鼠抗人CD61单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备方法和应用、流式检测试剂与流程

本发明涉及一种鼠抗人cd61单克隆抗体杂交瘤细胞株，同时还涉及由该杂交瘤细胞株分泌产生的鼠抗人cd61单克隆抗体和fitc标记的单克隆抗体，以及上述单克隆抗体的制备方法和应用，此外还涉及包含上述单克隆抗体的流式检测试剂，属于生物工程技术领域。

背景技术：

cd61别名cd61a、gpiib/iiia或整合素β3链，分子量为110kda，表达于血小板、巨核细胞及巨噬细胞上。cd61属于整合素β亚单位，其配体及相关分子式纤维连接蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白溶酶原、凝血酶原、tsp、玻璃连接蛋白、vwf、腱生蛋白、mmp-2、层黏蛋白及骨桥蛋白。

cd41/cd61是血小板活化时出现的玻璃连接蛋白、纤维原蛋白、纤维蛋白、vwf的受体，与血小板凝集有关、cd51/cd61是玻璃连接蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白、vwf、tsp的受体，与细胞的粘附反应相关。临床上可用于glanzmann血小板无力症、巨核细胞白血病、特发性血小板减少性紫癜的诊断。

公布号cn101200708a的发明专利公开了鼠抗人cd41单克隆抗体杂交瘤细胞株cgmccno.2177，由该杂交瘤细胞株分泌的鼠抗人cd41单克隆抗体能够识别cd41与cd61结合后的构象抗原部位，非还原状态下与gpiib/iiia复合物免疫共沉淀，作为抑制性抗体能够抑制adp、胶原和hip2等引起的聚集作用，但是对ristocetin引起的聚集没有影响，该抗体可用于涉血小板类血液病及血栓类疾病的诊断和治疗。公布号cn101307109a的发明专利公开了鼠抗人t淋巴细胞cd3表面抗原单克隆抗体，由抗t淋巴细胞单克隆抗体杂交瘤细胞株cctccno:c200803分泌，该抗体能够与已知的okt3及wut3单克隆抗体识别抗原的不同表位，对正常骨髓粒-巨噬祖细胞(cfu-gm)体系生长有明显的激活作用，且表现双向调节作用特征。目前，现有技术中还未有鼠抗人cd61单克隆抗体杂交瘤细胞株的公开文献。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种鼠抗人cd61单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该杂交瘤细胞株分泌的鼠抗人cd61单克隆抗体经fitc标记后可用于流式直标免疫荧光检测人外周血血小板cd61抗原的表达。

其次，本发明提供一种由上述杂交瘤细胞株分泌的鼠抗人cd61单克隆抗体及其制备方法。

同时，本发明提供一种fitc标记的鼠抗人cd61单克隆抗体及其制备方法。

再次，本发明提供一种鼠抗人cd61单克隆抗体、fitc标记的单克隆抗体在流式直标免疫荧光检测人外周血血小板cd61抗原表达中的应用。

最后，本发明提供一种包含上述鼠抗人cd61单克隆抗体或者fitc标记的单克隆抗体的流式检测试剂。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

鼠抗人cd61单克隆抗体杂交瘤细胞株，名称为ⅱd5g8，保藏编号：cgmccno.13300，保藏日期：2016年12月05日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

鼠抗人cd61单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株ⅱd5g8(cgmccno.13300)分泌产生。

鼠抗人cd61单克隆抗体的制备方法，包括：将杂交瘤细胞株ⅱd5g8(cgmccno.13300)接种至小鼠腹腔，采集腹水后提纯抗体，即得。

鼠抗人cd61单克隆抗体在流式直标免疫荧光检测人外周血血小板cd61抗原表达中的应用。具体为：采用fitc标记上述鼠抗人cd61单克隆抗体，与人外周血血小板孵育后，采用流式直标免疫荧光检测人外周血血小板cd61抗原的表达。

fitc标记的单克隆抗体，采用fitc标记上述鼠抗人cd61单克隆抗体得到。

fitc标记的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：采用fitc标记上述鼠抗人cd61单克隆抗体，即得。

fitc标记的单克隆抗体在流式直标免疫荧光检测人外周血血小板cd61抗原表达中的应用。具体为：将fitc标记的单克隆抗体与人外周血血小板孵育后，采用流式直标免疫荧光检测人外周血血小板cd61抗原的表达。

