一种辣椒疫病抗性果实侵染鉴定方法与流程

本发明涉及植物植物病害侵染
技术领域：
，特别涉及一种辣椒疫病抗性果实侵染鉴定方法。
背景技术：
：辣椒(capsicumannuuml.)，原产于中拉丁美洲热带地区的墨西哥。15世纪末，哥伦布发现美洲之后把辣椒带回欧洲，并由此传播到世界其他地方。辣椒于明代传入我国，如今在我国各地普遍栽培，成为一种大众化蔬菜。辣椒在栽培过程中，病虫害种类繁多，危害严重。其中，辣椒疫病在我国的发生危害日益严重，已成为影响辣椒生产的主要病害之一。该病由辣椒疫霉菌(phytophthoracapsici)引起，是以孢子囊在土壤、田间病残体上越冬，以孢子囊萌发产生游动孢子侵染根部引起病害。该病害发病周期短，流行速度快，常导致辣椒植株成片死亡，给辣椒产业带来严重的经济损失。一般病株率为20-30％，严重时达80％以上。目前，抗病品种的选育和推广是控制辣椒疫病的主要手段。而较为常用的辣椒疫病的接种方法主要是采用离体叶片接种和游动孢子液灌根接种。虽然这两种接种方法均可以将辣椒对疫霉菌的反应区分开，但是这两种方法却都有着自身无法克服的缺点，比如：离体叶片接种法由于叶片面积相差较大，因此在接种量一样的情况下，根据病斑面积进行比较就无法反映出品种的抗性，同时离体叶片法不适宜进行量化，因而不好分级，只能进行初步的鉴定；游动孢子液灌根接种法基本上模拟田间病害的发生过程，最能反映品种的真实抗性，但是需要培养孢子，较麻烦，尤其是当鉴定的品种数量较多的时候，需要大量的孢子，工作量很大，操作较复杂。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种辣椒疫病抗性果实侵染鉴定方法，从而克服现有技术的上述缺陷。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：一种辣椒疫病抗性果实侵染鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)辣椒果准备：选取不同类型的辣椒品种进行种植，采收健康完整的辣椒果备用；(2)菌种的选择：将在室内低温保存的辣椒疫霉病菌菌种接种在燕麦固体培养基上进行培养，在25℃-28℃下恒温暗培养3天至白色菌丝充分生长繁殖布满整个培养基表面，继续培养4天，然后在25℃-28℃恒温下光/暗交替培养7天至产生孢子囊，再切割菌饼备用；(3)辣椒果接种：将步骤(1)的辣椒果用灭菌水冲洗干净，用酒精冲洗灭菌，然后用吸水纸拭去表面的水分，在铁盘内垫上双层滤纸，将辣椒果放在上面，用灭菌刀片在果上切去直径7mm表皮，将小菌饼有菌丝的一面紧贴在伤口上，温度控制在30℃，光照16h后，25℃黑暗培养8h，采用保鲜膜覆盖在铁盘上面保湿，促使病害的发生；(4)病情调查与评价：接种3天后，调查每个接种点发病情况，按分级标准进行病情级数调查，并计算出每个辣椒果的病情指数：辣椒果接种法调查标准分五级：0级—无病；1级—果面上出现水浸状病斑，病斑直径≤2厘米；2级—果面上出现水浸状病斑，病斑直径2-4厘米；3级—果面上的水浸状病斑已严重变软，果表皮与果肉分离，病斑直径≥4厘米；4级—果面上的水浸状病斑已完全或几乎覆盖果表面；病情指数＝∑(各级病果数×相对级值)/(调查总果数×最高级值)×100；抗病性划分标准：抗病(r)病情指数≤15；中抗(mr)15<病情指数≤30；中感(mr)30<病情指数≤50；感病(s)病情指数>50。优选地，上述技术方案中，所述步骤(1)的辣椒品种的种植包括：将辣椒苗播种前进行种子消毒处理，用52-55℃的温水浸种30min，1％硫酸铜溶液浸泡5min，然后用清水冲洗干净，再浸种催芽后播种。优选地，上述技术方案中，所述步骤(2)的燕麦培养基的制作方法为：将燕麦片20g，水1000ml，煮沸30min，双层纱布过滤去渣，上清液补足水至1000ml，加入琼脂20g，煮沸待琼脂溶化后分装，121℃下高压灭菌20min，无菌条件下分装于无菌培养皿中。优选地，上述技术方案中，所述步骤(2)切割菌饼为边长5mm的菌饼。