本发明涉及一种微生物限度检查方法，尤其是一种通经活络胶囊中微生物限度检查方法，属于化学检测
技术领域：
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背景技术：
：孕坤通胶囊为治疗血瘀证不孕女性，具有活血化瘀、通经活络的功效，药品含有赤芍、没药、败酱草、路路通、枳实、泽泻等成分。根据其用药途径和制法，应进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定，及控制菌——大肠埃希菌检查。技术实现要素：针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种操作简单，方法可行的通经活络胶囊中微生物限度检查方法。为解决上述技术问题，本发明的技术方案是这样的：一种通经活络胶囊中微生物限度检查方法，所述胶囊为孕坤通胶囊，该方法依次包括下述步骤：1)菌液制备取经33℃培养24h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌胰酪大豆胨液体培养液及25℃培养24h的白色念珠菌沙氏葡萄糖液体培养液，用0.9％无菌氯化钠溶液制成含菌数为1000～10000cfu/ml的菌悬液，备用；取经25℃培养7天的黑曲霉沙氏葡萄糖琼脂斜面，加入5ml含0.05％聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，用带有棉花的球形吸管吸出孢子悬液，用含0.05％聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液制成含孢子数为1000～10000cfu/ml的孢子悬液，备用；2)供试液制备取本品10g，加入预热至45℃的胰酪大豆胨液体培养基至100ml，45℃气浴振摇20min，混匀，作为1:10供试液；3)方法建立及回收率试验确定采用稀释法进行需氧菌总数的测定、采用常规法进行霉菌和酵母菌总数的测定；4)控制菌检验方法的建立及验证采用常规法进行控制菌的检查。进一步的，上述的一种通经活络胶囊中微生物限度检查方法，所述的常规法依次包括下述步骤：试验组：吸取1:10供试液9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的试验菌悬液，摇匀，分别从试验菌试管中吸取1ml至平皿中，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基；另从真菌试管中分别吸取1ml至平皿中，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基；每株试验菌平行制备2个平皿；菌液对照组：吸取胰酪大豆胨液体培养基9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的试验菌悬液，摇匀，分别从试验菌试管中吸取1ml至平皿中，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基；另从真菌试管中分别吸取1ml至平皿中，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基；每株试验菌平行制备2个平皿；供试品组：吸取1:10供试液1ml至平皿，平行制备4个平皿，其中2个倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，另外2个倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基；稀释剂组：吸取胰酪大豆胨液体培养基1ml至平皿，平行制备4个平皿，其中2个倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，另外2个倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基；各平皿倾注规定的琼脂培养基，待凝固后，分别置培养3－5d，测定需氧菌总数、霉菌和酵母菌数，计算其回收率。进一步的，上述的一种通经活络胶囊中微生物限度检查方法，所述的稀释法依次包括下述步骤：供试液制备取本品10g，加入预热至45℃的胰酪大豆胨液体培养基至100ml，45℃气浴振摇20min，混匀，作为1:10供试液；吸取1:10供试液20ml加入80ml胰酪大豆胨液体培养基中，摇匀制成1:50供试液；试验组：吸取1:50供试液9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的试验菌悬液，摇匀，分别从试验菌试管中吸取1ml至平皿中，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿；菌液对照组：吸取胰酪大豆胨液体培养基9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的试验菌悬液，摇匀，分别从试验菌试管中吸取1ml至平皿中，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基；每株试验菌平行制备2个平皿；供试品组：吸取1:50供试液1ml至平皿，平行制备2个平皿，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基；各平皿倾注规定的琼脂培养基，待凝固后，分别置培养3d，测定需氧菌总数，计算其回收率。控制菌检验方法的建立及验证依次包括下述步骤：1)菌种取经33℃培养24h的大肠埃希菌胰酪大豆胨液体培养液，用0.9％无菌氯化钠溶液制成含菌数为10～100cfu/ml的菌悬液，备用；2)供试液制备取本品10g，加入预热至45℃的胰酪大豆胨液体培养基至100ml，45℃气浴振摇20min，混匀，作为1:10供试液3)试验方法：取供试品组样品做控制菌检查法检查；阳性对照试验取供试品组，并加入相应的阳性菌菌液1ml进行培养，作相应控制菌检查法检查；取稀释液10ml代替做控制菌检查法检查，作为阴性对照。进一步的，上述的一种通经活络胶囊中微生物限度检查方法，所述的大肠埃希菌检测方法依次包括下述步骤：取1：10供试液10ml接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，33℃培养24h；取培养物1.0ml，接种至100ml麦康凯液体培养基中，44℃培养24h，取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板，33℃培养24h，观察其菌落形态。