一种检测家蚕二分浓核病毒的LAMP引物及其试剂盒的制作方法

本发明涉及一种检测家蚕二分浓核病毒的LAMP引物及其试剂盒，具体涉及一组环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技术检测家蚕BmBDV病毒引物及其试剂盒，属于病毒疫病诊断技术领域。

背景技术：

家蚕二分浓核病毒（Bombyx mori Bidensovirus，BmBDV）属于细小病毒科浓核病毒亚科。BmBDV主要感染家蚕，病毒感染的家蚕幼虫的症状包括厌食、腹泻及软化，体型消瘦，出现迟眠、胸部半透明的空头等现象最终停止进食。该病毒具有高致死率，感染持续时间较长，引起慢性蚕病，是我国夏秋季节蚕茧等经济产品减产的重要原因之一。

研究表明，BmBDV为无囊膜的球状病毒粒子，直径约20-24nm，包含2个线性单链DNA分子，大小分别约6.5kb（VD1）和6kb（VD2），其序列已测定并在GeneBank上登录（登录号DQ017268和DQ017269）。目前该病毒的检测方法有电镜法、PCR检测法等，但在实际检测工作中，现有的检测技术存在以下问题：一是灵敏度不够，无法检测到潜伏感毒样品；二是容易产生假阳性，对模板质量要求高；三是操作繁琐，对实验条件要求高，不利于养殖户和一线生产技术人员来操作。

LAMP是一种新型的核酸等温扩增检测技术，即依据环介导等温核酸扩增技术的原理，针对靶基因的特定区域设计4条特异性引物，反应时先由外部引物将内部引物扩增所需要的模板扩增出来，然后由内部引物对靶基因片段进行引导合成。由于内部引物所扩增出的片段含有与该引物5’端DNA片段的反相互补序列，因此这些反相互补序列之间形成茎-环结构，同时，另外一条内部引物与也可形成茎-环结构，片段的两端形成哑铃状结构，如此循环往复的过程最后形成花椰菜形状的茎-环结构，可在15min-60min之内实现10⁹-10¹⁰倍的扩增。该技术简化了操作步骤，在等温条件下就可以高效、高特异地扩增靶序列。LAMP产物的检测一般采用琼脂糖凝胶电泳、浊度观察、染料显色法和荧光染料观察等方法。

琼脂糖凝胶电泳和荧光染料观察需要专门的设备，浊度观察在含量较低时也较难观察，核酸染料直接显色法比较适合现场快速检测需求。目前常用的核酸染料有钙黄绿素（Calcein）、SYBR Green、羟基萘酚蓝（HNB）、Eva Green等。利用核酸染颜色的变化来判定检测结果，这种方法具有安全、快捷、高效的特点，适合应用推广。目前，该方法在家蚕BmBDV的检测中未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一组检测BmBDV病毒的LAMP的引物，并提供一种用于检测家蚕的BmBDV病毒的LAMP检测试剂盒。该试剂盒特异性强，敏感率高，而且操作简便快捷，克服现有检测方法不能在生产中直接应用的问题，适合家蚕BmBDV的筛查。

本发明所述的引物是根据GenBank公布的BmBDV VP序列（Accession number: YP_007714630.1）设计修改后获得，利用不同引物的反应结果进行筛选，由其中选出三对引物：

引物BmBDV-F3（SEQ ID NO:1）：TCTGACGTTGGTGGAAGT

引物BmBDV-B3（SEQ ID NO:2）：AACTTGCTTTCCACTCGA

引物BmBDV-FIP（SEQ ID NO:3）：

TGAGGCGTCCATAGGACCTTTTTTGGAAGTGGAAAACGCAGT

引物BmBDV-BIP（SEQ ID NO:4）：

GAGGATCTGGAGGTGGTGGTTTTTTTGGCTTGTAAATAGGTTGG

引物BmBDV-LF（SEQ ID NO:5）：ACCGCCCCCAGACACATT 引物BmBDV-LB（SEQ ID NO:6）：GGAGGTGCTTCAGCAGAGG

本发明还提供一种家蚕BmBDV病毒LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包含家蚕BmBDV

病毒 LAMP预反应液，所述预反应液包含上述三对检测家蚕BmBDV的LAMP特异性引物。

具体的，所述预反应液包括：1.5～2.0mM BmBDV-FIP和BmBDV-BIP，0.2～0.4mM BmBDV-F3和BmBDV-B3，0.2～0.5mM BmBDV-LF和BmBDV-LB，20～40mM Tris-HCl (pH8.0～9.0)， 10～15mM 氯化钾，15～20mM 硫酸铵，8～10mM 硫酸镁， 0.1～0.2% Triton X-100，1.2～1.4mM dNTP， 6-8U Bst DNA 聚合酶大片段（New England Biolabs），0.6～0.8M 甜菜碱；在反应管盖中用低熔点固体石蜡封入1μL SYBR Green I。