优选地，上述技术方案中，所述辣椒果是指青果期的辣椒果实。本发明上述技术方案，具有如下有益效果：(1)该方法优势在于发病时间短，在侵染部位首先发病，伤口的存在为侵染提供了便利，缩短发病时间，3天就发病，5天感病品种大部分腐烂变软。(2)对病菌的需求量小，一个培养皿内的菌丝可以接种40个果左右，解决了大量培养菌的耗时耗力问题。(3)可以量化，可以测量病斑的长度，根据病斑扩展的速度即可区别品种间的抗性差异，对抗性进行量化，能有效区分抗感疫病品种。(4)对大量品种筛选有利，辣椒果接种鉴定疫病方法快速简洁，操作简单，大量筛选品种，有利于抗病品种的筛选，可为育种工作提供有效依据。(5)可保存辣椒原有植株：采用这种方法，只取辣椒果实，对植株无任何损伤，可对植株进行其它实验或取种，即使是感病品种，也能对其抗疫病的性状进行鉴定，又不影响品种资源的保存，从田间采集辣椒果进行室内鉴定，能够在短时间内检测多个品种，并且对植株的生长无影响，特别适合于对种质资源稀少的品种进行抗疫病鉴定。(6)本方法在辣椒青果期都可以进行试验，青果期2个月，试验周期耗时短，试验时间充足。附图说明图1为本发明的辣椒果接种法示意图。图2为本发明的辣椒果接种法调查标准图。图3为本发明的染病辣椒果的内部图。图4为本发明的不同辣椒品种接种疫霉菌后发病图。图5为本发明的重复鉴定不同辣椒品种接种疫霉菌后发病图。具体实施方式下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。实施例1一、试验方法：一种辣椒疫病抗性果实侵染鉴定方法，该方法按如下步骤进行：(1)辣椒果准备：1)品种的选择：选取不同类型的辣椒品种，包括：灯笼椒，线椒，牛角椒，羊角椒，拇指椒，圆球形椒等多个类型的183个品种。上述品种通过商业途径或科研途径(引进于种子资源库)获得，但是本发明并不局限于上述品种。2)辣椒种植：辣椒苗播种前进行种子消毒处理，用52-55℃的温水浸种30min，1％硫酸铜溶液浸泡5min，然后用清水冲洗干净，再浸种催芽后播种。按照常规的土肥水管理及病虫害控制措施培育和管理辣椒，期间不使用任何药剂。(2)菌种的选择：将在室内低温保存的辣椒疫霉菌菌种(由山东农业大学植物保护学院提供)接种在燕麦固体培养基(oma培养基)上进行培养，在25℃-28℃下恒温暗培养3天至白色菌丝充分生长繁殖布满整个培养基表面，继续培养4天，然后在25℃-28℃恒温下光/暗交替培养7天至产生孢子囊，再切割为边长5mm的菌饼备用。oma培养基配方：燕麦20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。oma培养基制作过程：燕麦片20g，水1000ml，煮沸30min，双层纱布过滤去渣，上清液补足水至1000ml，加入琼脂20g，煮沸待琼脂溶化后分装。121℃下高压灭菌20min。前期实验表明：pda培养基培养疫霉菌不产孢子，而且菌丝生长速度不如oma培养基，因此本发明选择oma培养基。本发明的菌饼优选为5mm菌饼，当然，也可选择7mm等其他大小的菌饼。(3)辣椒果接种：选取健康完整且无病的青果期辣椒果，用灭菌水冲洗干净，再用酒精冲洗灭菌，然后用吸水纸拭去表面的水分。在铁盘内垫上双层滤纸，将辣椒果放在上面，用灭菌刀片在果上切去直径约7mm表皮，将菌饼有菌丝的一面紧贴在伤口上，温度控制在30℃，光照16h后，25℃黑暗培养8h，采用保鲜膜覆盖在铁盘上面保湿，促使病害的发生，重复3次(如图1所示)。(4)病情调查与评价：接种3天后，调查每个接种点发病情况，记录病斑扩展直径或长度、果实状况，按以下分级标准进行病情级数调查，并计算出每个辣椒果的病情指数：辣椒果接种法调查标准分五级：0级—无病；1级—果面上出现水浸状病斑，病斑直径≤2厘米；2级—果面上出现水浸状病斑，病斑直径2-4厘米；3级—果面上的水浸状病斑已严重变软，果表皮与果肉分离，病斑直径≥4厘米；4级—果面上的水浸状病斑已完全或几乎覆盖果表面。病情指数＝∑(各级病果数×相对级值)/(调查总果数×最高级值)×100抗病性划分标准：抗病(r)病情指数≤15；中抗(mr)15<病情指数≤30；中感(mr)30<病情指数≤50；感病(s)病情指数>50。