家蝇酚氧化酶原激活酶1基因及其重组蛋白与应用的制作方法

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本发明涉及一种家蝇酚氧化酶原激活酶1（mdpap1）基因及其表达的重组蛋白与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术：

家蝇同其他昆虫一样，缺乏获得性免疫，对入侵病原的防御完全依靠先天免疫。昆虫的先天免疫包括细胞免疫和体液免疫两部分。酚氧化酶原激活系统(prophenoloxidase-activatedsystem，propo系统）是昆虫重要的体液免疫成分，该系统的激活是一个丝氨酸蛋白酶级联反应：上游的丝氨酸蛋白酶水解下游酶的酶原，活化的酶再去激活下一个酶的酶原，最终由酚氧化酶原激活酶（propo-activatingenzyme，pap）直接把酚氧化酶原（prophenoloxidase，propo）激活为酚氧化酶（phenoloxidases，po），从而对病原入侵做出最快速的免疫应答，不仅影响昆虫的黑色素合成，还影响其发育与寿命，并与昆虫抗菌肽的产生有关，在昆虫的病原识别与防御中起重要作用。

获得家蝇酚氧化酶原激活酶1（mdpap1）基因及其重组蛋白，对查明家蝇propo系统的激活机制及家蝇propo系统激活在病原防御中的功能有重要意义，有助于加深认识家蝇乃至一系列病媒昆虫的独特免疫机制，还有助于发现抵御病原感染的药物靶标，对有效防治家蝇及其相关的传染性疾病、保障人民生命财产安全具有重要的战略意义。

目前，几个昆虫pap的激活机制已经报道，其中，研究较为清楚的有三种：第一种是家蚕pap，仅1种，它直接裂解propo为活性的po；第二种是烟草天蛾pap，有3种，它们本身不能有效激活propo，必需丝氨酸蛋白酶同系物（serpineproteasehomologue，sph）的参与；第三种是东北大黑鳃金龟pap，也有3种，其中1种作用类似sph，另1种直接裂解propo，但产生的po无活性，只有三种pap同时作用，将propo二次裂解，才产生有活性的po。但是，至今未见家蝇酚氧化酶原激活酶基因克隆的报道，也没有该类基因重组表达与功能研究的报道。

技术实现要素：

针对目前缺少家蝇酚氧化酶原激活酶基因克隆、重组表达与功能研究的现状，我们通过家蝇转录组测序与序列分析，首先发现了3个可能的家蝇酚氧化酶原激活酶基因，名为mdpap1、mdpap2与mdpap3[dianxiangli，yongliliang,xianweiwang,leiwang,meiqi,yangyu,yuanyuanluan.transcriptomicanalysisofmuscadomesticatorevealkeygenesoftheprophenoloxidase-activatingsystem.g3(bethesda).2015;5(9):1827-1841.(sci)]。

本发明利用家蝇转录组测序获得的unigene序列，设计引物，克隆并获得了家蝇mdpap1基因全长cdna的核苷酸序列与其编码蛋白的氨基酸序列，明确了其保守结构域（发夹区clip+胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶tryp_spc）与功能位点，如酶原裂解激活位点、底物结合位点与催化位点。

本发明还依据mdpap1基因开发阅读框（orf）的核苷酸序列，设计引物，扩增出了编码该基因保守结构域的cdna片段，构建了重组表达载体。通过转化与筛选，获得了高表达mdpap1重组蛋白的大肠杆菌菌株。随后优化表达条件与变性及复性包涵体，纯化出了mdpap1重组蛋白，建立了可溶性家蝇mdpap1重组蛋白生产的方法。经酶活性检测，制备的mdpap1重组蛋白具有激活家蝇血淋巴mdpropo成mdpo的活性。经rnai实验证明：家蝇mdpap1基因被干扰后，会明显促进家蝇死亡。由此说明，家蝇mdpap1基因及其重组表达产物在激活剂、氧化剂、灭蝇剂、黑化剂和免疫剂等相关产品的研发方面有应用价值。