流式检测试剂，至少包含上述鼠抗人cd61单克隆抗体或者fitc标记的单克隆抗体。

本发明的有益效果：

本发明应用人外周血白细胞为免疫原，免疫balb/c小鼠，采用经典的细胞融合技术，通过免疫细胞化学对杂交瘤细胞进行阳性筛选，应用免疫沉淀-质谱法对单克隆杂交瘤细胞进行特异性鉴定，经westernblot验证，获得一株能稳定分泌鼠抗人cd61单克隆抗体的杂交瘤细胞株ⅱd5g8，其保藏编号：cgmccno.13300，保藏日期：2016年12月05日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明采用动物体内诱生法制备单抗，鉴定抗体重链为igg1，轻链为kappa型。采用proteina亲和层析法对抗体进行纯化，经fitc标记后可用于流式直标免疫荧光检测人外周血血小板cd61抗原的表达。

保藏证明和存活证明说明

保藏细胞株：杂交瘤细胞株ⅱd5g8，保藏编号：cgmccno.13300，保藏日期：2016年12月05日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1为实施例2中sds-page单抗纯度分析结果；

图2为实施例4中fitc-cd61单克隆抗体检测人外周血血小板cd61抗原表达的结果；

图3为试验例中免疫沉淀sds-page电泳结果；

图4为免疫沉淀westernblot试验结果；

图5为abcam蛋白sds-page电泳结果；

图6为western鉴定iid5g8纯化抗体电泳结果；

图7为fitc-cd61单克隆抗体的特异性分析。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

杂交瘤细胞株ⅱd5g8的制备，包括以下步骤：

一、免疫

1、免疫原的制备

(1)取3ml河南省红十字血液中心取回的新鲜白膜，加7ml1×pbs稀释混匀；

(2)取15ml离心管，加4ml淋巴细胞分离液，将10ml稀释的白膜缓慢平稳加于淋巴细胞分离液液面上；

(3)水平低温离心机500×g、升速1挡、降速0挡、18℃、离心20min；

(4)收集环状乳白色层及以上层至新的离心管中；

(5)补加1×pbs至14ml，500×g、18℃、离心20min，弃上清；

(6)同步骤(5)重复洗涤1次；

(7)加适量1×pbs重悬，0.4％台盼蓝溶液染色，显微镜下计数，调整至所需细胞浓度。

2、动物免疫

上述细胞悬液，以5×10⁵个细胞，200μl，背部皮下分点注射免疫7周龄(6～8周龄均可)的雌性balb/c小鼠，免疫间隔三周，共免疫四次；融合前三天以5×10⁷个细胞(体积200μl)尾静脉注射进行超免，二免、三免、四免后三周断尾取血10μl，溶于490μl的1×pbs中，800×g离心5min，收集上清，-20℃保存以备抗体检测。

二、效价测定

1、流式间接免疫荧光法检测抗体效价

(1)制备细胞悬液：同免疫原的制备；

(2)加抗原：以每管1×10⁶个细胞将上述细胞悬液加至5ml离心管中；

(3)加一抗：倍比稀释的小鼠免疫血清50μl/管，设未免小鼠血清阴性对照管，pbs空白对照管，4℃孵育60min；

(4)洗涤：每管加pbs2ml，500×g离心10min，弃上清，涡旋混匀；

(5)加二抗：bd公司pe标记的羊抗鼠igg，5μl/管，4℃孵育30min；

(6)洗涤：每管加pbs2ml，500×g离心10min，弃上清，加500μlpbs重悬；

(7)300目尼龙网过滤至流式上样管中，上机检测。

2、检测结果

二、三、四免疫后小鼠血清用1×pbs稀释100倍后进行倍比稀释，同时设未免疫血清阴性对照和pbs空白对照，进行流式间接免疫荧光检测，以出现相近阳性百分比的最大稀释倍数为抗体效价，结果显示：二免、三免、四免后小鼠血清抗体效价依次为1:800、1:1600、1:3200。

