一种L‑半胱氨酸荧光探针及其制备方法与流程

本发明涉及一种l-半胱氨酸荧光探针制备方法，属于探针的制备技术领域。

背景技术：

l-半胱氨酸是一种具有生理功能，在自然界中广泛存在的重要物质，它在动植物体内是各组织细胞用来防御有害物质和增加活力的一种氨基酸，也是组成蛋白质的20多种氨基酸之一，并且是唯一具有活性巯基（-sh）的氨基酸。l-半胱氨酸是乙酰辅酶、牛磺酸和还原谷胱甘肽的前体，同时还能与铁离子形成硫铁化合物。目前，研究表明，人体中半胱氨酸浓度的升高是引起心血管疾病及中风的重要因素，还会导致认知功能障碍，严重的会导致阿尔茨海默氏病。因此，发明一种能方便检测生理环境中l-半胱氨酸的方法具有重要的现实意义。

目前常用的l-半胱氨酸的方法主要有以下几种，如：电化学检测法、高效液相色谱法，分光光度法、电化学检测法，这些方法只能检测l-半胱氨酸的总量，并且样品需求量大、检测时间长，而且会对样品造成破坏，因此并不适于生物环境的l-半胱氨酸的检测。因此，探索方便廉价、能够定性定量检测l-半胱氨酸，并且可以对生物样品进行实时检测的方法非常重要。当有机荧光探针与特定目标物发生变化后，其荧光信号会发生变化，以达到检测的目的。荧光分析法具有出限低、灵敏度高、选择性好、取样量少、方法简洁快速等特征，并且可以对细胞内目标分子进行非侵入性成像检测可以实时在线，形象具体地观察到信号变化。所以，发明能快速检测、易观查信号变化的l-半胱氨酸荧光探针是非常有必要的。

技术实现要素：

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种能快速检测l-半胱氨酸的比值型荧光探针，简称探针4；本发明进一步提供了探针4的制备方法。

本发明的技术方案如下：

一种l-半胱氨酸荧光探针，其结构式如下：

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本发明的l-半胱氨酸荧光探针，能抗丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、溴离子、醋酸根、铜离子、谷氨酸、还原谷胱甘肽、硫化氢、高半胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸、钠离子、硝酸根、苯丙氨酸、磷酸根、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、单线态氧、过氧化叔丁醇、过氧化叔丁基、抗坏血酸的干扰，特异性好。

上述的l-半胱氨酸荧光探针的合成路线如下：

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化合物4即为l-半胱氨酸荧光探针。

上述的l-半胱氨酸荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

1）将二乙胺基香豆素置于圆底烧瓶中，随后加入1-boc哌嗪，1-羟基苯并三唑（hobt），1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（edci），用二氯甲烷溶解，在常温下搅拌4小时，然后除去反应液中的二氯甲烷得到化合物2。

2）将化合物1用体积比为1:1的二氯甲烷与三氟乙酸的混合溶液溶解，常温下搅拌0.5小时，然后除去反应液中的二氯甲烷和三氟乙酸得到化合物3。

3）将化合物2和nbd-磺酰氯置于圆底烧瓶中，用二氯甲烷溶解，随后滴加一滴三乙胺，在常温下搅拌1小时，然后除去反应液中的二氯甲烷，得到探针4。

上述制备方法，优选的，采用旋转蒸发仪减压蒸馏除去反应液中的二氯甲烷；步骤2在使用化合物1之前，可以用硅胶层析柱进一步纯化；用旋转蒸发仪减压蒸馏除去反应液中的二氯甲烷和三氟乙酸；所得化合物2，可以用硅胶层析柱进一步纯化；三乙胺的加入方式为滴加；采用旋转蒸发仪减压蒸馏除去反应液中的二氯甲烷；所得探针4，可以用硅胶层析柱进一步纯化。

本发明的上述l-半胱氨酸荧光探针用于检测l-半胱氨酸。包括用于检测水环境中的l-半胱氨酸和生物样品的l-半胱氨酸。

上述应用，具体的，包括：

观察加入l-半胱氨酸荧光探针前后待测水环境的荧光光谱的变化；荧光激发波长为450nm；或者，在365nm光源照射下，用肉眼观察加入l-半胱氨酸荧光探针前后待测水环境的荧光变化；或者，观察加入l-半胱氨酸荧光探针前后待测生物环境的荧光成像图的变化。

所述生物环境，可以是活细胞。

所述荧光光谱的变化是指：荧光光谱中，580nm处和481nm处的荧光峰值的变化；如果580nm处峰值升高，481nm处峰值降低，则说明含有l-半胱氨酸。优选的，采用荧光光谱仪观察荧光光谱。