(5)第二年重复试验一次，方法同上。二、试验结果(1)果接种后的发病情况接种后3天后就有少数几份品种发病，就大多数品种为表现出发病症状，第5天时全部品种都表现出发病症状，但也有辣椒果未有发病。发病初期，疫霉菌从切口处开始扩散，果内先生长少量菌丝，果外才表现水浸状病斑，当果内生长大量菌丝，果外水浸状病斑迅速扩展，果实剖面呈褐色，病果果肉松软，直至果皮和果肉分离，彻底腐烂，菌丝在伤口处或果柄处外露(如图3所示)。上述方法可以很好的区分抗病和感病品种。各品种对辣椒疫霉菌的反应不一样，抗病品种在切口处无病斑，或在切口周围变褐，病斑向外略有扩展即被遏制，病斑扩展缓慢，而感病品种则在切口处形成水浸状褐色病斑，病斑向外扩展，造成果肉和果皮分离，直至整个果腐烂(如图2所示)。该方法选取辣椒果作为鉴定对象具有一致性。辣椒果作为试验材料，病斑虽有分级，但绝大部分位于一个抗病调查标准，总体表现比较均一。说明辣椒果用于抗病鉴定材料是具有稳定表现的(如图5所示)。(2)抗病分级供试品种在侵染处理后，表现不同程度的发病状况，不同品种的抗病性呈现明显不同(如图4所示)。采用果接种法鉴定了183份辣椒品种的抗病性，上述品种选自全国各地，包括灯笼椒，线椒，牛角椒，羊角椒，拇指椒，圆球形椒等多种类型。最终获得23个抗病品种、22个中抗品种、21个中感品种、117个感病品种(如表1所示)。表1本发明的抗病鉴定品种及抗性分级选取其中8个品种进行重复鉴定，根据病情指数与抗病性的关系，可以判断b16-57、b16-131为中抗品种，b16-145为中感品种，b16-32、b16-140、b16-142、b16-162、b16-166为感病品种(如图5和表2所示)。表2本发明不同辣椒品种材料抗疫病鉴定结果品种代号病情指数(％)抗性b16-5719.7mrb16-13122.7mrb16-14255.3sb16-16277.3sb16-140100.0sb16-14545.0mrb6-16672.5sb16-32100.0s第二年重复上述试验一次，参照第一年的试验方法进行调查分析，其结果与第一年的抗性结果一致。这说明，采用本试验的方法可以将不同辣椒品种进行很好的抗性划分，实验结果重复性高，结果稳定，并与田间观察的各个辣椒品种的实际抗性水平一致。三、结论本发明基于辣椒果对疫病抗性稳定一致性，每个品种选取三个果作为试材，可以初步筛选辣椒品种。初步筛选后可以选取感兴趣的材料进一步大量接种，采取辣椒果鉴定方法或其它鉴定方法。这样的初步鉴定既快速又简便，省时省力的鉴定大量品种(如图4所示)。本发明采用辣椒果实接种法，表明了果侵染法对不同类型辣椒品种都可以实现侵染，能够较好的区分抗、感个体，为抗性个体筛选奠定了基础。本实验重复三次，结果重现性好。本发明的侵染方法，其优势在于发病时间短，在侵染部位首先发病，伤口的存在为侵染提供了便利，缩短发病时间，3天就发病，5天感病品种大部分腐烂变软。本发明采用菌饼接种，这种方式对病菌的需求量小，一个培养皿内的菌丝可以接种40个果左右，解决了大量培养菌的耗时耗力问题。本发明的方法，可以量化、可以测量病斑的长度，根据病斑扩展的速度可区别品种间的抗性差异，对抗性进行量化，能有效区分抗感疫病品种。同时，对大量品种筛选有利，辣椒果接种鉴定疫病方法快速简洁，操作简单，大量筛选品种，有利于抗病品种的筛选，可为育种工作提供有效依据。再者，本发明的侵染方法以离体果实为研究对象，这样可保存辣椒原有植株，对辣椒植株无任何损伤，可对植株进行其它实验或取种。即使是感病品种，也能对其抗疫病的性状进行鉴定，又不影响品种资源的保存。从田间采集辣椒果进行室内鉴定，能够在短时间内检测多个品种，并且对植株的生长无影响，在对种质资源稀少的品种进行抗疫病鉴定方面有优势。再者，本发明在辣椒青果期都可以进行试验(青果期2个月内任何阶段均可试验)，试验周期耗时又短，试验时间充足。虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。当前第1页12