本发明的目的是克隆家蝇酚氧化酶原激活酶1（mdpap1）全基因cdna序列，进行重组表达与应用研究。下面是酚氧化酶原激活酶1（mdpap1）基因cdna的核苷酸序列，所示信息见seqidno.1。

cgcatcattgatgaatctcagtttagtagaattttaaaacccgtctgttgaggatcgttg60

ttttttgtactgccgcatgatcgcccgtccatctgttggagtataactaagaagagtttt120

aattttttatttctgtgtttcaatatgaaatattctaaagcactgcctttaatcgctgtc180

attctggcagcgttttgtatacagtgctcagtagctaaagcaaatcaaccctgccggaat240

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aatgaaaaaggtttccactgtggtgcagctctcatcagcaaacgttatgtcataacggcg600

gcacattgtgtaaccggtgcaggtatccccgccgattggcgcccaactggcattcgtcta660

ggcgaatgggatcgcaacaccaatcccgactgtgaacgtcttatcaatgaccaatatgac720

tgtgccgatccttacatagatgttgccattgaaaagatcactgcccatcccatgtacaga780

tctaacgacaagaatcatctgtacgatattgccctgattcgtttgagtcgaaacattgaa840

tataccgatttcgttagtcctgtatgtttgcccgttcagcaagaattgcgttcgcggacc900

tttgaagctctcaaattggatgtgactggtttcggcaccaccgaggacagccgtagcagt960

gatttgaagttgaaggcaggcgttgatgcttggaatcttgaagattgtcgtcgcaagtac1020

tcaccaaaaggtgtgttccttgacaactcacagatgtgcgccggcggtgtggagggtgtt1080

gattcgtgtcgtggtgattccggtggaccattggtcattaaacagcgtgttgaaaatcgt1140

gatgtttatgttttggccggtgttgtgtcattcggaccgactccatgtggtttgccaggt1200

tggcctggggtctatacccgtgttggagcctatgtcgattggatttcgaataacttagaa1260

ccctaaatataagatactcttgtgtgcaacgaatttttttaatacattttgaataaaact1320

ttttgtatcgccctacatttcaaaaaaaaaaaaaaaaa1358；

seqidno.1显示，家蝇酚氧化酶原激活酶1（mdpap1）基因cdna全长1358bp，经http://au.expasy.org/tools/dna.html软件分析，该基因包含一个长1122bp的完整开放阅读框（orf），144bp的5’端非编码区和92bp的3’端非编码区。还有一个3’端加尾信号“aataaa”，位于poly(a)尾巴上游24bp处。

本发明所述的家蝇酚氧化酶原激活酶1（mdpap1）基因orf所编码蛋白的氨基酸序列见seqidno.2，其所示信息为：

(a)序列特征：

*长度：373氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：家蝇（muscadomestica）

(f)序列描述：seqidno.2

metlystyrserlysalaleuproleuilealavalileleualaalaphecysilegln20

cysservalalalysalaasnglnprocysargasnproasnasnglualaglythrcys40

valserleuleuglucysproproleuleuasnleuleulysasnvalglyargthrgln60

alagluthrmetpheleuglnhisserglncysasptyrvalglyserthrvaltyrval80

cyscysvalleuglnserglyserargpheleulysalagluleuprothrthrargglu100

cysglylysserpheaspasnargileleuglyglyasnvalthrargileaspglutyr120

protrpvalalaleuileglutyrthrlyspropheasnglulysglyphehiscysgly140

alaalaleuileserlysargtyrvalilethralaalahiscysvalthrglyalagly160

ileproalaasptrpargprothrglyileargleuglyglutrpaspargasnthrasn180

proaspcysgluargleuileasnaspglntyraspcysalaaspprotyrileaspval200

alaileglulysilethralahispromettyrargserasnasplysasnhisleutyr220

aspilealaleuileargleuserargasnileglutyrthraspphevalserproval240

cysleuprovalglnglngluleuargserargthrpheglualaleulysleuaspval260

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asnserglnmetcysalaglyglyvalgluglyvalaspsercysargglyaspsergly320

glyproleuvalilelysglnargvalgluasnargaspvaltyrvalleualaglyval340

valserpheglyprothrprocysglyleuproglytrpproglyvaltyrthrargval360

glyalatyrvalasptrpileserasnasnleuglupro373

seqidno.2的orf编码的酚氧化酶原激活酶1蛋白具有373个氨基酸，包括一个信号肽（氨基酸1-26），一个发夹区（氨基酸30-83），一个tryp_spc酶蛋白结构域(氨基酸108-367)，发夹区与tryp_spc酶蛋白结构域之间有一个连接区（氨基酸84-107）。编码的该蛋白是个酶原，其裂解激活位点在i¹⁰⁹处，激活酶蛋白的催化位点是h¹⁵⁴-d²²¹-s³¹⁹，底物结合位点是d³¹³-s³⁴²-g³⁴⁴。经http://ca.expasy.org/tools/computepi/mw软件分析，该酚氧化酶原激活酶1蛋白分子量与等电点分别为pi/mw:6.25/41267.08da，而其中的tryp_spc酶蛋白的pi/mw:5.65/28954.8da。

