本发明涉及的是一种生物材料领域的技术，具体是一种类节肢蚕丝蛋白嵌段共聚物及其水凝胶的制备方法。
背景技术
水凝胶可定义为在水中能够溶胀并保持大量水分而又不能被溶解的交联聚合物，其亲水，质地柔软但能保持一定形状的特性以及良好的生物相容性、可降解性使其具有应用于体内生理环境的条件，因此被广泛应用于药物和基因运输，组织工程等研究领域，是一种具有极大应用价值的生物材料形式。研究者利用刺激响应性蛋白聚合物开发出了具有刺激响应性的智能型水凝胶，它能够感知外界环境(如温度、ph、光，电等)微小的变化或刺激，并能产生相应的物理结构和生化性质变化的一类聚合物。刺激响应性聚合物形成的水凝胶在生物医药和生物技术应用方面有极大潜能，在药物释放和在组织工程中的应用可以有效控制水凝胶在体内的形成与解聚，避免引入外来的引发剂对细胞造成毒害作用。同时刺激响应性水凝胶还能满足材料智能化的要求，多刺激响应性水凝胶能够用于信息处理及传感器方面的研究。
技术实现要素：
本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种类节肢蚕丝蛋白嵌段共聚物及其水凝胶的制备方法，类节肢弹性蛋白和类蚕丝蛋白的氨基酸序列设计和优化对应的核苷酸序列，利用首尾相连的方法构建融合蛋白，在大肠杆菌中实现表达和生产，最终利用其温度、光及氧化还原等刺激响应性制备形成的水凝胶不仅具有多肽类水凝胶的生物相容性、可降解性、细胞毒性低等优势，同时兼具温度、光和氧化还原刺激响应性以及可调的力学性能，这将为该种水凝胶在组织工程，药物传输等医学工程中的应用提供更好的选择。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明通过构建类节肢蚕丝蛋白基因单体rxsy的表达载体，并将其导入表达宿主细胞中，得到目标蛋白，再利用温度刺激、光刺激或温度和氧化还原的组合刺激制备得到水凝胶。
所述的类节肢蚕丝蛋白基因单体rxsy包括：节肢弹性蛋白结构域(r)和蚕丝蛋白结构域(s)的数目分别用x和y来表示：当x＝1时，1≤y≤10；当y＝1时，1≤x≤10；1≤z≤20，其中x，y，z都为整数。
所述的类节肢蚕丝蛋白基因单体中，类节肢弹性蛋白结构域的氨基酸序列，如seqidno.1所示，即：5’-(ggrpsdsygapgggn)x-3’，n’-resilinx-c’，来源于文献ardelldh，andersenso.insectbiochemistryandmolecularbiology，2001，31(10)：965-970。
所述的类节肢蚕丝蛋白基因单体中，类蚕丝蛋白的氨基酸序列，如seqidno.2所示，即：n’-(gagags)y-c’，来源于文献f.lucas，j.t.shaw，s.g.smith.biochem.j.66(1957)468–479。
所述的构建是指：通过将人工设计的类节肢蚕丝蛋白基因单体rxsy无缝的连接到pma-rq载体上，将其转化到dh5α宿主中进行质粒扩增，提取质粒后使用限制性内切酶对其进行酶切，利用连接酶使通过酶切得到的目的基因片段自连接，从而得到含有不同的单体重复数目的融合蛋白基因片段(rxsy)z；然后使用连接酶将基因片段分别连接到pet-19b3载体上，测序验证通过后进一步将其转化到生产宿主bl21(de3)中。
所述的限制性内切酶为banii，蛋白基因单体两侧修饰的酶切位点为banii。
所述的t4dna连接酶为t4dna连接酶。
所述的人工设计的类节肢蚕丝蛋白基因单体rxsy包括：resilin人工设计的核苷酸序列以及silk人工设计的核苷酸序列。
所述的resilin人工设计的核苷酸序列如seqidno.3所示，即：
5’-ggcggtcgtccttcagatagttatggtgctccaggcggtggtaacggtggtcgtccttctgattcatacggcgcaccgggtggtggcaatggtggtcgccctagtgatagttatggcgcacctggcggcggtaatggtggccgcccttctgatagttacggtgcaccaggtggtggcaac-3’。
所述的silk人工设计的核苷酸序列如seqidno.4所示，即：
5’-ggagcaggtgcaggtagtggcgcaggagccggttcaggagcaggtgccggtagtggtgccggtgctggatcaggagcgggtgcaggaagtggcgcaggtgctggctctggagccggtgcgggtagtggcgcaggagccggttcaggagcaggtgccggctcaggtgcaggcgcgggctct-3’。
所述的温度刺激是指：将20％(v/w)的类节肢蚕丝蛋白放置下37℃条件下6小时及以上，可以形成透明的水凝胶。
所述的光刺激是指：向20％(v/w)的类节肢蚕丝蛋白溶液中加入2mm的氯化三(2,2'-联吡啶)钌(ii)六水合物和10mm的过硫酸铵，混匀以后，用功率为200w的白光照射20-30s，即可形成水凝胶。
所述的温度和氧化还原的组合刺激是指：向20％(v/w)的类节肢蚕丝蛋白溶液中加入20mm的过硫酸铵，置于45℃及以上温度条件下，即可形成水凝胶。
本发明涉及制备得到的水凝胶，其孔径致密，弹性模量范围为100～104pa。
附图说明
