一种检测鉴定猪圆环病毒3型的PCR引物及检测方法与检测试剂盒与流程

本发明属于动物疾病卫生检验技术领域，具体地，涉及一种检测鉴定猪圆环病毒3型的pcr引物及检测方法与检测试剂盒。

背景技术：

猪圆环病毒属于圆环病毒科，是猪病原体中最小的一种病毒。目前已知有两种圆环病毒能够感染猪，包括：猪圆环病毒1型和猪圆环病毒2型。其中，猪圆环病毒2型（pcv2）感染能导致各种临床疾病，从而导致世界猪肉业巨大的经济损失，而相反，猪圆环病毒1型（pcv1）则不致病。猪圆环病毒感染后的潜伏期均较长，即使是胚胎期或出生后早期感染，也多在断奶后陆续出现临诊症状。研究发现，pcv2可引起以下疾病，包括猪断奶后多系统衰弱综合征（pmws），皮炎与肾病综合征（dns），仔猪先天性震颤（ct），增生性坏死性间质性肺炎以及繁殖障碍等。

2015年，phan，palinski等通过宏基因组测序在美国检测到一种新的猪圆环病毒：猪圆环病毒3型（pcv3）。感染这种病毒的猪常伴有猪皮炎肾病综合征，生殖衰竭，心脏和多系统炎症等症状。而目前，我国尚未有相关pcv3研究进展的报道，也未曾有检测鉴定猪圆环病毒3型的方法或试剂盒。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有猪圆环病毒3型检测鉴定方面存的缺陷和不足，通过参考比对猪圆环病毒3型的基因组序列，选择保守的核甘酸序列作为扩增区域，设计了一对检测猪圆环病毒3型的pcr|引物，所述引物能快速、方便、高效地检测鉴定猪圆环病毒3型，特异性好，灵敏度高。

本发明的目的是提供一种鉴定检测猪圆环病毒3型的pcr引物。

本发明另一目的是提供利用上述pcr引物来检测鉴定猪圆环病毒3型的方法。

本发明的再一目的是提供一种检测鉴定猪圆环病毒3型的试剂盒。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一对检测鉴定猪圆环病毒3型的pcr引物，所述pcr上下游引物pcv3-f/r的序列依次如seqidno.1～seqidno.2所示：

上游引物pcv3-f：5’-gggcacacagccatagat-3’（seqidno.1）；

下游引物pcv3-r：5’-ttccgggacataaatgct-3’（seqidno.2）。

本发明发现猪圆环病毒3型编码两个主要的开放阅读框：rep和cap，两者处在dna链上相反的方向。通过参考与比对genbank中所有pcv3cap基因序列，选择保守的核甘酸序列作为扩增区域，设计了一对检测猪圆环病毒3型的pcr引物，通过对该引物的特异性、敏感性和重复性进行试验，证实此引物能用于快速、方便、高效地检测猪圆环病毒3型，且特异性好，灵敏度高。

所述引物pcr引物可用于检测和/或鉴定猪病样组织中是否含有猪圆环病毒3型；或用于检测和/或鉴定猪圆环病毒3型。

一种利用上述pcr引物检测鉴定猪圆环病毒3型的方法，包括如下步骤：

s1.提取待测样品dna；

s2.以步骤s1所述dna为模板，以权利要求1所述引物进行pcr反应；

s3.将扩增产物电泳检测，根据电泳结果判断待测样品中是否含有猪圆环病毒3型；

优选地，所述pcr的反应体系为：2×taqmastermix10µl，dna模板2µl，10µmol/lpcv3-f1µl，10µmol/lpcv3-r1µl，ddh2o加至20.0µl。

更优选地，所述2×taqmastermix所含成分浓度为：taqdnapolymerase(recombinant)0.05units/µl，mgcl24mm，dntps(datp,dctp,dgtp,dttp)0.4mm。

优选地，所述pcr反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，49℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环；72℃终延伸10min。

优选地，所述电泳检测为取8μlpcr扩增产物，加入含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶中进行电泳，条件为130v，25min。

优选地，所述结果判断的标准为：当pcr产物在267bp处有明显发亮条带，且阴性对照无条带，则表明待测样品中含有猪圆环病毒3型。

上述检测方法在检测和/或鉴定猪病样组织中是否含有猪圆环病毒3型方面的应用；或在检测和/或鉴定猪圆环病毒3型方面的应用均在本发明保护范围内。

同时，本发明还提供一种检测鉴定猪圆环病毒3型的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1所述pcr引物。