三、细胞融合

1、小鼠骨髓瘤细胞的培养

于融合前两周将冻存于液氮中的小鼠骨髓瘤细胞系ns/0细胞株复苏，适时换液，融合前2天扩大培养，使细胞在融合前达到融合所需细胞数，并处于对数生长期。生长状态良好的细胞浑圆透亮、大小均一，细胞内颗粒物少，没有空泡。

2、饲养细胞的制备

(1)取昆明鼠一只拉颈处死，浸泡于75％酒精中5分钟；

(2)进入细胞室，将小鼠取出，固定四肢于泡沫板上；

(3)吸管吸取30ml含1×hat(次黄嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin))的1640完全培养基于平皿中；

(4)用20ml注射器从平皿中抽取12ml含1×hat的1640完全培养基(同上)备用；

(5)剪开小鼠腹部皮肤，充分暴露腹部，提起腹膜，用注射器将12ml含1×hat的1640完全培养基注射于小鼠腹腔，轻柔小鼠腹侧壁后回抽10ml，混匀于平皿中，制备成30ml饲养细胞悬液；

(6)将制备好的饲养细胞悬液分装于2块96孔细胞培养板中，100μl/孔；

(7)将96孔板存放于37℃、5％co2培养箱中培养。

3、细胞融合

(1)从4℃冰箱中取出hat培养基和gnk洗液至37℃水浴锅中预热；

(2)擦拭超净台，放入所需实验用品，紫外下灭菌超净台及细胞室；

(3)取出四细胞瓶长势良好的瘤细胞，慢慢竖起来使细胞下沉并吹打瓶壁数次，用吸管转移细胞至50ml离心管中，吸取500μl计数，其余133×g(1000r/min)离心10min；

(4)将免疫小鼠摘眼球处死后于75％乙醇中消毒，血液用1.5mlep管收集，于37℃放置2h，待血清析出后，3000r/min离心5min，吸取上清作为阳性血清；

(5)酒精浸泡后的小鼠固定四肢于泡沫板上，移入超净台，用一套无菌镊剪剪开小鼠表皮，暴露腹膜，酒精消毒，换一套剪开腹膜，取出脾脏放入200目尼龙网上；

(6)用吸管吸取gnk洗液冲洗尼龙网，制备脾细胞悬液，打开尼龙网将烧杯中的脾细胞悬液移至50ml离心甁，gnk冲洗烧杯并收集至离心瓶中，补加gnk至40ml，吸取500μl计数，其余133×g离心10min；

(7)将离心的脾细胞和ns/0细胞弃上清，用gnk液加至含脾细胞的离心瓶中，吹打混匀，脾细胞与瘤细胞混合比例为1:5；

(8)将混合后的细胞133×g离心10min，弃上清；

(9)塑料烧杯中盛半杯37℃温水于超净台上，把瘤/脾混合细胞离心瓶放入37℃水浴中，1ml吸管吸取1mlpeg1500，轻轻转动离心瓶的同时沿离心瓶壁缓慢均匀滴加，1min内加完；

(10)水浴中静置离心瓶1.5min；

(11)加入15mlgnk液，滴加速度为1ml30s，3ml30s，11ml30s；

(12)37℃水浴烧杯中温育离心瓶5min，此时混合细胞位于底部，gnk位于细胞悬液液面上；

(13)向离心瓶中补加gnk液25ml，133×g离心10min；

(14)弃上清，轻弹打散细胞团，取30mlhat1640完全培养基至平皿中，从平皿中抽取10ml培养基重悬混合细胞，回抽细胞悬液至平皿中，混匀；

(15)取制备好的饲养细胞板，显微镜下观察，生长状态尚可；

(16)将混合细胞悬液以每孔100μl加至2板饲养细胞板和1板无饲养细胞的培养板中，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。