本发明与现有技术相比，具有以下优势：本发明提供的方法，采用稀释法(1:50)进行需氧菌总数的测定、采用常规法进行霉菌和酵母菌总数的测定，采用常规法进行控制菌的检查。经对所采用的方法进行适用性试验，符合2015年版《中国药典》四部1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法、1107非无菌药品微生物限度标准的有关规定，方法可行。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明的权利要求书做进一步说明，但不构成对本发明的任何限制，任何对本发明做有限次修改可得的技术方案仍然属于本发明所要保护的范围。实施例11、实验用品1.l仪器设备生物安全柜、生化培养箱、全自动压力灭菌器、电热恒温干燥箱、电冰箱、微波炉、恒温水浴箱、电子天平(感量0.1g)、ThermoScientificMaxiMixII涡旋振荡器、气浴恒温振荡器。1.2玻璃器皿锥形瓶、平皿、烧杯、分度吸管、试管及硅胶塞，均于180℃干热灭菌2h或高压蒸汽121℃灭菌15min。1.3用具无菌衣、帽、口罩、手套、皮乳头、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、灭菌不锈钢药匙、试管架、打火机、记号笔、实验记录纸等。1.4试液及培养基l.4.1消毒液0.1％苯扎溴铵溶液(供洗手、擦拭操作台面用)，5％苯酚溶液(配好后装入玻璃消毒缸内供消毒带菌吸管用)、75％乙醇溶液、碘伏溶液。1.4.2稀释剂0.9％无菌氯化钠溶液(稀释菌液用)、含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液、胰酪大豆胨液体培养基(稀释供试品用)。1.4.3培养基胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基、。1.5样品孕坤通胶囊，批号：20161212、20161213、20161214，生产厂家：南宁协和医院2、需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验的建立及验证2.1菌种铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]枯草芽孢杆菌(BacillusSulticis)[CMCC(B)63501]白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]黑曲霉(Aspeigillusniger)[CMCC(F)98003]中国食品药品检定研究院提供2.2菌液制备取经33℃培养24h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌胰酪大豆胨液体培养液及25℃培养24h的白色念珠菌沙氏葡萄糖液体培养液，用0.9％无菌氯化钠溶液制成含菌数为1000～10000cfu/ml的菌悬液，备用；取经25℃培养7天的黑曲霉沙氏葡萄糖琼脂斜面，加入5ml含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，用带有棉花的球形吸管吸出孢子悬液，用含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液制成含孢子数为1000～10000cfu/ml的孢子悬液，备用。2.3供试液制备取本品10g，加入预热至45℃的胰酪大豆胨液体培养基至100ml，45℃气浴振摇20min，混匀，作为1:10供试液。2.4方法建立及回收率试验2.4.1常规法：试验组：吸取1:10供试液9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的试验菌悬液，摇匀，分别从试验菌试管中吸取1ml至平皿中，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基；另从真菌试管中分别吸取1ml至平皿中，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基；每株试验菌平行制备2个平皿；菌液对照组：吸取胰酪大豆胨液体培养基9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的试验菌悬液，摇匀，分别从试验菌试管中吸取1ml至平皿中，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基；另从真菌试管中分别吸取1ml至平皿中，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基；每株试验菌平行制备2个平皿；供试品组：吸取1:10供试液1ml至平皿，平行制备4个平皿，其中2个倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，另外2个倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基；稀释剂组：吸取胰酪大豆胨液体培养基1ml至平皿，平行制备4个平皿，其中2个倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，另外2个倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基。各平皿倾注规定的琼脂培养基，待凝固后，分别置规定温度培养3－5d，测定需氧菌总数、霉菌和酵母菌数，计算其回收率，见表1。表1回收率试验结果：常规法结果显示，需氧菌总数的金黄色葡萄球菌试验菌回收率小于0.5，表明孕坤通胶囊对细菌有抑制作用，采用常规法进行需氧菌总数测定不可行。霉菌和酵母菌总数的各株试验菌回收率均在0.5-2，表明孕坤通胶囊对真菌无抑制作用，采用常规法进行霉菌和酵母菌总数测定可行。2.4.2需氧菌计数------稀释法(1:20)：供试液制备取本品10g，加入预热至45℃的胰酪大豆胨液体培养基至100ml，45℃气浴振摇20min，混匀，作为1:10供试液。