一种温敏型可注射水凝胶的制备方法与流程

本发明属于生物医用材料技术领域，涉及一种天然多糖温敏及ph敏感型可注射、可降解水凝胶的制备方法。

背景技术：

水凝胶是由高分子聚合物通过物理结合或化学交联得到的三维网络结构，由于其具有大量的亲水性基团，水凝胶对水具有很高的亲和力，可以吸收大量的水分，高含水量使得它们比其他合成生物材料更类似于天然活体组织。所谓可注射水凝胶是指注射前是流动液体，当注入皮下或肌肉组织后，在注射部位原位凝胶化。诱导溶液凝胶化的因素有温度、离子浓度、ph值以及化学反应等。温敏型可注射水凝胶的聚合物结构上一般包含一定比例的亲水和疏水链段，由于温度改变后氢键或者疏水作用的改变从而导致聚合物的物理状态发生改变。使用温敏型可注射水凝胶作为输运载体具有一些特殊优势：在病变部位可与组织高度贴合，最小化对周围组织造成伤害；凝胶化条件温和可最大限度保证细胞、药物等活性；可通过简单物理混合的方法负载细胞和各类药物，并且负载率极高。

壳聚糖、透明质酸等多糖由于其生物相容性好、天然可降解、来源广泛等特点使其成为制备水凝胶的良好材料。壳聚糖(chitosan,cs)是甲壳质经脱乙酰反应后得到的一类由2-氨基-2-脱氧-葡萄糖通过β-(1,4)糖苷键连接的天然阳离子直链碱性多糖，呈白色或淡黄色，不溶于水及碱性溶液，可溶于酸性溶液。其结构单元类似于细胞外基质的糖胺聚糖，因此，壳聚糖具有多重生物活性优点，可用于构建不同的生物材料，壳聚糖的碱性使其对酸敏感，可作为具有ph靶向功能的载体材料。透明质酸(hyaluronicacid,ha)广泛存在于动物的关节腔和神经组织中，由d-葡萄糖醛酸及n-乙酰葡糖胺所组成的双糖单位以β-1,4-配糖键相连构成，是细胞外基质的主要成分。其具有良好的流动性、润滑性、保水性以及粘弹性特征，广泛应用于医用生物材料方面。

本发明制备了一种新型水凝胶，其可以提供生长因子、细胞、药物等在病变部位进行局部释放。水凝胶载体由壳聚糖-透明质酸钠组成，辅以甘油磷酸钠(glycerophosphate,gp)和瓜尔胶(guargum,gg)，其具有生物相容性、可降解等特性。通过成分的不同配比，找到其最佳制作工艺，并且使用扫描电镜、紫外分光光度计对其形貌和缓释性能进行表征。这种可注射水凝胶系统在低温(4℃)下是液态，当温度升高到37℃时原位快速凝胶化，其能保持长时间有效的药物释放或进行组织修复。

技术实现要素：

本发明提供一种温敏型可注射水凝胶的制备方法，采用壳聚糖、透明质酸钠、甘油磷酸钠和瓜尔胶为原料，简单快速制备一种温敏型可注射、可降解水凝胶，使用这种水凝胶充当药物阿霉素的缓释载体，通过在不同ph值缓冲液中的释药实验以表征其缓释性能。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种温敏型可注射水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

第一步，配制壳聚糖溶液

将壳聚糖溶于浓度为0.05～0.1mol/l的醋酸溶液中，磁力搅拌使其完全溶解后，得到浓度为5～35mg/ml的壳聚糖溶液，在4℃的恒温箱中放置1～2h，静置备用。

第二步，制备透明质酸钠和甘油磷酸钠的混合溶液a

将透明质酸钠和甘油磷酸钠粉末加入去离子水中，磁力搅拌器使其完全溶解后得到混合溶液a，放入4℃的恒温箱中1～2h，静置备用。混合溶液a中透明质酸钠的浓度为3～20mg/ml，甘油磷酸钠的浓度为150～800mg/ml。

第三步，制备混合溶液b

冰水浴条件下，将混合溶液a逐滴滴加到壳聚糖溶液中，滴加过程中进行磁力搅拌，使混合溶液a与壳聚糖溶液混合均匀得到混合溶液b；所述的混合溶液a与壳聚糖溶液的体积比为1:15～15:1之间。

第四步，制备混合溶液c

将瓜尔胶溶于去离子水中，加热至50-75℃，磁力搅拌使其完全溶解，得到浓度为3～8mg/ml的瓜尔胶溶液；冷却至4℃后，静置备用。将瓜尔胶溶液混合溶液b按0.1～0.5:1的体积比混合均匀得到混合溶液c。