本发明还提供一种家蚕BmBDV病毒LAMP检测方法，包括以下检测步骤：

S1. 家蚕样品中BmBDV基因的提取：

（1）取20～30mg家蚕整蚕或蚕沙，或20µL家蚕血淋巴，加入500μL裂解液RA后用研磨棒研磨匀浆，然后加入20µL蛋白酶K以及20µL RNase A（20mg/mL）混匀，56℃水浴30min，至组织完全裂解；

（2）将混合物转入带有硅胶膜的吸附柱中，12000rpm离心1min，弃掉废液；

（3）加入600μL去蛋白液RC，室温静置1min，12000rpm离心30～60s，弃掉废液；

（4）加入600μL漂洗液RD，12000rpm离心30s,弃掉废液；重复该步骤一次。

（5）在吸附柱中加入50μL TE,室温放置1min，12000rpm离心1min。可重复该步骤一次，增加DNA洗脱量。

S2. 家蚕BmBDV病毒LAMP扩增：

（1）根据待检样品数，配制所需的预反应液（含阳性对照、阴性对照），在预反应液中加入2～5μL DNA模板，再加入适量的去离子水，使反应体系总体积为25μL。

（2）标记清楚后，将检测反应管置于61～65℃，反应45-60min，85℃灭活并溶解低熔点固体石蜡使得染料溶于反应液；其中最适反应温度为62℃，最适反应时间为30min。

（3） 肉眼观察反应体系的颜色变化，同时产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳分析。

与现有检测技术比较，本发明所提供的家蚕BmBDV病毒LAMP检测方法具有以下优点：

（1）本发明所采用引物组是根据BmBDV结构蛋白(VP)基因的六个不同区域设计的，又有环形引物(BmBDV-LF和BmBDV-LB),反应速度（常规PCR通常需要2个小时左右，而用这个方法只需要30分钟），反应速度高于常规PCR；

（2）本发明的快速诊断试剂盒检测灵敏度高，是常规PCR的1000倍；（见图4，图5）

（3）本发明的快速诊断试剂盒检测时间短，可以在30min内获得检测结果，比常规PCR节约3～4小时；

（4）本发明的快速诊断试剂盒对仪器设备要求低，可通过肉眼直接观察；

（5）本发明中的DNA提取方法简单快捷，而且不用到氯仿、巯基乙醇等有害物质；

（6）本发明的检测试剂盒操作步骤简单，结果直观易判定，处于生产一线的技术员和蚕农都可以按步骤指导进行操作；

（7）本发明的检测试剂盒对人和环境安全。

附图说明

图1为扩增温度对LAMP反应的影响结果；M：DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；泳道1： 60℃恒温条件下扩增结果； 泳道2：61℃恒温条件下扩增结果；泳道3: 62℃恒温条件下扩增结果；泳道4：63℃恒温条件下扩增结果；泳道5：64℃恒温条件下扩增结果；泳道6：65℃恒温条件下扩增结果。

图2为扩增时间对LAMP反应的影响结果；M：DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；泳道1： 62℃恒温条件下扩增30min结果； 泳道2：62℃恒温条件下扩增45min结果；泳道3: 62℃恒温条件下扩增60min结果。

图3为BmBDV LAMP特异性实验结果图和染料显色对比结果；图中A为凝胶电泳结果，B为染色结果；图A中，M：DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；泳道1：家蚕二分浓核病毒（BmBDV）；泳道2：家蚕浓核病毒（BmDNV）；泳道3：家蚕核型多角体病毒（BmNPV）；泳道4：家蚕质型多角体病毒（BmCPV）；泳道5：家蚕微孢子虫（N. b.）；泳道6：阴性对照。

图4为BmBDV LAMP方法检测BmBDV的灵敏度比较图和染料显色对比结果；图中A为凝胶电泳结果，B为染色结果；图A中，M：DL2000 DNA Marker (TaKaRa公司)；左侧泳道1～9：模板分别为10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，10^-9倍稀释的基因组DNA；泳道10：无模板。

图5为常规PCR方法检测BmBDV的灵敏度结果；M：DL2000 DNA Marker (TaKaRa公司)；泳道1～9：模板分别为10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，10^-9倍稀释的基因组DNA；泳道10：无模板。

具体实施方式

以下结合附图实例对本发明作进一步详细描述。

实施例1：

所需材料：

感染家蚕BmBDV病毒的样本采集自江苏大学生命科学研究院；所用引物与探针由上海生工生物公司合成；Bst DNA 聚合酶大片段购自New England Biolabs公司；dNTP、购自promega公司；甜菜碱、硫酸镁等购自sigma公司；核酸染料SYBR Green I。