优选地，所述试剂盒还包含待测样品dna提取所需试剂与pcr扩增所需试剂。

更优选地，所述试剂包括pcr缓冲液，taqdnapolymerase(recombinant)，mgcl2，dntps(datp，dctp，dgtp，dttp)，ddh2o。

优选地，所述试剂盒中还包含猪圆环病毒3型的核酸模板，即阳性对照。

优选地，所述试剂盒还包括阴性对照；所述阴性对照为除去猪圆环病毒3型之外的其他种类的猪病毒的dna或cdna。

更优选地，所述阴性对照为猪流行性腹泻病毒，猪塞内加谷病毒，口蹄疫病毒，猪德尔塔冠状病毒，猪库布病毒，猪博卡病毒或猪萨佩罗病毒中的一种或多种的dna或cdna。

作为一种可选择的实施方式，所述检测试剂盒的使用方法具体如下：

（1）用dna抽提试剂对待测样品进行dna抽提；

（2）以步骤（1）的dna为模板，以本发明所提供的猪圆环病毒3型pcr引物进行扩增，所述pcr扩增引物为：

上游引物pcv3-f：5’-gggcacacagccatagat-3’

下游引物pcv3-r：5’-ttccgggacataaatgct-3’

所述pcr扩增反应体系为：扩增反应的总体积为20.0µl，其各种成分分别为：2×taqmastermix10µl，dna模板2µl，10µmol/lpcv3-f1µl，10µmol/lpcv3-r1µl，ddh2o加至20.0µl。

所述pcr扩增反应过程为：94℃预变性5min；94℃变性30s，49℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环；72℃终延伸10min。

（3）扩增产物的鉴定：取8μlpcr扩增产物，加入含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶中进行电泳，条件为130v，25min。。紫外灯下观察pcr产物，若pcr产物在267bp处有明显发亮条带且阴性对照无条带，则显示为对猪圆环病毒3型呈阳性反应，即待测样品中含有猪圆环病毒3型。

本发明所提供的猪圆环病毒3型的检测方法操作简便高效、pcr引物特异性高，便于临床检测和方便开展流行病学调查。所开展的收集广东地区26份疑似仔猪ct病料，进行检测后发现其中2份为阳性，表明该毒在我国广东地区已有所传播。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的猪圆环病毒3型检测引物及方法，操作简便、高效、pcr扩增特异性好、灵敏度好，应用于猪圆环病毒3型的pcr检测中的最低检测浓度限值可达到11.958ng/µl，便于临床检测和方便开展流行病学调查，具有较大的应用前景。

附图说明

图1为猪圆环病毒3型pcr电泳结果图，泳道从左到右分别为m：2000dldnamarker；1：猪圆环病毒3型阳性样品，2：空白对照。

图2为猪圆环病毒3型特异性检测电泳结果图，泳道从左到右分别为m：2000dldnamarker；1：猪圆环病毒3型；2：猪水泡病毒，3：口蹄疫病毒；4：猪流行性腹泻病毒；5：猪塞内加谷病毒；6：猪德尔塔冠状病毒；7：猪库布病毒；8：猪博卡病毒；9：猪萨佩罗病毒。

图3为猪圆环病毒3型敏感性检测电泳结果图，泳道从左到右分别为m：2000dldnamarker；1～7代表10^-1至10^-7的模板稀释度。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施实例1猪圆环病毒3型pcr引物的设计

1、本发明发现猪圆环病毒3型编码两个主要的开放阅读框：rep和cap，两者处在dna链上相反的方向。通过参考与比对genbank中所有pcv3cap基因序列，选择保守的核甘酸序列作为扩增区域，设计了一对检测猪圆环病毒3型的pcr引物；所述pcr引物如下所示：

上游引物pcv3-f：5’-gggcacacagccatagat-3’；

下游引物pcv3-r：5’-ttccgggacataaatgct-3’。

2、经过验证，以猪圆环病毒3型的dna为模板进行扩增，结果显示，该引物组能够特异性的扩增检测猪圆环病毒3型。

实施例2pcr引物检测猪圆环病毒3型样本

1、dna抽提

（1）取猪病料组织30mg，将组织尽量剪碎，分别装入1.5ml的离心管中。

（2）每管中加入450µl的裂解缓冲液(10mmtris-hclph8.0;100mmedta,ph8.0)。

（3）每管加入10%sds50～100µl,再加入2.5～5µl蛋白酶k(20mg/ml),使其终浓度达100µg/ml，混匀，55℃3h至过夜（期间将管子颠倒几次）。

