一种鹅细小病毒感染性克隆的拯救方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种GPV感染性克隆质粒转染鹅胚拯救病毒的简便高效方法。

背景技术：

我国的养鹅业居于世界首位，也是鹅肉消费大国。鹅细小病毒是1月龄内雏鹅的一种重要疫病，死亡率可高达90％，该病自上世纪50、60年代在国内流行。目前虽已研制了弱毒疫苗供种鹅或雏鹅使用，但该病并未从田间消失，仍然持续性对养鹅业造成经济损失。

反向遗传技术是开展病毒研究的一种有用平台，在阐明病毒致病机制和疫苗研制中能够发挥重要作用。同样，构建鹅细小病毒感染性分子克隆，以此为基础可以对GPV的特定基因展开更为有效的研究，也是GPV疫苗研制的一个有用平台。

病毒拯救是反向遗传操作上的重要一环，大多是将构建的质粒或RNA转录产物转染细胞的途径来实现拯救目的。转染原代的鹅胚成纤维细胞拯救感染性GPV也有报道，对于细小病毒而言，细胞处于分裂期时才最适于病毒复制，因此转染时细胞所处状态对转染拯救结果影响很大。总体来看，在细胞上进行转染不仅费事，拯救效率也不高。因此，若能建立一种简便、高效的拯救方法，将极大的方便并推动GPV相关基础研究的深入开展。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种简便高效的鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)感染性克隆质粒的拯救方法。

本发明所述的鹅细小病毒感染性克隆质粒的拯救方法，是将GPV的完整基因组克隆入载体质粒pBSKNB，获得重组质粒，将重组质粒与转染试剂混合后，通过绒毛尿囊膜途径接种非免疫鹅胚，重组质粒在鹅胚中得到拯救；所述pBSKNB载体，是将商品化的pBluescript II(SK)质粒上原有的EcoRV和HindIII酶切位点分别用NcoI和BclI位点替换而得到。

具体地：将重组质粒与转染试剂Lipofectamine 2000按照一定比例1:2.5(μg/μl)比例混合后，通过绒毛尿囊膜途径接种11日龄非免疫鹅胚。鹅胚在接种后120h～192h之间死亡，胚体具有典型的GPV感染特征，表现为胚体出血、绒毛尿囊膜水肿的典型特征。拯救出的病毒具有与亲本病毒相近的生物学特性。

进一步地，为了排除转染拯救过程中亲本GPV毒株污染的可能，可通过overlap PCR方法，在重组质粒的克隆基因组内部引入两个同义碱基突变作为遗传标记，得到的带有遗传标记的重组质粒再施以转染及拯救过程。更具体地，可以是在重组质粒的VP1基因中引入两个突变碱基作为遗传标记。

本发明中，所述的重组质粒是插入GPV LH株完整基因组pLH质粒，或者是插入GPV LH株完整基因组并引入遗传标记的pLHΔ质粒，但是，本发明的拯救方法适用于但不仅限于插入GPV LH株完整基因组的pLH质粒或pLHΔ质粒。对其它GPV强毒分离株或者鹅胚化弱毒株，以本发明内容公开的相同构建方法克隆其全基因组，获得重组质粒，重组质粒的拯救方法同pLH质粒或pLHΔ质粒。

本发明所述的质粒pLH，它的构建方法在于：超速离心浓缩GPV LH株病毒，提取病毒的基因组单链DNA，体外退火后生成双股DNA。选用BclI和NcoI酶切基因组DNA生成亚基因组片段，分别克隆入自行改造的pBSKNB载体的相应酶切位点，再通过酶切-连接的常规分子操作，拼接获得含有完整基因组的质粒pLH。

进一步地，通过overlap PCR方法，在pLH质粒的VP1基因中引入两个同义突变碱基作为遗传标记，获得质粒pLHΔ。

本发明中所述相近的生物学特性是指在鹅胚半数致死量(ELD₅₀)和感染试验中的雏鹅死亡率这两个关键指标上，拯救病毒具有与亲本病毒相近的数值。

本发明公开了LH株的完整基因组序列。LH株基因组由5047个碱基组成(SEQ IB NO.5)，LH株的ITR由414个碱基组成，其中375个碱基形成回文结构，其余39个碱基构成D区序列。基因组左侧的ITR的D区序列与右侧ITR的D′序列反向互补，这一特性将使得基因组分子能够形成一个更大范围的回文。

