一种用于护肤品的蚕丝素低聚肽制备方法与流程

本发明涉及一种蚕丝蛋白的制备方法，具体涉及一种用于护肤品的蚕丝素低聚肽制备方法，属于生物高分子材料技术领域。

背景技术：

蚕丝是高分子动物蛋白(丝素蛋白)，富含18种氨基酸，具有保湿、透气、抗菌、防静电、防紫外线等优良特性。早在明代，李时珍在其医学巨著《本草纲目》中就记载了蚕丝的美容护肤作用。随着科技的进步与发展，人们对蚕丝蛋白的认识越来越深入，蚕丝新用途的研究与开发受到人们的高度关注。

天然蚕丝素蛋白分子量较大，约350000da(道尔顿)，以纤维状存在，不适合直接用于护肤品或化妆品的原料。目前常规的方法，是将生丝原料(蚕茧或废丝)通过精炼除胶后置于溴化锂、硝酸镁和氯化钙之类的高浓度溶解性盐中加热溶解，然后进行过滤和透析脱盐等处理过程，使得丝纤维的结晶结构受到破坏，成为丝蛋白水溶液。所得的丝素蛋白分子量在100000da以上，而且重金属含量较高，直接用于护肤品原料，一方面丝素蛋白分子量较大，肌肤的吸收效率低，影响美容护肤效果；另一方面，由于重金属含量较高影响到产品的使用安全，如中国专利cn201510071886.3公开的“一种家蚕丝素蛋白溶液制备及鉴定方法”，中国专利cn201410352789.7公开了的“一种阳离子化丝素蛋白及其制备方法”等。

有报道利用蛋白酶水解蚕丝蛋白，主要有碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等对蚕丝蛋白进行酶解，如，徐莹、何国庆“bacillussp.el31410产弹性蛋白水解丝素蛋白特性的研究”(食品与发酵工业，2008，6:28-29)报道，弹性蛋白酶水解丝素蛋白的最适作用温度是45-55℃，最适ph是9.0，水解产物的相对分子质量主要在1000d以上，以大分子的多肽物质为主，技术工艺要求高，流程复杂，可控程度低。代君君等“木瓜蛋白酶的降解作用研究”(北方蚕业，2015，09：11-13)表明ph8-9、温度60-70℃，木瓜蛋白酶的活性为20-25u时丝素蛋白水解效果较好，酶的作用时间越长效果越好，但所得产物为混合物，有氨基酸、小肽、多肽及部分大分子蛋白质。张桂征等“一株放线菌对丝素纤维的降解作用”(蚕业科学，2007，33:241-245)，培养42d时，丝素纤维已完全降解，所得产物以小分子的氨基酸为主，寡肽含量比例在10％以下。研究表明，小分子或氨基酸类物质有利于胃肠道的吸收，低聚肽(分子量800-500da)分子有利于肌肤的吸收。为开发蚕丝美容护肤品，蚕丝低聚肽制备技术尤为关键。

技术实现要素：

解决的技术问题：针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于护肤品的蚕丝素低聚肽制备方法，运用碱性蛋白酶和放线菌酶双酶解，并结合膜分离技术，通过严格控制用酶量和酶解条件制备蚕丝素低聚肽。

技术方案：本发明提供的用于护肤品的蚕丝素低聚肽制备方法，包括以下制备步骤：

(1)脱胶：取蚕茧用0.5-0.8％na2co3溶液浸渍脱胶30-40min，然后用清水洗涤，重复浸渍、清洗2-3遍，自然晾干或烘干，得到脱胶蚕丝，所述蚕茧与na2co3溶液的固液质量比为1:200，；

(2)盐解：将步骤(1)所得脱胶蚕丝放入50-60％cacl2的溶液中加热至沸腾后溶解20-30min，冷却后离心20-30min，得到盐解液，所述脱胶蚕丝与cacl2溶液的固液质量比为1:20；

(3)透析：将步骤(2)所得盐解液用截留分子量15000-10000da的透析袋流水透析2-3天，得到低分子量丝素溶液；

(4)双酶解：按固液质量比(100-110):1将复合酶与步骤(3)所得低分子量丝素溶液混合，在ph8-8.5下酶解60-70min，得到丝素酶解液，所述复合酶是由碱性蛋白酶和放线菌酶按质量比碱性蛋白酶:放线菌酶＝(2.0-2.5):1混合而成；

(5)再透析：将步骤(4)所得丝素酶解液用截留分子量1500-300da的透析袋流水透析2-3天，获得低分子量丝素酶解液；

(6)膜分离：对步骤(5)所得低分子量丝素酶解液进行浓缩，用双蒸水进行梯度洗脱，然后用膜分离柱进行分离、收集组分，即获得分子量在800-500da的蚕丝素低聚肽溶液；

(7)将步骤(6)所得蚕丝素低聚肽溶液经-80℃冷冻干燥，得到蚕丝素低聚肽粉。

步骤(1)所述烘干温度为60-70℃。步骤(2)所述离心转速为3500-4000r/min。步骤(4)所述碱性蛋白酶与放线菌酶的活力单位均为10000u。步骤(6)所述膜分离柱为葡聚糖凝胶层析柱sephadexg-15。

有益效果：(1)提取物产出率高，1g蚕丝可以提取0.513g蚕丝素低聚肽粉末。

(2)丝素低聚肽分子量集中，93％以上集中在800-500da之间。

(3)丝素低聚肽生物学活性高，易被肌肤吸收，体现出良好的保湿、抗菌、抗氧化、抗紫外损伤等功能。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图；