4、杂交瘤细胞的选择性培养

细胞融合时使用含1×hat(次黄嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin))的选择性培养基，密切观察细胞生长状态，细胞融合后第4天显微镜下可见部分孔内存在较小的克隆团，背景较杂，进行换液处理；融合后第7天可见较明显的克隆团，背景逐渐清晰，更换为ht培养基；融合后第12天部分孔肉眼可见白色点状克隆团，更换为普通培养基。

四、杂交瘤细胞非特异性筛选和亚克隆

1、杂交瘤细胞的非特异性阳性筛选

采用流式间接免疫荧光法，参照上述效价检测，将稀释血清一抗更换为杂交瘤细胞培养上清，设超免血清(1:1000)阳性对照，培养基阴性对照，pbs空白对照，一抗加样量为100μl/孔，出现荧光染色细胞即为检测结果阳性。

2、杂交瘤细胞的单克隆化(有限稀释法)

(1)制备饲养细胞；

(2)有限稀释法亚克隆杂交瘤细胞；

①反复吹打杂交瘤细胞，混匀后计数，调整细胞数目在20个/ml，制备6.5ml细胞悬液；

②混匀后100μl/孔加至96孔饲养细胞板的a、b、c三排(即每孔2个细胞)；

③取2.9ml细胞悬液补加2.9ml完全培养液，细胞数为10个/ml，100μl/孔加至d、e、f三排(即每孔1个细胞)；

④取余下的2.2ml细胞悬液补加2.2ml完全培养液，细胞数为5个/ml，100μl/孔加至g、h两排(即每孔0.5个细胞)；

⑤置37℃、5％co2培养箱内培养；

⑥培养4天(4～5天均可)后在倒置显微镜上观察，可见小的细胞克隆，第10天时，肉眼可见白色点状细胞克隆团，进行培养上清抗体检测；

⑦选择检测阳性强、状态良好的单克隆细胞转24孔板培养并复测，对阳性孔按上述步骤进行2次、3次亚克隆，直至获得分泌抗体基本稳定的单克隆细胞株iid5g8。

将iid5g8细胞株冻存保种，寄至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmccno.13300，保藏日期：2016年12月05日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

实施例2

鼠抗人cd61单克隆抗体的制备(小鼠腹腔诱生法)，包括以下步骤：

1、腹水制备

(1)选取老龄雌性balb/c小鼠，液体石蜡经过滤灭菌后注入小鼠腹腔，500μl/只，以作备用；

(2)将阳性单克隆细胞株iid5g8转入细胞培养皿中进行扩大培养，7天后腹腔注射杂交瘤细胞，0.8×10⁶个/只，共接种4只小鼠，注射剂量为500μl/只；

(3)一周后观察小鼠腹水产生情况，当小鼠腹部明显突起且皮肤紧绷时，用20ml无菌针头扎破小鼠腹部皮肤，将腹水采集至离心管中；

(4)将腹水3000r/min离心5min，吸出中间透明液体，分装，-80℃保存。

2、akta蛋白层析系统纯化抗体

(1)平衡：缓冲液(1×pbs，ph为7.4)流经蛋白a亲和柱；

(2)上样：取1ml硫酸铵两步法获得的沉淀溶液上样；

(3)再平衡：1×pbs溶液过蛋白a亲和柱；

(4)洗脱：以0.1mol/lph2.7柠檬酸钠缓冲液流经柱子进行洗脱；

(5)收集：以1.0mol/lph9.0tris-hcl中和缓冲液接样收集样品；

(6)透析：提纯样品装入透析袋中，将透析袋置于1×pbs中(ph为7.4)，经透析，纯化后抗体体积约为1.4ml；

(7)浓度的测定：bca法测定iid5g8腹水纯化后浓度为1.7mg/ml；

(8)保存：提纯样品保存在-20℃。

3、采用sds-page验证单抗纯度

采用15％sds-page结合考马斯亮蓝染色分析单抗纯度，结果见图1，图中m为marker，1为iid5g8腹水纯化前，2为iid5g8腹水纯化后。由图1可知，泳道1有较多杂带，泳道2主要有抗体的重链和轻链两条条带，说明抗体经纯化后纯度明显提高。