作为一个具体的操作，本发明公开了一种GPV全基因组克隆的构建方法，该方法对其它GPV毒株同样适用，它包括如下步骤：

(1)GPV核酸的提取

GPVLH株在鹅胚中增殖，收集的尿囊液分别经差速和超速离心浓缩到原有体积的1/50。采用SDS-蛋白酶K消化法提取病毒核酸。经95℃变性10min，缓慢冷却至65℃退火，使单股DNA形成双股DNA，经0.8％琼脂糖凝胶电泳，可观察到约5.1kb基因组DNA。

(2)全基因组克隆的构建

将提取的GPV LH株基因组双股DNA用NcoI和BclI限制性内切酶进行双酶切，产生的左中右三个片段大小分别为0.6kb、3.2kb和1.3kb，各片段切胶回收。将0.6kb的左片段克隆入载体质粒pBSKNB的HincII-BclI之间，产生pBSKNB-L质粒。将3.2kb的中间片段插入质粒pBSKNB的BclI-NcoI之间，产生pBSKNB-M质粒。将1.3kb的右片段插入pBSKNB的NcoI-SmaI位点之间，获得pBSKNB-R质粒。

在成功克隆亚基因组片段并测序的基础上，通过常规的酶切-连接操作，将各亚基因组片段正确的拼接，从而获得包含LH株完整基因组的克隆质粒pLH。

本发明还公开了pLH质粒中遗传标记引入的方法，以便于将拯救病毒与亲本病毒LH株区分开(见附图5)。

在pLH质粒的VP1基因中引入两个突变碱基作为遗传标记，不改变氨基酸组成，获得质粒pLHΔ。利用LH株基因组内部在拟突变位点两侧分别存在单一的SexAI和NcoI位点的条件，设计了一组overlap PCR引物，引物代号和序列分别为：

overlap-1:GCAGGAACAATTACCAGGTACG(SexAI)(SEQ IB NO.1)

overlap-2:GTGGTCGGTAGTTCCCTGT(SEQ IB NO.2)

overlap-3:ACAGGGAACTACCGACCAC(SEQ IB NO.3)

overlap-4:CGGCCCATGGTGCCATAAGC(NcoI)(SEQ IB NO.4)

方框内部为突变碱基，两个突变碱基分别为G→A突变和T→C突变，突变碱基用方框表示。Overlap-1引物和Overlap-4引物内部分别含有SexAI和NcoI位点。

通过overlap PCR,结合酶切连接操作，能够将2个突变碱基引入pLH质粒，获得质粒pLHΔ。

本发明还公开了pLHΔ质粒通过绒毛尿囊膜转染鹅胚拯救病毒的具体方法：

采用Lipofectamine 2000作为转染试剂。质粒和转染试剂的比例按照1：2.5(μg：μl)进行。吸取16μg pLHΔ质粒溶液至1个灭菌的1.5ml离心管中，用opti-DMEM培养液(Invitrogen，美国)稀释至1ml；另一个离心管内加入40μl Lipofectamine 2000转染试剂，加入960μl Opti-DMEM培养液混匀。将稀释后的质粒和转染试剂静置5min后，轻柔混匀，室温静置20min后即可进行转染。每只鹅胚通过绒毛尿囊膜接种0.25ml,其中包含2.0μg质粒。鹅胚在接种后第5天开始出现死亡，至转染后第8天，死亡率达到75％。拯救病毒在鹅胚上能够成功传代。

