本发明涉及一种微生物发酵生产利普司他汀培养基及其方法，属于微生物发酵领域。
背景技术：
利普司他汀（Lipstatin）是由毒三素链霉菌（Streptomyces toxytricini）经发酵产生的代谢产物，其四氢衍生物为奥利司他（olistat），是罗氏公司（Roche）成功开发的减肥药（赛尼可），奥利司他是第一个胃肠道脂肪酶抑制剂，它通过与胃和小肠腔内胃脂肪酶和胰脂肪酶的活性丝氨酸部位形成共价键使酶失活，减少脂肪的分解和吸收，从而达到控制体重的作用。奥利斯他是目前唯一的不进入血液、不作用于中枢神经系统的减肥药。
奥利司他可以通过全化学合成法或先通过发酵合成法产生利普司他汀，后进行氢化合成。由于全合成法生产成本比较高，目前主要由微生物发酵合成法生产，该法成本较低，环境友好，适合大规模生产。
发酵法生产中，主要通过毒三素链霉菌发酵生产。因此，通过对该菌菌株的改良、培养基以及发酵工艺条件的优化来提高利普司他汀的发酵效价都是研究的目标。
浒苔富含碳水化合物、蛋白质、粗纤维、氨基酸、脂肪酸、维生素和多种矿物质,其中铁含量在中国食物营养成分表上记载为我国食物之最，同时还含有脂肪和维生素。在浒苔蛋白质中，氨基酸种类齐全，必需氨基酸含量较高，其中缘管浒苔的限制氨基酸为赖氨酸，氨基酸评分为79；条浒苔的限制氨基酸为蛋氨酸，氨基酸评分为80。浒苔的脂肪酸组成中，多不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸的含量为分别为50.5%、12.7%和36.8%，其中包括近4%的奇数碳原子脂肪酸。因此浒苔是高蛋白、高膳食纤维、低脂肪、低能量，且富含矿物质和维生素的天然理想营养食品的原料。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题上提供一种毒三素链霉菌发酵生产利普司他汀的培养基。
本发明提供的培养基组成如下：黄豆饼粉40-50g/L，琼脂10-30g/L，植物油50-70g/L，，大豆卵磷脂15-25g/L，全脂牛奶 10-20g/L，氨基酸1-5g/L，维生素2-7g/L，无机盐3-8 g/L，溶剂为水，pH7.0-7.3。
优选的，与现有技术中公开的培养基的区别在于，本发明的培养基还包括20-40g/ L的浒苔提取液。
申请人研究发现，浒苔提取液可以促进细胞生长，刺激微生物繁殖，浒苔提取液中含有的多种生物活性成分，可以极大促进微生物的生长发育。
本发明所述的浒苔提取液的制备方法如下：
1）浒苔的预处理：新鲜浒苔洗净，烘干，研碎得浒苔粉。
2）浒苔提取液：取上述的浒苔粉，加入浒苔粉质量3-5倍的水，加热到70-80℃，然后用均质机均质，均质完后，加热到90-100℃，保持30-50min；降温到30℃，加入复合酶400-500U/g；升温到35-45℃，保持50-90min，
复合酶选自纤维素酶、溶菌酶、蛋白酶中的一种或几种。
3）提取液过滤，取滤液，加入甘油，滤液和甘油的重量比是10:2-3。
优选的，本发明所述的培养基中，用的植物油包括花生油、大豆油、玉米油、芝麻油、蓖麻油中的一种或多种。进一步的，本发明提供一种植物油的组合，包括花生油、芝麻油和蓖麻油，三者重量比是3:2:1。
优选的，本发明所述的培养基中，用的氨基酸包括下列成分：甘氨酸、L-门冬酰胺、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸。所述各种氨基酸重量比例按照实际需要合理确定比例。例如，加入的每种氨基酸的重量相同。
优选的，本发明所述的培养基中，用的维生素包括下列成分：维生素H、氯化胆碱、叶酸、烟酰胺、维生素B6、维生素B12、i-肌醇。所述各种维生素重量比例按照实际需要合理确定比例。例如，加入的每种维生素的重量相同。
优选的，本发明所述的培养基中，用的所述的无机盐包括下列成分：无水硫酸镁、碳酸氢钠、氯化钾、氯化钠。所述各种无机盐重量比例按照实际需要合理确定比例。例如，加入的每种无机盐的重量相同。