所述荧光变化是指：在365nm光源照射下，荧光明显增强。

所述荧光成像图的变化是指：将探针母液加入到生物样品中，用共聚焦显微镜，使用激发波长为405nm的光源激发，收集蓝色和绿色通道的荧光；观察到蓝色通道荧光减弱，同时绿色通道荧光增强，则说明含有l-半胱氨酸。优选的，采用共聚焦显微镜。

上述应用，具体的，包括以下步骤：

（1）将探针4溶于dmf，制成探针母液；

（2）将探针母液加入到待测液中；

用荧光光谱仪测试待测液的荧光光谱，在580nm处和481nm处的荧光峰值的变化，如果580nm处峰值变大，481nm处峰值降低，则说明含有l-半胱氨酸；其中，荧光光谱仪激发波长为450nm；或者，在365nm光源照射下，待测液的荧光由蓝色变为绿色，则说明含有l-半胱氨酸；

（3）将探针母液加入到生物样品中，用共聚焦显微镜，使用激发波长为405nm的光源激发，收集蓝色和绿色通道的荧光；观察到蓝色通道荧光减弱，同时绿色通道荧光增强，则说明含有l-半胱氨酸。

首先，水溶液中的l-半胱氨酸可以引起荧光探针的荧光光谱变化，因此，可以通过观察荧光光谱仪中光谱的变化程度判断溶液中的l-半胱氨酸含量，从而定量检测；其检测下限为1.4×10^-6mol/l。其次，通过共聚焦显微镜对孵育了荧光探针4和l-半胱氨酸的活细胞进行荧光成像，观察蓝色和绿色通道荧光信号的变化以达到比值检测生物环境中的l-半胱氨酸的目的。

本发明的优点：（1）探针合成简单，并且产率较高；（2）本发明实现了水溶液中l-半胱氨酸的特异性和快速检测；（3）本发明实现了活细胞水平中l-半胱氨酸的检测。

附图说明

图1是实施例1中探针4的¹hnmr图谱；

图2是实施例1中探针4的¹³cnmr图谱；

图3是实施例2中探针4随不同量l-半胱氨酸的加入荧光谱图的变化情况；图中，从下至上，l-半胱氨酸浓度依次为0、10、20、30、50、70、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800和1000μmol/l的荧光光谱；

图4是肉眼观察到探针4（10μmol/l）在pbs缓冲溶液（浓度25mmol/l，ph7.4，含20%dmf）与100当量l-半胱氨酸在便携式紫外灯365nm光源照射条件下的变化。

图5是实施例3中探针4与l-半胱氨酸随时间变化的481nm和580nm处荧光强度值变化图；

图6是实施例4中探针4对不同干扰分析物的选择性柱状荧光数据图；图中，1，空白2，丙氨酸3，精氨酸,4，天冬氨酸5，溴离子6，醋酸根7，铜离子8，谷氨酸9，还原谷胱甘肽10，硫化氢11，高半胱氨酸12，组氨酸13，异亮氨酸14，钠离子15，硝酸根16，苯丙氨酸17，磷酸根18，丝氨酸19，苏氨酸20，缬氨酸21，单线态氧22，过氧化叔丁醇23，过氧化叔丁基24，抗坏血酸。

图7是实施例5中探针4与hela细胞中l-半胱氨酸响应的荧光成像图；图中，(a)是加入探针4孵育45分钟后的成像，(b-d)是先分别加入50、100和250μmol/l孵育30分钟，随后加入探针4继续培育45分钟后的成像。第一列为明场成像和蓝色与绿色通道荧光成像的重叠图；第二列为蓝色通道成像；第三列为绿色通道成像；第四列绿色通道成像与蓝色通道成像的比率图；激发波长为405nm；标尺为20微米。

具体实施方式

实施例1化合物2的合成：

取二乙胺基香豆素酸370mg(1.4mmol)置于圆底烧瓶，加入408mg（2.1mmol）1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐(edci)，479mg（3.5mmol）1-羟基苯并三唑（hobt），264mg（1.4mmol）t-boc哌嗪，用二氯甲烷溶解，在常温下搅拌4小时，反应完毕。反应完毕后，通过旋转蒸发仪减压蒸馏将溶剂（二氯甲烷）除去得到粗产品。以体积比为1:3的乙酸乙酯与石油醚为洗脱剂，用硅胶（200-300目）层析柱进行纯化，得到487mg淡黄色色固体（产率为81.1%）。

化合物3的合成：

称取86mg（0.2mmol）化合物2,用体积比为1:1的二氯甲烷和三氟乙酸溶解，在常温下搅拌0.5小时，反应完毕。反应完毕后，通过旋转蒸发仪减压蒸馏将溶剂（二氯甲烷与三氟乙酸）除去得到化合物3，无需纯化。