本发明对拯救病毒的生物性特性进行了测定。结果表明：拯救病毒的鹅胚半数致死量(ELD₅₀)达到每毫升5×10^4.77,与亲本LH株极为相似，后者的ELD₅₀为每毫升5×10^4.36。1日龄雏鹅分别接种了携带遗传标记的拯救病毒和亲本病毒，在15天的观察期内，接种亲本病毒组雏鹅在第3天开始出现死亡，而拯救病毒组在攻毒后第4天出现死亡。到攻毒后的第9天，两组雏鹅死亡率都达到了93.8％。而接种生理盐水的对照组雏鹅均生长健康无一死亡。拯救病毒攻毒组死亡雏鹅同样展现出“小鹅瘟”特征性病变，包括典型的肠栓形成、肠粘膜脱落等病理变化(见附图7)。实验表明拯救病毒具有与亲本病毒相近的生物学特性。该拯救方法操作简便高效，避免了转染细胞带来的繁琐和低效问题，在GPV反向遗传学研究和疫苗创制上具有潜在应用价值。

附图说明

图1.GPV LH株的基因组DNA电泳分析.M：λDNA/HindIII分子量markers.1：提取的病毒核酸。

图2.GPV LH株全基因组的构建策略。

图3是pLH质粒图谱。

图4.pLH质粒的酶切鉴定.M：1kb ladder DNA分子量标准.1.NcoI酶切；2.XhoI和BamHI双酶切；3.SphI酶切。

图5.pLHΔ质粒转染拯救病毒与亲本强毒株的区分。亲本强毒株的扩增靶片段用HindIII酶切，生成0.9kb和0.7kb两条片段；而拯救病毒由于引入的碱基突变，同样的1.6kb靶片段不能为HindIII切开。

图6.拯救病毒和亲本病毒株的攻毒试验。亲本病毒在攻毒后第3天出现死亡病例，拯救病毒在攻毒后第4天出现死亡病例，在攻毒后第9天，两组存活率都下降到6.2％。

图7.pLHΔ拯救病毒攻毒试验中死亡雏鹅的肠道病理变化(A)以及从脏器提取病毒DNA为模板的PCR扩增片段的序列测定结果(B)。

具体实施方式

以下方法针对我们分离的GPV LH株(Wang J,et al.,Arch Virol,2015,160(3):711-718)展开，但所叙述方法对其它GPV毒株一样适用。

1.GPV全基因组克隆质粒pLH的构建

1.1.病毒扩增

将保存的GPV LH株第2代鹅胚尿囊液，用灭菌生理盐水按1:10比例稀释，加入青、链霉素至终浓度各2000μg或IU/ml，置37℃培养箱中孵育30min后接种鹅胚。将经稀释的病毒液经尿囊腔途径接种12日龄鹅胚，每只0.2ml。石蜡封口后放入37℃孵化箱中，每隔8h照蛋1次，剔除48小时前死亡的鹅胚。收集48小时后死亡鹅胚，置于4℃冰箱放置4～6h后无菌收取尿囊液，储存在-40℃冰箱中代用。

1.2.病毒纯化

将收集到的约400ml含病毒尿囊液按11,000g离心20min，取上清后加入1/3体积的氯仿，剧烈震荡，以同样的离心力转速再次离心20min，收集上层水相再经150,000g离心力超速离心3h(SW32Ti转子,Beckman)。弃去上清，病毒沉淀用5ml TE缓冲液(50mM Tris，20mM EDTA，pH 8.0)溶解，-70℃保存待用。

1.3 病毒DNA提取

取500μl浓缩病毒液，分别加入SDS和蛋白酶K至终浓度为1％和400μg/ml。45℃水浴2小时。用苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)和氯仿-异戊醇(24:1)各抽提1次。上清液加入2.5倍体积的无水乙醇和十分之一体积的醋酸钠(pH 5.2)，-70℃沉淀过夜。次日15,000rpm/min，离心20min，去上清，核酸沉淀用70％酒精洗涤，再次15,000rpm/min，离心10min，去上清，沉淀凉干后，用30μL STE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，100mM NaCL，pH 8.0)溶解。将提取的核酸置于95℃水浴10min，使单股DNA发生热变性，然后缓慢冷却到65℃，此时单股DNA可退火形成双链。取10μL经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析DNA，见附图1。

