本发明涉及一种活性多肽，具体涉及一种从杂色蛤软体酶解物中分离得到的具有抑制二肽基肽酶-4(DPP-4)活性的多肽，属于生物医药技术领域。
背景技术：
二肽基肽酶-4(Dipeptidyl peptidase-4,DPP-4)是一种丝氨酸蛋白酶，能迅速裂解和失活肠促胰岛素、神经肽和细胞因子。DPP-4可特异性切断GLP-1肽链N端2位上的丙氨酸或脯氨酸残基，从而使GLP-1失活。GLP-1(胰高血糖素样肽-1)是一种重要的肠促胰岛素，除能促进胰岛素分泌及抑制胰高血糖素分泌外，还具有增加饱腻感、减缓胃排空时间、抑制胰岛β细胞凋亡和促进β细胞增殖等作用。由于可被DPP-4迅速降解，GLP-1的体内半衰期极短(小于2min)，若能抑制DPP-4活性则可有效延长GLP-1的作用时间，从而有利于降低血糖水平，具有治疗高血糖的作用。
现代研究表明，活性肽与蛋白质及单一氨基酸相比，具有更强的生物活性和营养价值。活性肽专属性强、生物活性高、毒副作用小，易被消化吸收，具有多种功能，作为预防和治疗疾病的医药产品进行研究有着巨大的开发潜力。而食源性的DPP-4抑制剂控制高血糖起效快、作用强、安全性高，目前己经在临床治疗糖尿病中发挥了重要的作用。
杂色蛤(Ruditapesphilippinarum)是广泛分布于江苏沿海的一种重要双壳经济贝类。传统中医理论认为其贝壳和软体部份均可入药，蛤蜊肉咸、冷、无毒，归胃、肝、膀胱经，宋代《嘉祐本草》中关于蛤蜊有记载：“润五脏，止消渴，开胃，解酒毒。主老癖能为寒热者，及妇人血块，宜煮食之”。
技术实现要素：
发明目的：本发明的目的是在杂色蛤现有研究的基础之上，通过大量实验筛选，采用现代生化技术手段，对杂色蛤中的抑制DPP-4的活性成分进行跟踪评价，通过酶解、乙醇沉淀、离子交换色谱、反相高效液相色谱法等纯化方法制备得到一种DPP-4抑制肽，该抑制肽具有很好的抑制DPP-4的作用，具有很好的降糖的功效。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
一种具有抑制二肽基肽酶-4的活性肽，该抑制肽具有下述的氨基酸序列：Ala-Gly-Phe-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-Pro-Arg-Ala。
本发明所述的具有抑制二肽基肽酶-4的活性肽的制备方法，其包括以下步骤：
(1)杂色蛤酶解物的制备：
将杂色蛤软体洗净泥沙，加水煎煮，分离煎煮液与肉渣，沥干；取肉渣，加水匀浆后，加入生物酶酶解，酶解结束后,于沸水浴灭活，然后加入无水乙醇进行醇沉，静置，再取上清液，浓缩，冷冻干燥，得到冻干粉；
(2)离子交换色谱纯化：
取步骤(1)酶解得到的冻干粉以去离子水溶解后，经过离子交换色谱分离，流动相：A相为水，B相为0.8mol/L的氯化钠溶液，梯度洗脱，流速：2mL/min；检测波长：220nm；经过离子交换色谱分离得到不同组分的酶解物，分别测定各组分对二肽基肽酶-4的抑制活性，取活性最好的部分，冷冻干燥，得冻干粉；
(3)反向色谱分离纯化：
取步骤(2)分离后的冻干粉以甲醇溶解，经过反相高效液相色谱分离，流动相：A相为体积浓度0.1％甲酸；B相为甲醇，梯度洗脱，流速：10mL/min；柱温：30℃，检测波长为220nm，分离收集到氨基酸序列为Ala-Gly-Phe-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-Pro-Arg-Ala的具有抑制二肽基肽酶-4的活性肽。
作为优选方案，以上所述的具有抑制二肽基肽酶-4的活性肽的制备方法，步骤(1)所述的酶为木瓜蛋白酶，所述木瓜蛋白酶活性为5000至50000U/g。
作为优选方案，以上所述的具有抑制二肽基肽酶-4的活性肽的制备方法，步骤(1)酶的加入重量为肉渣重量的0.01％-10％，酶解的温度为37至50℃，酶解的pH为7至9，酶解反应时间为2至6h。
作为优选方案，以上所述的具有抑制二肽基肽酶-4的活性肽的制备方法，步骤(1)所述的酶的加入重量为肉渣重量的0.1～10％，酶解的温度为40～60℃，酶解的pH为6～9，酶解反应时间为1～5h。
作为优选方案，以上所述的具有抑制二肽基肽酶-4的活性肽的制备方法，步骤(1)所述的酶的加入重量为肉渣重量的1％，酶解的温度为55℃，酶解的pH为7，酶解反应时间为4h。