图2为脱胶蚕丝电子显微镜扫描图；

图3为双酶解蚕丝电子显微镜扫描图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式对本发明进行进一步说明，但本发明的保护范围并不因此局限于下述实施例，而是由本发明的说明书和权利要求书限定。

实施例1

一种用于护肤品的蚕丝素低聚肽制备方法，制备步骤如下：

(1)脱胶：将蚕茧剪成1～2cm²，用0.5-0.8％na2co3溶液浸渍脱胶30min，固液质量比为1:200，然后用清水洗涤，重复浸渍、清洗2-3遍，自然晾干或60℃烘干，得到脱胶蚕丝；

(2)盐解：将步骤(1)所得脱胶蚕丝放入50-60％cacl2的溶液中加热至沸腾后溶解20min，固液质量比为1:20，冷却后以转速3500r/min离心20min，得到盐解液；

(3)透析：将步骤(2)所得盐解液用截留分子量15000-10000da的透析袋流水透析2-3天，得到低分子量丝素溶液；

(4)双酶解：按固液质量比100:1将复合酶与步骤(3)所得低分子量丝素溶液混合，在ph8-8.5下酶解60min，得到丝素酶解液，所述复合酶是由碱性蛋白酶和放线菌酶按质量比2:1混合而成，碱性蛋白酶与放线菌酶的活力单位均为10000u；

(5)再透析：将步骤(4)所得丝素酶解液用截留分子量1500-300da的透析袋流水透析2-3天，获得低分子量丝素酶解液；

(6)膜分离：对步骤(5)所得低分子量丝素酶解液进行浓缩，用双蒸水进行梯度洗脱，然后用葡聚糖凝胶层析柱sephadexg-15进行分离、收集组分，即获得分子量在800-500da的蚕丝素低聚肽溶液；

(7)将步骤(6)所得蚕丝素低聚肽溶液经-80℃冷冻干燥，得到蚕丝素低聚肽粉。

实施例2

一种用于护肤品的蚕丝素低聚肽制备方法，制备步骤如下：

(1)脱胶：将蚕茧剪成1～2cm²，用0.5-0.8％na2co3溶液浸渍脱胶35min，固液质量比为1:200，然后用清水洗涤，重复浸渍、清洗2-3遍，自然晾干或65℃烘干，得到脱胶蚕丝；

(2)盐解：将步骤(1)所得脱胶蚕丝放入50-60％cacl2的溶液中加热至沸腾后溶解25min，固液质量比为1:20，冷却后以转速3800r/min离心25min，得到盐解液；

(3)透析：将步骤(2)所得盐解液用截留分子量15000-10000da的透析袋流水透析2-3天，得到低分子量丝素溶液；

(4)双酶解：按固液质量比105:1将复合酶与步骤(3)所得低分子量丝素溶液混合，在ph8-8.5下酶解65min，得到丝素酶解液，所述复合酶是由碱性蛋白酶和放线菌酶按质量比2:1混合而成，碱性蛋白酶与放线菌酶的活力单位均为10000u；

(5)再透析：将步骤(4)所得丝素酶解液用截留分子量1500-300da的透析袋流水透析2-3天，获得低分子量丝素酶解液；

(6)膜分离：对步骤(5)所得低分子量丝素酶解液进行浓缩，用双蒸水进行梯度洗脱，然后用葡聚糖凝胶层析柱sephadexg-15进行分离、收集组分，即获得分子量在800-500da的蚕丝素低聚肽溶液；

(7)将步骤(6)所得蚕丝素低聚肽溶液经-80℃冷冻干燥，得到蚕丝素低聚肽粉。

实施例3

一种用于护肤品的蚕丝素低聚肽制备方法，制备步骤如下：

(1)脱胶：将蚕茧剪成1～2cm²，用0.5-0.8％na2co3溶液浸渍脱胶40min，固液质量比为1:200，然后用清水洗涤，重复浸渍、清洗2-3遍，自然晾干或70℃烘干，得到脱胶蚕丝；

(2)盐解：将步骤(1)所得脱胶蚕丝放入50-60％cacl2的溶液中加热至沸腾后溶解30min，固液质量比为1:20，冷却后以转速4000r/min离心30min，得到盐解液；

(3)透析：将步骤(2)所得盐解液用截留分子量15000-10000da的透析袋流水透析2-3天，得到低分子量丝素溶液；

(4)双酶解：按固液质量比110:1将复合酶与步骤(3)所得低分子量丝素溶液混合，在ph8-8.5下酶解70min，得到丝素酶解液，所述复合酶是由碱性蛋白酶和放线菌酶按质量比2.5:1混合而成，碱性蛋白酶与放线菌酶的活力单位均为10000u；

(5)再透析：将步骤(4)所得丝素酶解液用截留分子量1500-300da的透析袋流水透析2-3天，获得低分子量丝素酶解液；

(6)膜分离：对步骤(5)所得低分子量丝素酶解液进行浓缩，用双蒸水进行梯度洗脱，然后用葡聚糖凝胶层析柱sephadexg-15进行分离、收集组分，即获得分子量在800-500da的蚕丝素低聚肽溶液；

(7)将步骤(6)所得蚕丝素低聚肽溶液经-80℃冷冻干燥，得到蚕丝素低聚肽粉。

实施例中蚕丝素低聚肽的分子量分布的测定方法采用高效凝胶过滤色谱法，测试结果表明本发明提供的蚕丝素低聚肽的相对分子质量主要集中在800-500da，低聚肽含量超过93％。

实施例1获得的蚕丝素低聚肽经sem电镜扫描；图2为脱胶后蚕丝的电镜扫描结果，蚕丝结构完整，分子量大；图3为脱胶蚕丝经双酶解处理后的蚕丝结构，蚕丝被分解成细碎的颗粒状，大小相对均匀。