1.4 基因组克隆

为了便于克隆，我们对pBluescriptII(SK)质粒(Agilent公司，美国)的酶切位点进行了改造，将质粒上原有的EcoRV和HindIII酶切位点分别用NcoI和BclI位点替换，改造后的质粒命名为pBSKNB。

将提取的GPV LH株基因组双股DNA用NcoI和BclI限制性内切酶进行双酶切，产生的左中右三个片段大小分别为0.6kb、3.2kb和1.3kb，各片段切胶回收。将0.6kb的左片段克隆入载体质粒pBSKNB的HincII-BclI之间，产生pBSKNB-L质粒。将3.2kb的中间片段插入质粒pBSKNB的BclI-NcoI之间，产生pBSKNB-M质粒。将1.3kb的右片段插入pBSKNB的NcoI-SmaI位点之间，获得pBSKNB-R质粒，构建策略见附图2。

在完成对各个亚片段克隆并测序的基础上，对pBSKNB-L质粒用XhoI和BclI进行双酶切，将内部的0.6kb片段切胶回收，pBSKNB-M质粒同样用XhoI和BclI双酶切线性化后，与0.6kb片段进行连接产生重组质粒pBSKNB-LM。然后进一步将pBSKNB-R质粒用NcoI和BamHI进行双酶切后生成的1.3kb片段插入到pBSKNB-LM质粒的NcoI-BamHI位点之间，最终产生包含LH株全基因组的克隆质粒pLH，质粒pLH图谱见附图3。pLH质粒的酶切鉴定见图4。构建的重组质粒均转化DH5α大肠杆菌感受态细胞进行扩增。

1.5 基因组序列分析

各亚基因组片段克隆送华大基因上海有限公司进行测序。由于ITR二级结构的干扰以及Bubble区序列存在反转的特点，故ITR序列不能直接测出。利用ITR loop区存在单一的SphI酶切位点的事实，故对包含ITR片段的亚克隆片段分别用SphI和XhoI或BamHI进行双酶切，产生的亚片段分别克隆入pUC18或pBSK质粒的相应位点，转化DH5α感受态细胞，阳性克隆测序后可获得一致的ITR序列。利用DNASTAR软件包中的SeqManII程序对所测片段序列进行拼接获得完整的基因组序列，利用MegAlign程序进行序列同源性分析。

2.pLH质粒遗传标记的引入

为了排除拯救病毒可能来自于试验过程中亲本病毒或GPV野毒株污染的可能，采用overlap PCR方法在pLH质粒内部处于VP1基因的HindIII位点处引入碱基突变，但不改变氨基酸的组成。

2.1 overlap PCR引物设计

利用LH株基因组内部在拟突变位点两侧分别存在单一的SexAI和NcoI位点的条件，设计了一组重叠PCR引物，引物由大连宝生物有限公司合成，引物代号和序列分别为：

overlap-1:GCAGGAACAATTACCAGGTACG(SexAI)

overlap-2:GTGGTCGGTAGTTCCCTGT

overlap-3:ACAGGGAACTACCGACCAC

overlap-4:CGGCCCATGGTGCCATAAGC(NcoI)

方框内部为突变碱基，两个突变碱基分别为G→A突变和T→C突变，突变碱基用方框表示。Overlap-1引物和Overlap-4引物内部分别含有SexAI和NcoI位点。

2.2 overlap PCR扩增

采用Pfu高保真DNA聚合酶(Takara，大连)，以overlap-1引物和overlap-2引物扩增0.7kb的A片段，overlap-3引物和overlap-4引物扩增0.9kb的B片段。A、B扩增片段经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，分别采用凝胶回收试剂盒(天根生物科技有限公司)切胶回收目的片段。

回收的A、B产物各取1μl混合后作为第二步PCR扩增反应的模板。以overlap-1和overlap-4为上下游引物。反应体系为：10×buffer 5μl，上下游引物各1μl，模板1μl，dNTP 4μl，pfu高保真DNA聚合酶0.5μl，超纯水补至50μl体系。反应程序设定为：95℃,2min变性；然后执行94℃，30s；53℃，30s，72℃，1min,40s，共25个循环；72℃延伸5min结束。预期扩增片段为1.6kb。