探针4的合成

取33mg(0.1mmol)化合物3置于圆底烧瓶中，加入25mg（0.1mmol）nbd-磺酰氯，用二氯甲烷溶解，滴加一滴三乙胺，在常温下搅拌1小时，反应完毕。反应完毕后，通过旋转蒸发仪减压蒸馏将溶剂（二氯甲烷）除去得到探针4。最后以体积比为70:1的二氯甲烷与甲醇为洗脱剂，用硅胶（200-300目）层析柱进行纯化，得到40mg黄色固体（产率73.2%）。图1是其¹hnmr图谱；图2是其¹³cnmr图谱；¹hnmr(400mhz,cdcl3),(ppm):1.21-1.24(t,j=6.8hz,6h),3.41-3.49(m,10h),3.84(2h),6.47(s,1),6.61-6.63(d,j=7.2hz,1h),7.28-7.31(d,j=8.8hz,1h),7.56-7.58(d,j=7.2hz,1h),7.86(s,1h),7.95-7.97(d,j=7.2hz,1h);¹³cnmr(100mhz,cdcl3):δ(ppm):42.16,45.11,45.84,46.15,47.30,96.99,107.82,109.68,115.02,125.88,128.33,129.14,130.08,134.54,145.53,146.17,148.87,151.89,157.37,159.24,165.22。

实施例2

探针4与不同当量l-半胱氨酸反应的荧光光谱变化

取实施例1制备的探针4溶于dmf中，制成浓度为1mmol/l探针母液（探针4的浓度为1mmol/l）；将l-半胱氨酸用蒸馏水配制成100mm、50mm、10mm、1mm的溶液。从探针母液中取出30μl加入到5ml的离心管当中，加入不同当量（0-60eq）的l-半胱氨酸母液（所述当量是指l-半胱氨酸母液中l-半胱氨酸的摩尔数相对于探针母液中探针的摩尔数的倍数），用0.570mldmf和不同体积的pbs水溶液（浓度25mmol/l，ph7.4）稀释至3ml，配置成探针浓度为10μmol/l，含20%dmf的测试溶液。用荧光光谱仪测试探针与不同当量l-半胱氨酸反应液的荧光光谱变化（激发波长为450nm），荧光光谱变化情况如图3所示。由图3可见，随着加入当量的l-半胱氨酸逐渐增加，探针4溶液在580nm处的荧光峰值逐渐增强，481nm处的荧光峰值逐渐降低。如图4所示，在便携式紫外灯照射下（356nm光源）荧光由蓝色变为黄色。

实施例3

探针4与l-半胱氨酸随时间变化的荧光变化

从实施例2中荧光探针母液中取出30μl加入到5ml的离心管当中，加入30μl浓度为1mmol/l的l-半胱氨酸母液，再0.570mldmf和2.400ml的pbs水溶液（浓度25mmol/l，ph7.4）稀释至3ml，配制成探针浓度为10μmol/l，l-半胱氨酸浓度为0.6mmol/l，含20%dmf的测试溶液。用450nm的激发波长，测试其随时间变化的荧光光谱。由图5可见，随着时间增加，580nm处荧光强度增加，481nm处荧光强度减弱。

实施例4

探针4对不同干扰分析物的选择性研究

从实施例2中荧光探针母液中取出30μl加入到5ml的离心管当中，分别加入浓度为100mm的分析物：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、溴离子、醋酸根、铜离子、谷氨酸、还原谷胱甘肽、硫化氢、高半胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸、钠离子、硝酸根、苯丙氨酸、磷酸根、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、单线态氧、过氧化叔丁醇、过氧化叔丁基、抗坏血酸,用0.570mldmf和2.400ml的pbs水溶液（浓度25mmol/l，ph7.4）稀释至3ml，配置成探针浓度为10μmol/l，含20%dmf的测试溶液。反应5分钟后检测测试液的荧光光谱变化。由图6可以发现，相对于空白测试液，各种分析物的测试液荧光强度均没有明显变化。然而，加入l-半胱氨酸的测试液的荧光强度发生了显著增强。实验结果说明探针4对l-半胱氨酸具有良好的选择性。

实施例5

探针4与细胞中l-半胱氨酸的荧光成像研究

从实施例2中荧光探针母液中取出5μl加入到育有hela细胞的培养皿（含1mlpbs培养基）中，探针浓度为5μmol/l，孵育20分钟，作为控制组；在其中一组控制组样品中分别加入50，100，250μmol/l的l-半胱氨酸，继续孵育60分钟，作为实验组。随后分别用共聚焦显微镜对控制组和实验组进行荧光成像，使用激发波长为405nm的光源激发，分别收集蓝色和绿色通道的荧光，结果如图7所示。在控制组的荧光成像中，只能观察到蓝色通道荧光和非常微弱的绿色荧光；然而，在实验组中，随着加入l-半胱氨酸浓度的增加，可以观察到明显的蓝色通道荧光逐渐减弱，同时绿色通道荧光显著增强。实验结果说明探针4可以通过共聚焦显微镜检测细胞环境中的l-半胱氨酸，具有潜在的实际应用价值。