作为优选方案，以上所述的具有抑制二肽基肽酶-4的活性肽的制备方法，步骤(2)梯度洗脱条件为：0～40min内0.8mol/L氯化钠溶液体积比为0％，40～140min内0.8mol/L氯化钠溶液体积比为0％～100％。
作为优选方案，以上所述的具有抑制二肽基肽酶-4的活性肽的制备方法，步骤(3)所述的梯度洗脱程序为：0～10min，B相甲醇比例由2％至10％，10～20min，B相甲醇比例由20％至40％，20～25min B相甲醇体积由40％至100％。
作为优选方案，以上所述的具有抑制二肽基肽酶-4的活性肽的制备方法，步骤(1)将杂色蛤软体洗净泥沙，加入3至8倍量水煎煮1至3次，每次30～120分钟，分离煎煮液与肉渣，沥干；取肉渣，加3至8倍量水匀浆后，加入生物酶进行酶解。
本发明所述的D具有抑制二肽基肽酶-4的活性肽在制备降糖药物中的应用，可以用于糖尿病的防治。
酶解工艺的筛选实验：
1、酶解温度考察：取杂色蛤软体肉渣称重，加3倍量水匀浆，分别加入木瓜蛋白酶，加酶量为肉渣量的1％，以pH 7，酶解反应时间4h的条件下，考察温度因素对酶解产物DPP-4抑制活性影响实验，分别考察40℃、45℃、50℃、55℃和60℃酶解得到的杂色蛤酶解物对DPP-4的抑制率，结果见表1。结果表明，55℃条件下的杂色蛤酶解产物DPP-4抑制活性最佳。
表1 温度对木瓜蛋白酶酶解杂色蛤酶解物抑制DPP-4活性的影响
2、酶解pH值的考察：取杂色蛤软体肉渣称重，加3倍量水匀浆，分别加入木瓜蛋白酶，加酶量为肉渣重量的1％，以温度45℃，酶解2h条件下，考察酶解反应pH对酶解产物抑制DPP-4活性的影响实验，考察的pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0时，酶解得到的杂色蛤酶解物对DPP-4的抑制活性，结果见表2。结果表明，pH 7.0时，杂色蛤酶解产物DPP-4抑制活性最佳。
表2 pH对木瓜蛋白酶酶解杂色蛤酶解物抑制DPP-4活性的影响
3、木瓜蛋白酶加入量的考察：取杂色蛤软体肉渣称重，加3倍量水匀浆，分别加入木瓜蛋白酶，在pH＝7.0、温度55℃条件下酶解2h，考察加酶量对酶解产物DPP-4抑制活性的影响实验，考察酶-底物比(酶-底物比按加酶量占肉渣重量的百分比计)分别为0.1％、0.25％、0.5％、1％和1.5％时酶解得到的杂色蛤酶解物抑制DPP-4活性，结果见表3，加酶量1％时，杂色蛤酶解产物DPP-4抑制活性最佳。
表3 加酶量对木瓜蛋白酶酶解杂色蛤酶解物抑制DPP-4活性的影响
4、酶解时间考察：取杂色蛤软体肉渣称重，加3倍量水匀浆，各取适量匀浆液加入木瓜蛋白酶，加酶量为肉渣重量的1％，在pH 7，温度55℃下，考察酶解反应时间对酶解产物抑制DPP-4活性的影响实验，分别考察1.0h、2.0h、3.0h、4.0h和5.0h酶解得到的杂色蛤酶解物的抑制DPP-4活性，结果见表4，结果表明，酶解时间4.0小时，得到的酶解物DPP-4抑制活性最强。
表4 不同酶解时间对木瓜蛋白酶酶解杂色蛤酶解物抑制DPP-4活性的影响
经过活性跟踪评价验证结果表明，采用木瓜蛋白酶作为水解酶，并且加入量为杂色蛤肉渣重量的1.0％，酶解的温度为55℃，酶解的pH为7.0，酶解反应时间为4h时，具有最佳的酶解效果，可以将具有二肽基肽酶-4抑制活性的多肽分解出来，有利于后续进一步纯化得到活性肽，具有很好的技术效果。
有益效果：本发明提供的具有抑制二肽基肽酶-4的活性肽和现有技术相比具有以下优点：
本发明通过大量试验对杂色蛤中具有抑制二肽基肽酶-4活性的多肽成分进行跟踪筛选，通过优选工艺的酶解离子交换树脂和反相高效液相色谱等分离纯化方法，获得具有很好的抑制二肽基肽酶-4活性的多肽。并且本发明对活性多肽进行氨基酸序列分析，确定氨基酸序列为Ala-Gly-Phe-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-Pro-Arg-Ala。本发明工艺设计合理，可操作性强，为低值贝类开发新的临床用途，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明提供的具有抑制二肽基肽酶-4的活性肽的质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1
具有抑制二肽基肽酶-4的活性肽的制备方法，其包括以下步骤：
(1)杂色蛤酶解物的制备：