第五步，加热成胶

将第四步中所得混合溶液c置于37℃的恒温水浴锅中，使其快速凝胶化，得到温敏型可注射水凝胶。凝胶时间根据溶液浓度和所配体积的不同而长短不等。

基于所制备的水凝胶进行阿霉素释药实验。在制备水凝胶的过程中我们首先将阿霉素溶解于醋酸溶液中，按照上述步骤进行制备。值得一提的是，由于阿霉素中含有氨基，在水凝胶制备步骤的第二步中的甘油磷酸钠浓度也应相应提高至1～1.5g/ml，更有利于溶液在同等体积比下于37℃凝胶化。阿霉素释放实验的具体步骤如下：

第一步，配制ph＝4.00和ph＝6.86的缓冲液：称取邻苯二甲酸氢钾10.21g，用去离子水定容至1000ml即得ph＝4.00溶液；分别称取6.8045g磷酸二氢钾和0.9439g氢氧化钠，混合后用去离子水定容至1000ml即得ph＝6.86溶液。

第二步，缓释实验：称取一定质量的载药溶液置于西林瓶中，在37℃下保温5min使其凝胶化，小心加入适量体积的上述缓冲液(pbs)作为释放介质，置于水浴摇床中，振荡速率为25rpm。

第三步，测量溶液中阿霉素浓度的变化：每隔一定的时间间隔于西林瓶中取一定体积缓释液，同时加入相同体积新鲜缓冲液(pbs)使溶液的总体积保持不变。取出的缓释液用紫外分光光度计在特定波长下测试其吸光度，根据预先测定的阿霉素标准曲线得到缓释液中阿霉素的浓度。

壳聚糖-透明质酸钠-甘油磷酸钠-瓜尔胶水凝胶的成胶机理：在酸性溶液中壳聚糖分子链上氨基质子化，阳离子间的静电斥力以及其与水的氢键作用使其溶解。当加入透明质酸钠和甘油磷酸钠的混合溶液后，使溶液体系的ph值增大，一方面壳聚糖链上氨基去质子化，电荷密度降低，壳聚糖链间的静电斥力作用减弱，分子链之间的作用力增强；另一方面壳聚糖和透明质酸钠与甘油磷酸钠之间存在静电引力作用，使其分子链互相吸引缠绕。由于温度较低的缘故，高分子链的活动受到抑制，聚合物与水之间的氢键作用占据主导地位使体系仍能保持溶液状态。随着溶液温度升高，分子链的运动加剧，壳聚糖与透明质酸钠和甘油磷酸钠之间的静电引力增强，同时壳聚糖与水之间的氢键作用减弱，使得壳聚糖高分子链的疏水部分暴露和分子链发生集聚，壳聚糖、透明质酸钠和甘油磷酸钠之间的物理交联导致其溶液凝胶化，适量瓜尔胶的引入增加了体系的粘稠度，有利于成胶发生。

本发明的有益效果：温敏型可注射水凝胶的载体由壳聚糖‐透明质酸钠组成，辅以甘油磷酸钠和瓜尔胶，这种水凝胶系统在低温(4℃)下是液态，通过简单物理混合的方法可负载各类药物和细胞等，可使用微针注射到病变部位，壳聚糖和透明质酸钠非细胞粘合剂，可以最小化组织瘢痕的形成；并且其具有生物相容性，当注入机体内不会发生免疫反应，同时在溶菌酶等作用下可以缓慢降解，避免手术移除所带来的痛苦和伤害。

附图说明

图1为cs-ha-gp-gg温敏型可注射水凝胶流程图；

图2为cs-ha-gp-gg温敏型可注射水凝胶切面形貌图；

图3为ph＝4.00和ph＝6.86下的累计释放曲线图。

具体实施方式

以下将结合技术实现方案和附图说明中的图2和图3详细介绍本发明的具体实施方式。图2是实施例1中所制备水凝胶的切面形貌，将实施例1中所制备的水凝胶切块，冷冻干燥后观察切面结构，冷冻干燥可以保持水凝胶原始结构不被破坏。通过切面的电镜照片我们发现所制备水凝胶中具有大量的孔洞结构，这将有利于药物负载或细胞封装。图3是实施例1中由水凝胶缓释实验得到的累计释放曲线。从图中我们可以看出，总质量相同且负载阿霉素质量也相同的两种水凝胶的累计释放曲线显著不同，在较低的ph值下有较快的释放速度，说明此种水凝胶具有ph敏感特性。