家蚕二分浓核病毒（BmBDV）、家蚕浓核病毒（BmDNV）、家蚕核型多角体病毒（BmNPV）、家蚕质型多角体病毒（BmCPV）和家蚕微孢子虫（N. b.）来源于江苏大学生命科学研究院。

S1. 家蚕BmBDV样品DNA的提取：

(1)取20～30mg家蚕整蚕或蚕沙，或20µL家蚕血淋巴，加入500μL裂解液RA后用研磨棒研磨匀浆，然后加入20µL蛋白酶K以及20µL RNase A（20mg/mL）混匀，56℃水浴30min，至组织完全裂解；

(2)将混合物转入带有硅胶膜的吸附柱中，12000rpm离心1min，弃掉废液；

(3)加入600μL去蛋白液RC，室温静置1min，12000rpm离心30～60s,弃掉废液；

(4)加入600μL漂洗液RD，12000rpm离心30s,弃掉废液；重复该步骤一次。

(5)在吸附柱中加入50μL TE,室温放置1min，12000rpm离心1min。可重复该步骤一次，增加DNA洗脱量。

S2. 家蚕BmBDV病毒LAMP恒温扩增：

（1）根据待检样品数，配制相应数量的预反应液（1.6mM BmBDV-FIP和BmBDV-BIP,0.2mM BmBDV-F3和BmBDV-B3,0.05μM，0.2mM BmBDV-LF和BmBDV-LB， BmBDV-FITC-PROBE,20mM Tris-HCl, 10mM 氯化钾, 15 mM 硫酸铵, 8mM 硫酸镁, 0.1% Triton X-100,0.6M 甜菜碱，1.4mM dNTP，8U Bst DNA 聚合酶大片段，核酸染料SYBR Green I，每管检测预反应液体积为20μL；

（2）分别吸取5μL不同浓度的待检样品DNA和不同病毒的DNA加入核酸检测反应管中，混合均匀；

（3）标记清楚后，将检测反应管置于62℃水浴锅中，反应30min；

（4）将反应检测管置于85℃中3分钟，振荡反应管使染料溶于反应液。

S3. 肉眼观察结果，阳性样品LAMP扩增产物由黄色变成浅绿色，见图3B与图4B图。S4. 家蚕BmBDV病毒LAMP扩增产物进行凝胶电泳：

（1）配置2%的琼脂糖凝胶，每个加样孔加入5μL的反应产物；

（2）电泳30分钟后凝胶成像，结果见图3A和图4A图。

如图1和图2所示，对LAMP恒温扩增反应中反应温度和实际对扩增结果的影响进行了实验，实验结果表明，本发明中的方法最适的反应温度为62℃，最佳反应时间为30min。

图3实验为BmBDV LAMP特异性实验结果图和染料显色对比结果；分别将家蚕二分浓核病毒（BmBDV）、家蚕浓核病毒（BmDNV）、家蚕核型多角体病毒（BmNPV）、家蚕质型多角体病毒（BmCPV）和家蚕微孢子虫（N. b.）作为反应模板，结果显示，该方法具有非常好的特异性，对家蚕二分浓核病毒的检测精准。

图4为BmBDV LAMP方法检测BmBDV的灵敏度比较图和染料显色对比结果；

利用本发明所述的检测试剂盒和检测方法检测BmBDV病毒，经过凝胶电泳，由图4A可见阶梯状的扩增条带，该方法可检测10^-9倍稀释的基因组DNA，再利用核酸染料SYBR Green I染色后颜色变化肉眼检测检验扩增产物（染料用蜡封在反应管盖中，反应最后用85℃3分钟使蜡融化从而染料混入扩增产物），由图4B可见与电泳结果吻合。

与常规PCR检测方法结果（图5）相比，本方法灵敏度至少是常规方法的1000倍，表明该方法具有很好的灵敏度；此外，常规PCR检测样品至少需要3～4小时，而本方法检测单个样品最快仅需要1小时左右，时效性远高于常规PCR。根据以上实验结果表明，BmBDV病毒LAMP检测试剂盒和检测方法可以快速、简便、灵敏的进行该病毒的现场检测。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏大学

<120> 一种检测家蚕二分浓核病毒的LAMP引物及其试剂盒

<130> 一种检测家蚕二分浓核病毒的LAMP引物及其试剂盒

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

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tctgacgttg gtggaagt 18

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<212> DNA

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<400> 2

aacttgcttt ccactcga 18

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgaggcgtcc ataggacctt ttttggaagt ggaaaacgca gt 42

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaggatctgg aggtggtggt ttttttggct tgtaaatagg ttgg 44

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

accgccccca gacacatt 18

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggaggtgctt cagcagagg 19