吸取1:10供试液40ml加入40ml胰酪大豆胨液体培养基中，摇匀制成1:20供试液；稀释法(1:20)：试验组：吸取1:20供试液9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的试验菌悬液，摇匀，分别从试验菌试管中吸取1ml至平皿中，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿；菌液对照组：吸取胰酪大豆胨液体培养基9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的试验菌悬液，摇匀，分别从试验菌试管中吸取1ml至平皿中，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基；每株试验菌平行制备2个平皿；供试品组：吸取1:20供试液1ml至平皿，平行制备2个平皿，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基；各平皿倾注规定的琼脂培养基，待凝固后，分别置规定温度培养3d，测定需氧菌总数，计算其回收率，结果见表2和表3。表2回收率试验结果：稀释法(1:20)结果显示，需氧菌总数的金黄色葡萄球菌试验菌回收率小于0.5，表明孕坤通胶囊对细菌有抑制作用，采用稀释法(1:20)进行需氧菌总数测定不可行。2.4.3需氧菌计数------稀释法(1:50)：供试液制备取本品10g，加入预热至45℃的胰酪大豆胨液体培养基至100ml，45℃气浴振摇20min，混匀，作为1:10供试液。吸取1:10供试液20ml加入80ml胰酪大豆胨液体培养基中，摇匀制成1:50供试液；稀释法(1:50)：试验组：吸取1:50供试液9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的试验菌悬液，摇匀，分别从试验菌试管中吸取1ml至平皿中，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿；菌液对照组：吸取胰酪大豆胨液体培养基9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的试验菌悬液，摇匀，分别从试验菌试管中吸取1ml至平皿中，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基；每株试验菌平行制备2个平皿；供试品组：吸取1:50供试液1ml至平皿，平行制备2个平皿，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基；各平皿倾注规定的琼脂培养基，待凝固后，分别置规定温度培养3d，测定需氧菌总数，计算其回收率。表3回收率试验结果：稀释法(1:50)结果显示，需氧菌总数的各株试验菌回收率均在0.5-2，表明稀释法(1:50)可以消除孕坤通胶囊对细菌的抑制作用，采用稀释法(1:50)进行需氧菌总数测定可行。2.5方法验证取1批供试品，批号为：20161213，按稀释法(1:50)进行需氧菌总数、常规法进行霉菌和酵母菌总数的计数方法验证，结果见表4至表8：表4第一次试验结果表5第二次试验结果表6第三次试验3次验证试验总结：表7孕坤通胶囊----需氧菌总数计数方法适用性试验回收率表8孕坤通胶囊----霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验回收率3次验证试验结果表明，以稀释法(1:50)进行孕坤通胶囊需氧菌总数、以常规法进行霉菌和酵母菌总数测定，五株试验菌的回收率均在0.5-2，符合《中国药典》2015年版四部1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法的规定，方法可行。确定采用稀释法(1:50)进行孕坤通胶囊的非无菌产品微生物限度检查中需氧菌总数检查，采用常规法进行孕坤通胶囊的非无菌产品微生物限度检查中霉菌和酵母菌总数检查。3、控制菌检验方法的建立及验证3.1菌种大肠埃希菌(EscherichiaColi)[CMCC(B)44102]中国食品药品检定研究院提供3.1.1菌悬液制备同2.2取经33℃培养24h的大肠埃希菌胰酪大豆胨液体培养液，用0.9％无菌氯化钠溶液制成含菌数为10～100cfu/ml的菌悬液，备用；3.2供试液的制备同2.33.3试验方法：供试品组取规定量的样品照“3.3.1”操作做控制菌检查法检查。阳性对照试验取规定量的样品照“3.3.1”操作，并加入相应的阳性菌菌液1ml进行培养，作相应控制菌检查法检查。阴性对照试验取稀释液10ml代替供试液照“3.3.1”做控制菌检查法检查，作为阴性对照。3.3.1大肠埃希菌：取1：10供试液10ml接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，33℃培养24h。取培养物1.0ml，接种至100ml麦康凯液体培养基中，44℃培养24h，取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板，33℃培养24h，观察其菌落形态。3.4试验结果3.4.1大肠埃希菌：供试品组：在麦康凯琼脂平板中无菌落生长；阳性对照组：在麦康凯琼脂平板中有典型大肠埃希菌菌落生长；革兰氏染色镜检为G-杆菌，生化鉴定结果为典型大肠埃希氏菌生化反应，结果见表9。表9大肠埃希菌检测结果阴性对照组：在麦康凯琼脂平板中无菌落生长；表明孕坤通胶囊可采用常规法进行大肠埃希菌检验，方法可行。3.5确定孕坤通胶囊的非无菌产品微生物限度检查中控制菌检查方法为常规法。4结论经过验证：确定采用稀释法(1:50)进行孕坤通胶囊的非无菌产品微生物限度检查中需氧菌总数检查，采用常规法进行孕坤通胶囊的非无菌产品微生物限度检查中霉菌和酵母菌总数检查。采用常规法进行孕坤通胶囊的非无菌产品微生物限度检查中大肠埃希菌检查。5三批孕坤通胶囊的微生物限度检查按所建立的孕坤通胶囊非无菌产品微生物限度检查法，对三批样品进行检验，结果如表10：表10三批孕坤通胶囊的微生物限度检查结果批号需氧菌总数霉菌和酵母菌总数大肠埃希菌结论20161212<50cfu/g<10cfu/g未检出符合规定20161213<50cfu/g<10cfu/g未检出符合规定20161214<50cfu/g<10cfu/g未检出符合规定需要说明的是，本发明未详细涉及的技术参数，均按照本领域常规技术手段或者中国药典规定的参数进行。当前第1页1 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