反应结束后，将50μl PCR反应产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收目的片段。目的片段用SexAI和NcoI双酶切，酒精沉淀酶切片段后，用20μl超纯水溶解。

2.3 突变位点导入pLH质粒

考虑到SexAI位点对甲基化质粒不能切开，故将pLH质粒转入HST04宿主菌(Takara,日本)以消除质粒甲基化。然后用SexAI和NcoI双酶切，电泳分离线性化片段，然后切胶回收6.4kb片段。将回收的1.6kb突变片段与6.4kb片段连接，连接产物转入DH5α感受态细胞，涂布LB平板。采用HindIII酶切消化质粒的方法来鉴定阳性的突变插入克隆，并进一步选用自带引物送商业化公司进行测序，确保在突变位点正确引入的同时，其它位点未发生改变。阳性克隆命名为pLHΔ。

3.pLHΔ质粒的转染拯救

3.1.pLHΔ质粒的纯化

挑取pLHΔ克隆单个菌落，接种于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中，37℃震荡培养16～24h。采用Qiagen公司的Miniprep试剂盒纯化质粒，具体操作按照其说明书进行。采用Nanodrop 2000核酸测定仪，检测质粒纯度，确保OD260/280在1.8-2.0之间。

3.2.质粒-转染试剂混合物的配制

转染混合物的配制参照Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行。质粒和转染试剂的比例按照1:2.5(μg:μL)进行。吸取16μg质粒溶液至1个灭菌的指形管中，用opti-DMEM培养液(Invitrogen)稀释至1ml；另一个离心管内加入40μl Lipofectamine 2000转染试剂，加入960μl opti-DMEM培养液混匀。将稀释后的质粒和转染试剂静置5min后，轻柔混匀，室温静置20min后即可进行转染。

3.3.转染鹅胚

上述配制好的转染试剂，经绒毛尿囊膜途径接种8个11日龄鹅胚，每只鹅胚接种0.25ml,其中包含2.0μg质粒。石蜡封口后放入孵化箱内孵育，每隔8h照胚一次，弃去24小时内死亡鹅胚。收集72h死亡鹅胚的尿囊液，检查胚体病变。结果表明，pLHΔ质粒通过绒毛尿囊膜途径转染11日龄鹅胚，鹅胚在接种后第5天开始死亡，至转染后第8天，死亡率达到75％。实验结果表明，绒毛尿囊膜途径转染质粒适合感染性GPV的拯救，死亡鹅胚胚体呈现典型的GPV感染的特征性变化，表现为胚体出血和绒毛尿囊膜水肿增厚。

3.4 拯救病毒的传代

将拯救出的第1代病毒尿囊液用氯仿抽提1次，用DNA酶I(Promega，美国)于37℃作用30min,以降解残存的质粒DNA，再用PBS缓冲液做1：5稀释后接种11日龄鹅胚。

3.5拯救病毒与亲本病毒的区分

通过PCR方法，可以扩增出覆盖遗传标记位点的约1.6kb片段，该片段不能为HindIII所切开，而以亲本病毒提取的DNA为模板扩增出的1.6kb片段，用HindIII酶切，产生0.9-kb和0.7-kb的两条片段(图5)。试验结果确切的表明拯救病毒来自于质粒转染拯救所产生，而不可能是亲本病毒或野毒污染的结果。对拯救病毒的序列分析也表明，除了作为遗传标记引入的2个突变碱基，其它部分序列与亲本序列完全一致。

4.拯救病毒的生物学特性

4.1 病毒滴度(ELD₅₀)的测定

将新收集的含拯救病毒或亲本病毒的尿囊液稀释成10^-3、10^-4、10^-5和10^-6四个稀释度，通过尿囊腔接种途径接种12日龄鹅胚。每只鹅胚接种0.2ml，每个稀释度接种5个鹅胚。37℃孵化箱中继续孵育，弃去24h内死亡鹅胚，连续观察10天，统计每组鹅胚死亡个数，用Reed-Muench方法计算病毒滴度。试验结果表明：拯救病毒的ELD₅₀达到每毫升5×10^4.77,与亲本LH株极为相似，后者的ELD₅₀为每毫升5×10^4.36。