将杂色蛤软体洗净泥沙，加入3倍量水煎煮2次，每次40分钟，分离煎煮液与肉渣，沥干；取肉渣，加3倍量水匀浆后，加入酶活性为50000U/g的木瓜蛋白酶酶解，木瓜蛋白酶的加入重量为肉渣重量的1％，酶解的温度为55℃，酶解的pH为7，酶解反应时间为4h；酶解结束后,于沸水浴灭活，然后加入一定量的无水乙醇进行醇沉，最终形成60％的醇溶液，并在4℃下静置24小时，再取上清液，浓缩，冷冻干燥，得到冻干粉；
(2)离子交换色谱纯化：
取步骤(1)酶解得到的冻干粉以去离子水溶解后，通过AKTA 900FPLC系统进行离子交换分离纯化，流动相为：A相：水，B相：0.8mol/L的氯化钠溶液；洗脱条件为：0.8mol/L氯化钠溶液0％(0～40min)，0.8mol/L氯化钠溶液0％～100％(40～140min)；流速：2mL/min；检测波长：220nm。酶解物被分离成不同组分，按实施例4方法分别测定各组分DPP-4抑制活性，取活性最好的部分，冷冻干燥，得冻干粉。
(3)反相色谱分离纯化：
取步骤(2)分离后的冻干粉以甲醇溶解，经过反相高效液相色谱分离，流动相为：A相：0.1％甲酸；B相：甲醇，洗脱程序为：B相甲醇体积由2％至10％(0～10min)，B相甲醇体积由20％至40％(10～20min)，B相甲醇体积由40％至100％(20～25min)；流速：10mL/min；柱温：30℃，检测波长为220nm，分离、收集到，然后进行冷冻干燥，得到二肽基肽酶-4的抑制肽。
实施例2 二肽基肽酶-4抑制肽的序列分析
取实施例1制备得到的二肽基肽酶-4的抑制肽，采用nano-LC-ESI-MS/MS分析多肽的氨基酸序列，质谱条件为：ESI源，扫描方式：正离子模式，质量扫描范围：50～1000m/z；分析得到二肽基肽酶-4的抑制肽的分子量为975.44Da，质谱检测图如图1所示，测定得到其氨基酸序列为：Ala-Gly-Phe-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-Pro-Arg-Ala。
实施例3 二肽基肽酶-4抑制肽的合成
根据实施例2获得的氨基酸序列，采用固相合成的方法，合成二肽基肽酶-4抑制肽Ala-Gly-Phe-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-Pro-Arg-Ala，合成后的多肽通过HPLC分析纯度为99％，质谱测定分子量为975.44Da,与纯化多肽分子量一致，二级质谱碎片与纯化多肽碎片一致。
实施例4 二肽基肽酶-4抑制肽活性测试
本发明采用比色法测定二肽基肽酶-4抑制肽的活性，具体步骤如下：取实施例1和实施例3分别制备得到的抑制肽溶于Tris-HCI缓冲液(含20mmol/L Tris,pH 8.0,0.1mol/L NaCl，1mmol/L EDTA)制成相应的样品液。二肽基肽酶-4(DPP-4)、Gly-Pro-PNA分别用Tris-HCl缓冲液(含20mmol/L Tris,pH 8.0,0.1mol/L NaCl，1mmol/L EDTA)配置成8U/L的DPP-4溶液和1.6mmol/L的Gly-Pro-PNA(底物)溶液。将25μL样品与25μL底物混匀，37℃孵育10min,再加入50μL DPP-4溶液，在37℃孵育1小时，后加入1mol/L醋酸钠缓冲液(PH 4.0)100μL,405nm处测定吸光度值(A)，并计算抑制率。同时用Tris-HCI缓冲液代替样品做空白对照。
DPP-4抑制率(％)＝[(A阴性对照-A空白对照)-(A样品-A样品空白)]/(A阴性对照-A空白对照)×100％
式中：A为吸光度值。
测定得到本发明实施例1和实施例3制备得到的二肽基肽酶-4抑制肽的体外抑制IC50均为20.75μM，和现有技术相比取得了很好的预料不到的技术效果。
本发明从杂色蛤中提取纯化制备得到具有二肽基肽酶-4抑制活性的多肽，具有很好的降血糖活性，并且安全性能高，具有广阔的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京中医药大学
<120> 具有抑制二肽基肽酶-4的活性肽及其制备方法与应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg
1 5 10
Ala
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