℃恒温置干燥无水分，然后取出放置于无菌室中自然降温至室温。3.无菌室及超净工作台无菌化处理。3.1、0.1%新洁尔灭消毒液配制。配料：用量筒量取无菌水9800ml倒入配液桶中，放冷至室温，再用量筒量取200ml5%新洁尔灭倒入无菌水中，搅拌均匀后备用，在容器上贴标签，注明品名、浓度、配制时间、配制人，24小时更换。3.2、用0.1%新洁尔灭消毒液对环境和空间消毒。将经过121℃-126℃恒温30min-120min高压灭菌的毛巾放入0.1%新洁尔灭消毒液中，取出擦拭超净工作台操作平面、无菌室桌面或台面，然后将无菌室地面擦拭一遍。将0.1%新洁尔灭消毒液装入喷壶中，消毒无菌室空间。3.3、紫外线消毒。依次关上缓冲间及无菌室的门，开启缓冲间及无菌室的消毒用紫外灯管，照射60min后关闭，开启无菌风循环5min后关闭。4.细菌计数操作。4.1、倒平板。将固体琼脂培养基重新加热融化后降温至55-60℃，在超净工作台点燃酒精灯，将培养皿盖斜放在培养皿底上，将固体琼脂培养基倾倒入培养皿中，每个培养皿中倾入15-20ml，完成后，拉下超净工作台挡风玻璃，开启无菌风及紫外灯，计时50min。目的是利用无菌风吹干固体琼脂培养板上的冷凝水。4.2、分装4.5ml无菌生理盐水于抗生素瓶中并塞好瓶塞。点燃超净工作台中的酒精灯，用无菌镊子夹取浸泡在75%酒精中的棉花团擦拭双手及超净工作台台面，取出5ml的微量移液器，将移液量设定为4.5ml，将抗生素瓶取出排放在超净工作台台面，用微量移液器依次吸取4.5ml无菌生理盐水于抗生素瓶中，然后用无菌镊子夹取瓶塞轻轻盖上抗生素瓶。4.3、样品准备。将乳酸菌发酵液轻轻旋转混合均匀。置于超净工作台中。4.4、10倍浓度梯度稀释。取出1ml微量移液器吸取0.5ml发酵液放入含4.5ml生理盐水的抗生素瓶中，置漩涡振荡器中振荡25秒，记为10-1。用1ml微量移液器吸取0.5ml10-1的菌悬液放入含4.5ml生理盐水的抗生素瓶中，置漩涡振荡器中振荡25秒，记为10-2。用1ml微量移液器吸取0.5ml10-2的菌悬液放入含4.5ml生理盐水的抗生素瓶中，置漩涡振荡器中振荡25秒，记为10-3。用1ml微量移液器吸取0.5ml10-3的菌悬液放入含4.5ml生理盐水的抗生素瓶中，置漩涡振荡器中振荡25秒，记为10-4。依次类推，分别得到10倍稀释的菌悬液。4.5、细菌计数滴定。选取合适梯度的菌悬液，如10-5、10-6、10-7。取一块固体琼脂平板，在底部用记号笔将平皿平均分成120度的三个扇形区域，并依次标记10-5、10-6、10-7。用安装有7号金属针头的注射器吸取1ml10-7菌悬液，往超净工作台中的废液缸中排出0.2ml菌悬液清洗金属针头，然后将注射器垂直放置于固体琼脂平板正上方，轻压注射器活塞将10-7菌悬液0.01ml滴入固体琼脂平板10-7区域，依次滴三滴，完成10-7菌悬液三个重复样测定。滴定完后，将注射器内残留的10-7菌悬液排入超净工作台中的废液缸中，然后用此注射器吸取1ml10-6菌悬液全部排入到超净工作台中的废液缸中清洗注射器及针头，然后吸取1ml10-6菌悬液，将注射器垂直放置于固体琼脂平板正上方，轻压注射器活塞将10-6菌悬液0.01ml滴入固体琼脂平板10-6区域，依次滴三滴，完成10-6菌悬液三个重复样测定。滴定完后，将注射器内残留的10-6菌悬液排入超净工作台中的废液缸中，然后用此注射器吸取1ml10-5菌悬液全部排入到超净工作台中的废液缸中清洗注射器及针头，然后吸取1ml10-5次方菌悬液，将注射器垂直放置于固体琼脂平板正上方，轻压注射器活塞将10-5菌悬液0.01ml滴入固体琼脂平板10-5次方区域，依次滴三滴，完成10-5菌悬液三个重复样测定。这样，就完成了利用一块平皿对一个样品3个不同稀释浓度（10-5、10-6、10-7），每个稀释浓度3个重复（每个120度扇形区域滴3滴）的测定。正常情况下采用平板涂布法或者倾倒法需使用9块平皿。本次测定仅使用7个抗生素瓶与一块平皿，不使用试管架，减少了超净工作台内部空间的占用。4.6、培养。将固体琼脂平板在超净工作台中静置30min后，倒置用报纸包好放入蜡烛缸中置37℃恒温箱中培养24h-48h后。4.7、细菌计数。经过36h培养后，取出固体琼脂平板计数。三个浓度梯度三个重复细菌计数结果如下表:10-510-610-7多不可计454447454该乳酸菌发酵液液体细菌总数为：（（45+44+47）/3）×106×100=45.3×108CFU/ml。当前第1页1 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