实施例1

a)醋酸溶液的配制：取143μl纯醋酸溶液加入到50ml去离子水中配制0.05mol/l的醋酸溶液。

b)壳聚糖溶液的配制：称取1g壳聚糖加入50ml醋酸溶液并用磁力搅拌器迅速搅拌，每隔5min用超声波清洁振荡仪振动2min以加速溶解。当壳聚糖完全溶解后在4℃的恒温箱中放置1.5h，静置备用。

c)透明质酸钠和甘油磷酸钠混合液的配制：称取15mg透明质酸钠和300mg甘油磷酸钠粉末，放入西林瓶中充分搅拌使其混合均匀，加入2ml去离子水并使用磁力搅拌器使其完全溶解。放入4℃的恒温箱中1.5h，静置备用。

d)不同体积溶液的均匀混合：取0.6ml透明质酸钠与甘油磷酸钠混合溶液逐滴加入到处于冰浴环境中的1.5ml壳聚糖溶液，在滴加的过程中使用磁力搅拌器不停搅拌，使透明质酸钠和甘油磷酸钠的混合溶液与壳聚糖溶液均匀混合。

e)瓜尔胶溶液的配制及加入：称取80mg的瓜尔胶与20ml去离子水混合，加热至50-75℃并使用磁力搅拌器搅拌使其完全溶解，冷却至4℃，静置，备用。取0.3ml瓜尔胶溶液与上一步所得混合液混合。

f)加热成胶：将所得溶液置于37℃的恒温水浴锅中，溶液快速凝胶化。

基于所制备的水凝胶在体外进行阿霉素释药实验以模拟药物在体内局部位置释放的情况。体外阿霉素释放实验的具体步骤如下：

1)配制ph＝4.00和ph＝6.86的缓冲液：称取邻苯二甲酸氢钾10.21g，用去离子水定容至1000ml即得ph＝4.00溶液；分别称取6.8045g磷酸二氢钾和0.9439g氢氧化钠，混合后用去离子水定容至1000ml即得ph＝6.86溶液。

2)缓释实验：称取1g载药溶液，置于15ml内径为20mm的西林瓶中，在37℃下保温5min使其凝胶化后小心加入10ml上述缓冲液(pbs)作为释放介质，置于水浴摇床中，振荡速率为25rpm，以此模拟体内释放。

3)测量溶液中阿霉素浓度的变化：每隔30min时间间隔于西林瓶中取4ml缓释液，同时加入4ml新鲜缓冲液(pbs)使溶液的总体积保持不变。取出的缓释液用紫外分光光度计在特定波长处测试其吸光度，根据预先测定的阿霉素标准曲线得到缓释液中阿霉素的浓度。

实施例2

称取300mg壳聚糖溶于20ml0.05mol/ml醋酸溶液，在4℃的恒温箱中放置1.5h，静置备用。称取25mg透明质酸钠和1.5g甘油磷酸钠粉末，加入2.5ml去离子水并使用磁力搅拌器使其完全溶解，放入4℃的恒温箱中1.5h，静置备用。取0.5ml透明质酸钠与甘油磷酸钠混合溶液逐滴加入到处于冰浴环境中的2.0ml壳聚糖溶液，充分搅拌使透明质酸钠和甘油磷酸钠的混合溶液与壳聚糖溶液均匀混合。称取60mg的瓜尔胶与10ml去离子水混合，加热至50-75℃并使用磁力搅拌器搅拌使其完全溶解，冷却至4℃，静置，备用。取0.5ml瓜尔胶溶液与壳聚糖-透明质酸钠-甘油磷酸混合液混合。将所得溶液置于37℃的恒温水浴锅中，溶液快速凝胶化。

药物缓释实验同实施例1。

实施例3

称取300mg壳聚糖溶于10ml0.1mol/ml醋酸溶液，在4℃的恒温箱中放置1.5h，静置备用。称取15mg透明质酸钠和1.5g甘油磷酸钠粉末，加入3ml去离子水并使用磁力搅拌器使其完全溶解，放入4℃的恒温箱中1.5h，静置备用。取1ml透明质酸钠与甘油磷酸钠混合溶液逐滴加入到处于冰浴环境中的5ml壳聚糖溶液，充分搅拌使透明质酸钠、甘油磷酸钠与壳聚糖均匀混合。称取100mg的瓜尔胶与20ml去离子水混合，加热至50-75℃并使用磁力搅拌器搅拌使其完全溶解，冷却至4℃，静置，备用。取1.0ml瓜尔胶溶液与壳聚糖-透明质酸钠-甘油磷酸混合液混合。将所得溶液置于37℃的恒温水浴锅中，溶液快速凝胶化。

药物缓释实验同实施例1。

本专利提出的以上实施例只对技术方案进行说明，而不进行限制。