实施例3

fitc标记的cd61单克隆抗体，其制备步骤如下：

(1)取待交联的cd61单抗(1mg/ml)进行akta纯化；

(2)将fitc溶于dmso中(注意：每次交联使用的fitc均应新鲜配制，避光)，浓度为1mg/ml；

(3)按照p:f(cd61单抗:fitc)为1mg:150μg的比例将fitc缓慢加入抗体溶液中，边加边轻轻晃动，使其与抗体混合均匀，暗处4℃反应8hr；

(4)加入5mol/l的nh4cl至终浓度50mmol/l，4℃终止反应2hr；

(5)将交联物在pbs中透析四次以上，至透析液清亮；

(6)交联物的鉴定

蛋白浓度(mg/ml)＝(a280-0.31×a495)/1.4；

f/p比例：3.1×a495/(a280-0.31×a495)，该值应介于2.5～6.5之间；

(7)将fitc交联的蛋白置于ph7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1％nan3、1％bsa，4℃暗处保存。

nanodrop微量蛋白检测仪器检测fitc-cd61的浓度：

(1)打开nanodrop微量蛋白检测仪器，滴加超纯水清洗检测探头；

(2)在检测探头上滴加3μl蛋白buffer溶液(1×pbs)，点击blank进行校准；

(3)在检测探头上滴加3μl的fitc-cd61溶液，选择488nm波长，读取数值；

(4)fitc-cd61经nanodrop检测浓度为0.04325mg/ml。

实施例4

fitc标记的cd61单克隆抗体在流式细胞术检测人外周血血小板cd61抗原表达中的应用，具体操作如下：

1、分离血小板

(1)外周血1.5ml(edta抗凝采血管)，转移至2mlep管中；

(2)混匀后200×g离心20分钟(minute，min)；

(3)取2/3的血浆层，等体积加入pbs(ph值为7.4)，混匀，100×g离心20min；

(4)取上清，800×g离心20min，弃上清；

(5)加2mlpbs800×g离心20min洗涤一次，沉淀即为血小板；

(6)检测血小板的浓度。

2、流式免疫荧光检测血小板cd61表达

(1)取上述血小板悬液，以每管1×10⁶加至2mlep管中，1号管中加入100μlpbs作为阴性对照，2号管中加入实施例3中fitc-cd61抗体5μl，室温避光孵育60min；

(2)各管中均加入300μlpbs重悬后上机检测，结果见图2(图中(a)、(b)分别为1号管、2号管检测结果)。

从图2可以看出，分离的人外周血血小板与pbs孵育后阳性率为0.124％，而实施例3制备的fitc-cd61抗体与人外周血血小板孵育后阳性率为97.0％。

实施例5

流式检测试剂，包含上述实施例2制备的鼠抗人cd61单克隆抗体及其他检测助剂，均为现有技术，此处不再赘述。

实施例6

流式检测试剂，包含上述实施例3制备的fitc标记的cd61单克隆抗体及其他检测助剂。

试验例

一、单克隆抗体特异性鉴定的方法

1、试验方法

(1)用np40细胞裂解液裂解细胞，制备淋巴细胞蛋白裂解液，按10⁷个细胞加入1mlnp40细胞裂解液，冰上裂解1h后，4℃、10000×g离心20min，上清分装后置于-20℃保存；

(2)以淋巴细胞蛋白裂解液为蛋白样品，用腹水制备得到抗体，进行免疫沉淀，免疫沉淀产物进行sds-page电泳(见图3，图中m为marker，1为proteing+淋巴细胞裂解蛋白+iid5g8，2为proteing，3为淋巴细胞裂解蛋白)，考马斯亮蓝r250染色，同时免疫沉淀产物进行westernblot(见图4，图中m为marker，1为proteing+淋巴细胞裂解蛋白+iid5g8，2为proteing，3为淋巴细胞裂解蛋白)，结果进行对照分析；