4.2 病毒中和实验

200ELD₅₀的拯救病毒和亲本病毒LH株与等体积的经10倍稀释的GPV阳性血清混合，37℃温箱孵育30min，通过尿囊腔途径各接种5个12日龄鹅胚。对照组则以病毒液与GPV阴性血清混合。抗GPV阳性血清是以GPV疫苗株SYG61v免疫鹅群方法制备获得。中和试验结果表明，用GPV抗血清作用后的拯救病毒和亲本病毒接种的5个鹅胚无一死亡，而用生理盐水处理的对照组中鹅胚全部在84-120小时之间死亡，这表明拯救病毒拥有与亲本病毒相一致的抗原性。

4.3 雏鹅攻毒实验

将48只1日龄易感雏鹅随机分成3组。第1组的16只雏鹅颈部皮下注射0.3ml含3×10⁴ELD₅₀的拯救病毒；第2组的16只雏鹅颈部皮下注射等量的LH株亲本病毒；第3组16只雏鹅注射灭菌生理盐水作为阴性对照组。三组雏鹅分别在单独的房间隔离饲养15d，记录死亡个数和死亡时间，所有死亡雏鹅均剖解观察病理变化，计算在不同时间点的死亡率和存活率。

结果表明，两种1日龄雏鹅分别接种了携带遗传标记的拯救病毒和亲本病毒，在15天的观察期内，接种亲本病毒组雏鹅在第3天开始出现死亡，而拯救病毒组在攻毒后第4天出现死亡。到攻毒后的第9天，两组雏鹅死亡率都达到了93.8％(图6)。而接种生理盐水的对照组雏鹅均生长健康无一死亡。拯救病毒攻毒组死亡雏鹅同样展现出“小鹅瘟”特征性病变，包括典型的肠栓形成、肠粘膜脱落等病理变化(图7a)。

4.4 病料中核酸检测

取攻毒死亡雏鹅肝脏或肠道组织进行PCR检测。将肝脏或肠道组织剪碎，加适量PBS研磨，移入1.5ml离心管中，10000rpm离心10min。上清转移到新的离心管中，加入等量氯仿抽提1次，10000rpm离心10min。上层水相转移到另一离心管中，沸水中水浴10min，12000rpm离心5min，吸取上清用作扩增模板。用overlap PCR中的overlap-1和overlap-4作为检测引物，扩增片段为1.6kb。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，观察扩增条带大小，切胶回收目的片段。用HindIII进行酶切或PCR产物直接测序方法来确定死亡雏鹅是死于拯救病毒或是亲本病毒。

结果表明，从肝脏、肠道组织提取病毒核酸作为DNA模板，能够扩增出包含遗传标记位点在内的1.6kb的特异片段，这些扩增片段均不能为HindIII所切开。对PCR产物的直接测序也证实在HindIII位点处均存在2个预设的碱基突变(图7b)，这充分说明在拯救病毒攻毒组中，死亡雏鹅确实源于拯救的感染所致，可以排出攻毒试验期间，雏鹅感染亲本病毒或其它GPV野毒的可能。当前的试验结果表明，拯救病毒拥有与亲本LH病毒株相似的毒力。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 一种鹅细小病毒感染性克隆的拯救方法

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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<211> 21

<212> DNA

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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<210> 5

<211> 5047

<212> DNA

<213> 鹅细小病毒LH株

<400> 5

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gcaactctac tacaatggaa catagaatac cgttagagga gcgtatgttt caaatcgtcc 1860

tatcacataa attggagcct tcttttggaa aaatttctaa aaaagaagtc agagaatttt 1920

tcaaatgggc caatgataat ctagttcctg ttgtgtctga gttcaaagtc cgaacgaatg 1980

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caatgag 5047