图1为(r4s4)5的sds-page图及其特征；
图中：箭头指示处为目标条带；
图2为将(r4s4)5蛋白置于37℃条件下随时间变化的倒置实验；
图3为(r4s4)5蛋白放置在37℃条件下4、8和12个小时所形成的水凝胶的扫描电子显微镜的形貌图；
图4为流变学实验(时间扫描)；
图中图中g’为弹性模量，g”为损耗模量；
图5为利用光刺激使(r4s4)5蛋白形成水凝胶；
图6为对在4℃、37℃和70℃条件下利用光刺激所形成的水凝胶进行流变学实验(频率扫描)；图中g’为弹性模量，g”为损耗模量；
图7为利用氧化还原刺激使(r4s4)5蛋白形成水凝胶的倒置实验。
具体实施方式
实施例1
本实施例通过构建目标蛋白的表达载体，并将该表达载体导入大肠杆菌中实现表达生产。
本实施例具体操作包括：利用限制性内切酶和连接酶，构建产生了(rxsy)z的表达载体。然后，将不同载体分别转化进入表达宿主细胞中，将该菌株在含氨苄青霉素(0.1mg/ml)的4mllb培养基中37℃培养至od600为1.8～2.0时，以1％的接种量转入含氨苄青霉素的100mllb培养基中37℃培养；当od600为3.0～4.0时，将其全部转入含氨苄青霉素的800ml的tb培养基中37℃培养；当od600为6.0～8.0时，加入1mm的iptg16℃诱导12～16h后收菌。
本实施例上述操作中涉及到的菌株、质粒、酶、抗生素和培养基分别为：克隆宿主escherichia.colidh5，表达宿主escherichia.colibl21(de3)；表达质粒pet-19b3；banii限制性内切酶，t4dna连接酶；氨苄青霉素；lb培养基，tb培养基。
所述的lb培养基的成分包括：10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母粉和10g/l氯化钠。
所述的tb培养基的成分包括：12g/l胰蛋白胨、24g/l酵母粉、5g/l甘油及10％(v/v)tb盐溶液。
所述的tb盐溶液是指：23.1g/l磷酸二氢钾和125.4g/l磷酸氢二钾组成的混合溶液。
实施例2
本实施例中，按照1g的湿菌体对应10ml低浓度缓冲液的比例重悬实施例1中得到的菌体；高压破碎后12000rpm离心得到上清，上清经0.45μm的滤膜过滤后上样于填充了ni-sepharose的柱子上。用中浓度缓冲液洗去非特异性结合的蛋白后，再用高浓度缓冲液洗脱目标蛋白。以截流量为3kda的浓缩管将目标蛋白浓缩到20～50mg/ml，将浓缩后的蛋白溶液放入-80℃的冰箱中12个小时。
将滤出液跑还原条件下的sds-page(如图1所示)。图中红色箭头指示的条带为(r4s4)5重组蛋白的主条带。
所述的低浓度缓冲液是指：含有20mmtris.hcl、150mmnacl和5mm咪唑的水溶液。
所述的中浓度缓冲液是指：含有20mmtris.hcl、150mmnacl和50mm咪唑的水溶液。
所述的高浓度缓冲液是指：含有20mmtris.hcl、150mmnacl和250mm咪唑的水溶液。
实施例3
本实施例是利用温度刺激对类节肢蚕丝蛋白(r4s4)5进行水凝胶的制备。
本实施例构建产生了(r4s4)5的表达载体，并通过实施例1和实施例2中的方法最终得到冻干的(r4s4)5蛋白，将其溶于去离子水中至终浓度为200mg/ml。将200ul该蛋白溶液装至小玻璃瓶中，然后放置在37℃条件下，监测其0到12个小时的成胶情况。再将新成的水凝胶冷冻干燥，并利用扫描电子显微镜观察水凝胶的表面特征。
结果发现，将类节肢弹性蛋白(r4s4)5放置在37℃条件下6个小时以上，都可以使其形成水凝胶，同时利用流变学实验对该蛋白成胶时间进行验证。(见图2-4)
实施例4
本实施例是利用光刺激对类节肢蚕丝蛋白(r4s4)5进行水凝胶的制备。
本实施例将实施例3中得到的类节肢蚕丝蛋白(r4s4)5溶于去离子水中，然后加入光引发剂氯化三(2,2'-联吡啶)钌(ii)六水合物和过硫酸铵并进行混合。混匀后，在室温下用功率为200w的白光对混合溶液照射20-30s，即可形成水凝胶，同时利用流变学实验对在不同温度下所形成的水凝胶进行力学性能的测试。(见图5-6)
所述的混合溶液中各组分浓度为：类节肢蚕丝蛋白(r4s4)5的浓度为200mg/ml，氯化三(2,2'-联吡啶)钌(ii)的浓度为2mm，过硫酸铵的浓度为10mm。
实施例5
本实施例是利用温度和氧化还原刺激对类节肢蚕丝蛋白(r4s4)5进行水凝胶的制备。
本实施例将实施例3中得到的类节肢蚕丝蛋白(r4s4)5溶于去离子水中，然后加入氧化剂过硫酸铵并进行混合。混匀后，将混合溶液分装至小玻璃管中并放置在不同的温度条件下检测其成胶情况。结果显示加入氧化剂过硫酸铵的类节肢蚕丝蛋白(r4s4)5在45℃及以上温度可以形成水凝胶。(见图7)
所述的混合溶液中各组分的浓度为：类节肢蚕丝蛋白的浓度为200mg/ml，过硫酸铵的浓度为20mm。
上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。
序列表
<110>上海交通大学
<120>类节肢蚕丝蛋白嵌段共聚物及其水凝胶的制备方法
<160>4
<170>patentinversion3.5.1
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