本培养基使用时的灭菌方法：本培养基采用过滤除菌法，使用微孔滤膜过滤器。使用装入滤膜，当溶液从针筒注入滤器时，各种微生物被阻留在微孔滤膜上面，而液体和小分子物质通过滤膜，从而达到除菌的目的。其滤膜是由硝酸纤维素、醋酸纤维素等制成，采用0.22μm或者是0.1μm孔径，每张滤膜只使用1次。
本发明的有益效果：
本发明培养基与现有培养基相比，增加了浒苔提取液，浒苔中含有丰富的多糖组分和小分子功能性多肽，可以提高发酵过程中表达的稳定性，提高发酵效价，利用毒三素链霉菌生产利普司他汀，可使得产物效价累积达到16.3g/L。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供的发酵生产利普司他汀的培养基组成如下：黄豆饼粉50g/L，琼脂30g/L，植物油70g/L，大豆卵磷脂25g/L，全脂牛奶20g/L，氨基酸5g/L，维生素7g/L，无机盐8 g/L，浒苔提取液40g/ L溶剂为水，pH7.2。
所述的浒苔提取液的制备方法如下：
1）浒苔的预处理：新鲜浒苔洗净，烘干，研碎得浒苔粉。
2）浒苔提取液：取上述的浒苔粉，加入浒苔粉质量5倍的水，加热到80℃，然后用均质机均质，均质完后，加热到100℃，保持50min；降温到30℃，加入复合酶500U/g；升温到45℃，保持90min。
复合酶选自纤维素酶、蛋白酶，两者的酶活力单位比是3:2。
3）提取液过滤，取滤液，加入甘油，滤液和甘油的重量比是10: 3。
用的植物油包括花生油、芝麻油和蓖麻油，三者重量比是3:2:1。
用的氨基酸包括下列成分：甘氨酸、L-门冬酰胺、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸。所述各种氨基酸重量比例相同。
用的维生素包括下列成分：维生素H、氯化胆碱、叶酸、烟酰胺、维生素B6、维生素B12、i-肌醇。所述各种维生素重量比例相同。
用的所述的无机盐包括下列成分：无水硫酸镁、碳酸氢钠、氯化钾、氯化钠。所述各种无机盐重量比例相同。
实施例2
本实施例提供的发酵生产利普司他汀的培养基组成如下：黄豆饼粉40g/L，琼脂10g/L，植物油50g/L，大豆卵磷脂15g/L，全脂牛奶 10g/L，氨基酸1g/L，维生素2g/L，无机盐3 g/L，浒苔提取液20g/ L，溶剂为水，pH7.0。
所述的浒苔提取液的制备方法如下：
1）浒苔的预处理：新鲜浒苔洗净，烘干，研碎得浒苔粉。
2）浒苔提取液：取上述的浒苔粉，加入浒苔粉质量3倍的水，加热到70℃，然后用均质机均质，均质完后，加热到90℃，保持30min；降温到30℃，加入复合酶400U/g；升温到35℃，保持50min，
复合酶选自纤维素酶、溶菌酶、蛋白酶，三者的酶活力单位比是3：2：3。
3）提取液过滤，取滤液，加入甘油，滤液和甘油的重量比是10:2。
用的植物油包括花生油、芝麻油和蓖麻油，三者重量比是3:2:1。
用的氨基酸包括下列成分：甘氨酸、L-门冬酰胺、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸。所述各种氨基酸重量比例相同。
用的维生素包括下列成分：维生素H、氯化胆碱、叶酸、烟酰胺、维生素B6、维生素B12、i-肌醇。所述各种维生素重量比例相同。
用的所述的无机盐包括下列成分：无水硫酸镁、碳酸氢钠、氯化钾、氯化钠。所述各种无机盐重量比例相同。
实施例3
本发明的培养基的发酵效果测定。
按照中国专利201310434885.1公开的利普司他汀的发酵用毒三素链霉菌、发酵方法和效价检测方法来评定本发明的培养基的效果。
将实施例1公开的培养基应用到培养放大实验中。将活化好的streptomyces toxytricini YKY‐20 新鲜斜面孢子，经种子摇瓶培养24h，培养条件28℃，摇床转速240rpm。按照5%的接种量将种子液接入装有2L发酵培养基的5L 发酵罐中。发酵条件为：空气流量1:1（vvm），搅拌转速500rpm，发酵温度28℃。随着发酵时间的增加，利普司他汀不断积累，发酵至110h时，利普司他汀的效价累积达到16.3g/L。