本发明的家蝇酚氧化酶原激活酶1（mdpap1）基因cdna的克隆方法是：通过家蝇转录组测序和序列分析，获得家蝇酚氧化酶原激活酶1（mdpap1）基因的unigene序列，依此设计特异引物3’端扩增-f，与3’anchorr匹配扩增基因的3‘端（引物序列见表1）。扩增模板是用常规方法提取e.coli和s.aureus混菌刺激的家蝇幼虫总rna反转录的cdna。常规pcr扩增，胶回收扩增产物，连pmd-19-t载体，转化dh5α感受态细胞，经蓝白斑筛选阳性转化子，摇菌、提质粒，再行pcr验证正确后，送公司测序，将测得的3‘端序列与unigene拼接、复合成基因cdna全长。

表1.基因克隆与表达用的引物

本发明的家蝇酚氧化酶原激活酶1（mdpap1）基因在制备具有激活与免疫活性重组蛋白中的应用。

一是通过基因重组技术使该基因在大肠杆菌、酵母和病毒中表达，获得具有激活家蝇酚氧化酶原（mdpropo）活性的重组蛋白mdpap1（图1，2）。二是通过rnai技术，证明家蝇mdpap1基因具有免疫活性（图3）。三是通过酶活性实验，证明mdpap1重组蛋白具有激活mdpropo的活性（图4）。

利用本发明的方法获得的家蝇酚氧化酶原激活酶1基因及其重组蛋白可用于激活剂、氧化剂、灭蝇剂、黑化剂和免疫剂等相关产品的开发。

附图说明

图1为家蝇酚氧化酶原激活酶1重组蛋白诱导表达

其中，泳道1诱导前，泳道2-7依次是诱导后1，2，3，4，5，6小时，泳道8分子量标记。随着iptg诱导时间的增加，mdpap1重组蛋白表达量在诱导后1-6小时内不断增加，到5小时达到最大；

图2为家蝇酚氧化酶原激活酶1重组蛋白的纯化：泳道1分子量标记，泳道2复性后的mdpap1重组蛋白，泳道3诱导后细胞破碎后的上清液，泳道4诱导后细胞破碎后的沉淀；

图3为家蝇酚氧化酶原激活酶1基因干扰后家蝇血淋巴po活性检测结果三种不同家蝇血淋巴：正常家蝇血淋巴，注射mdpap1基因dsrna家蝇幼虫血淋巴，注射depc处理水家蝇幼虫血淋巴；

图4为mdpap1重组蛋白激活家蝇血淋巴mdpropo的po活性检测结果

其中，正常家蝇血淋巴有少量po活性，正常家蝇血淋巴+加菌样品的po活性有少量提高，正常家蝇血淋巴+菌+mdpap1重组蛋白样品的po活性有较大提高。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

家蝇酚氧化酶原激活酶1（mdpap1）基因克隆

主要步骤包括：

（1）总rna的提取：常规方法提取家蝇总rna；

（2）cdna第一链合成：利用smartf、oligoanchorr作为反转录的引物，先配成12μl体系:

；

混合均匀，瞬时离心；70℃水浴5min，冰浴2min，向12μl体系中继续加入其他组分：

；

轻轻混匀，瞬时离心；37℃水浴5min。加1μl反转录酶supermoⅲm-mlv(200u/ml)，至终体积20μl；轻轻混匀，瞬时离心；50℃水浴60min。70℃水浴5min，冰浴2min，终止第一链cdna合成；

（3）pcr反应：依据测序获得unigene序列，设计特异引物：3’端扩增-f与3’anchorr；以3’端扩增-f作为正向引物，3’anchorr作为反向引物的25μlpcr反应液配制方案：

；

混匀以上pcr反应液，置于pcr仪上，pcr反应条件：94℃2min，进入以下循环：94℃30sec；55℃，30sec；72℃，80sec；重复30次后，72℃延伸10min；

（4）pcr产物纯化：pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，切出目标带，按胶回收试剂盒（上海生工）说明书进行纯化；

（5）mdpap1基因cdna克隆：将纯化产物连入t载体pmd-19-t，构建重组质粒；

；

混匀反应液，16℃过夜连接；转化感受态细胞dh5α，在含100µg/ml氨苄青霉素、0.2µg/mlx-gal、0.1mol/mliptglb平板上37℃过夜培养；从转化板上挑取白色克隆，经pcr检测阳性后，接种于含有100mg/ml氨苄青霉素的5mllb试管中，37℃，250rpm过夜振荡培养，10000rpm离心菌液3min，留细胞，用微量dna提取试剂盒提取质粒，测序，将所得序列与基因库序列比较，确定扩增的该基因的3‘端序列正确；

将扩增的该基因的3‘端序列与unigene序列拼接一起，就获得了seqidno.1所示mdpap1基因全长cdna的核苷酸序列；

所述unigene序列的核苷酸序列如下：