（4）样品中加入150µlnacl，室温8000rpm离心20min，去沉淀，然后在上清液中加入等体积（500µl）预冷异丙醇，混匀，20℃处理30min，14000rpm离心10min，去上清液。沉淀加70%alc洗涤离心去alc，室温挥发alc5～10min，加te500µl，加10µlrnaase(终浓度4mg/µl)，即2.5µl。37℃30min或65℃15min。

（5）加等体积酸液（提取dna中的蛋白质）缓慢来回颠倒离心管10min，13000～15000rpm离心10min。用移液管小心取出上层相至另外干净的离心管中，不要触到两相之间的白色蛋白层（可视情况重复操作）。

（6）加入等体积酚：氯仿(1:1)，轻摇，缓慢颠倒混匀10min13000～15000rpm离心5-10分钟，取上层清液于干净离心管中。

（7）加入等体积氯仿（氯仿：异戊醇=24:1），轻摇，缓慢颠倒混匀10min，13000～15000rpm离心5～10min。取上清液加入1/10体积2mnacl和等体积-20℃保存的无水乙醇沉淀dna10min，13000rpm离心5min，去上清。

（8）加入100～150µl70%alc，离心，小心倒掉alc，用70%alc再洗一次，然后去alc。45℃烘箱烘干15～30min，用双蒸水沿管壁沿四周冲洗（te量视dna沉淀量而定，在80～250µl之间），溶解，-20℃保存备用。

2、使用本发明所提供猪圆环病毒3型的pcr扩增引物进行扩增：

上游引物pcv3-f：5’-gggcacacagccatagat-3’，

下游引物pcv3-r：5’-ttccgggacataaatgct-3’；

扩增反应体系为：扩增反应的总体积为20.0µl，其各种成分分别为：2×taqmastermix10µl，dna模板2µl，10µmol/l上游引物pcv3-f1µl，10µmol/l下游引物pcv3-r1µl；ddh2o加至20.0µl。

pcr反应过程为：94℃预变性5min；94℃变性30s，49℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环；72℃延伸10min，4℃下保存。

其中所提供的2×taqmastermix所含成分浓度为：

taqdnapolymerase(recombinant)：0.05units/µl；

mgcl2：4mm；

dntps(datp,dctp,dgtp,dttp)：0.4mm。

3、扩增产物的鉴定：取8μlpcr扩增产物，加入含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶中进行电泳，条件为130v，25min。紫外灯下观察pcr产物在267bp处有明显发亮条带，且阴性对照无条带，则显示为对猪圆环病毒3型呈阳性反应。

4、回收阳性条带后将样品送至基因测序公司进行产物基因测序，根据测序反馈结果与ncbi上的序列进行blast分析比对，确定样品中含猪圆环病毒3型。

实施实例3猪圆环病毒3型pcr引物的特异性检测

参考实施实例2中步骤1至步骤3，利用实施例1所述pcr引物对猪圆环病毒3型、口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪塞内加谷病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪库布病毒、猪博卡病毒和猪萨佩罗病毒分别进行pcr检测。所述病毒毒株均由广东温氏集团惠赠。

电泳结果如图2所示，本发明的pcr引物对猪圆环病毒3型呈阳性反应，而对猪水泡病毒、口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪塞内加谷病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪库布病毒、猪博卡病毒和猪萨佩罗病毒呈阴性反应，说明该引物对猪圆环病毒3型有着较强的特异性。

实施实例4猪圆环病毒3型的敏感性试验

参考实施实例2中步骤1抽提猪圆环病毒3型dna后，用ddh2o将样品dna模板按照10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7稀释浓度进行稀释，按照实施例2步骤2进行pcr检测。

电泳结果图3所示，本发明的pcr引物在10^-4的模板稀释度上仍然呈阳性反应，表明其敏感性较高。同时，本发明引物最低检测模板浓度为11.958ng/µl。

实施实例5猪圆环病毒3型pcr引物及检测方法的应用

本实例收集了来自广东省7个猪场共26份疑似病猪样品，采用实施实例2的方法进行猪圆环病毒3型pcr检测。

采用实施实例2的扩增方法，试验结果表明，26份样品中有2份呈阳性反应，说明我国国内已发现疑似猪圆环病毒3型疑似感染病例，该毒在我国广东地区已有所传播，这以便于进一步开展后续研究工作。