(3)免疫沉淀产物对照western结果，回收sds-page考染胶目的条带，送上海新生命进行质谱分析，确定抗原名称，进而确定抗体。

2、试验结果

(1)westernblot及免疫沉淀

从图3可以看出，泳道1中100kda和140kda位置重复出现两条清晰条带。从图4可以看出，泳道1显示抗原位置为140kda，而泳道3显示抗原位置为100kda。故将图3泳道1中100kda和140kda位置处条带送至上海中科新生命测定质谱。

(2)质谱鉴定免疫沉淀抗原

鉴定结果表明，iid5g8单抗对应的140kda抗原质谱为cd41，100kda抗原质谱为cd61(见下表1、2)。

表1iid5g8单抗对应的140kda抗原质谱检测结果

表2iid5g8单抗对应的100kda抗原质谱检测结果

(3)单抗特异性westernblot验证

经质谱分析鉴定iid5g8单抗免疫沉淀获得抗原为cd61和cd41，故订购abcam蛋白(含有天然cd41和cd61)进行western鉴定，abcam蛋白sds-page电泳结果见图5(图中m为marker，1为abcam蛋白)，western鉴定iid5g8纯化抗体电泳结果见图6(图中a～d依次为iid5g8抗体1:200、1:500、1:1000、1:2000效价电泳结果，a～d中m均为marker，1为iid5g8纯化抗体)。

从图5可以看出，订购的abcam蛋白除含有cd41和cd61两种蛋白外，还有其他杂蛋白，但是cd41和cd61的行亮相对较高。从图6可以看出，iid5g8抗体做一抗，在95kd偏上出现特异条带，说明iid5g8抗体针对cd61抗原产生特异性条带。

二、单克隆抗体亚类鉴定

以捕获elisa法测定鼠抗人cd61单克隆抗体亚类，结果显示：cd61单克隆抗体重链为igg1，轻链为kappa型。

三、fitc标记的单克隆抗体cd61的特异性分析

取实施例3中fitc-cd61单克隆抗体，采用流式直标免疫荧光法检测血小板cd61表达，具体操作如下：

1、分离血小板

(1)采集外周血1.5ml(edta抗凝采血管)，转移至2mlep管中；

(2)混匀后800转/分钟(rotateperminute，r/min)离心15分钟；

(3)取上层富血小板血浆(platelet-richplasma，prp)，继续2500r/min离心5分钟；

(4)弃去上清，加入bd1×溶血素1.5ml，将血小板吹散后，静置10min破坏红细胞；

(5)2500r/min离心5分钟；

(6)弃去上清，加1×pbs2ml，2500r/min离心5分钟；

(7)重复步骤(6)的操作一次；

(8)弃去上清，加1×pbs重悬。

2、流式免疫荧光检测血小板cd61表达

(1)取上述血小板悬液，以每管1×10⁶加至2mlep管中，9号管中加入100μlpbs作为阴性对照，10号管中加入fitc-cd61抗体10μl，11号管中加入纯化后cd61腹水(1:1000稀释，100μl)作为间标阳性对照，室温避光孵育60min；

(2)各管中均加入2mlpbs重悬后，2500r/min离心5分钟；

(3)弃去上清，9号管中加入5μligg-fitc，10号管中加入5μlpbs，11号管中加入5μligg-fitc，避光孵育30min；

(4)各管中均加入2mlpbs重悬后，2500r/min离心5分钟；

(5)各管中均加入300μlpbs重悬后上机检测，结果见图7(图中(a)为9号管，(b)为10号管，(c)为11号管)。

从图7可以看出，阴性对照在阴性范围，上述制备的fitc-cd61抗体与人外周血血小板孵育后，阳性率为95.7％，而未标记的cd61抗体与人外周血血小板孵育后经间接荧光染色，阳性率为85.8％。说明实施例3制备的fitc-cd61抗体fitc标记效果极佳，能用于流式直标检测人外周血血小板cd61抗原的表达。