一种产纳豆激酶贝莱斯芽孢杆菌菌株及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种新的纳豆激酶生产菌株，还涉及一种纳豆激酶生产菌株菌株在制备纳豆中的应用，本发明所述的莱斯芽孢杆菌具备高产纳豆激酶的能力，可用于纳豆的生产。

背景技术：

血栓疾病重影响着人类的健康，据统计，全世界每年至少有1200万患者因血栓性疾病而死亡，中国约有260万。因此溶栓抗栓药物的开发一直是关乎人类健康的热点。目前临床上常用的溶栓抗栓药物有链激酶(streptokinase，sk)、尿激酶(urokinase，uk)和组织型纤溶酶原激活剂(typeplasminogenactivator，t-pa)，但这些药物存在给药痛苦、副作用大、价格昂贵、半衰期短等缺点，相比之下，纳豆激酶(nattokinase，nk)已被证明具有高效的溶栓作用，不仅可以直接降低纤维蛋白原，而且可以促进催化血纤维蛋白溶酶原转化为血纤维蛋白溶酶，增加体内血栓溶解因子的合成。并且纳豆激酶具有可口服、安全、廉价和纤溶性强等优势，成为近年来溶栓类产品的研究热点。

纳豆食品虽具有很好的营养和保健功能，但因纳豆其特有的风味并不易被我国人民所接受，这不利于人们通过饮食去摄入纳豆激酶来降低血栓疾病发病率。由于毛霉发酵的豆豉不仅味美醇香、营养丰富，而且具有多种保健功能，是我国人民喜爱的佐餐调味佳品。目前生产中采用纯毛霉接种制曲制备的发酵豆豉因培养时间过短，产品中氨基酸态氮的含量较低，易导致货架期产品出现老化变硬，影响产品的风味。因此，纳豆食品的开发必须同时从产品感官和发酵活性上进行，才能达到最佳的效果。筛选高活性的纳豆激酶生产菌株，改善纳豆口感以及制备富含多种功能成分的纳豆食品，是今后纳豆激酶产品发展的关键。

目前，已研究报道的产纳豆激酶芽孢杆菌较多，主要有枯草芽孢杆菌bacillussubtilies、和解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens等，而芽孢杆菌bacillusvelezensis是2005年发现的芽孢杆菌新种，随后被确定为解淀粉芽孢杆菌的后期异型体，其中文名为贝莱斯芽孢杆菌。作为一种新型细菌，有关它的研究也日益增多，但更多的是将该菌的研究重心放在了植物病害生物防治中。直到现在国内外的研究中，还均未发现将贝莱斯芽孢杆菌用于纳豆激酶的生产上。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种贝莱斯芽孢杆菌sn-14，该菌株具备高产纳豆激酶的特点，可用于纳豆激酶保健品的生产。

本发明还有一个目的在于提供了一种贝莱斯芽孢杆菌sn-14在制备纳豆中的应用，利用该菌株发酵黄豆，提高了纳豆产品中纳豆激酶的含量，并改善了纳豆的口感。

本发明的技术方案为：一种产纳豆激酶贝莱斯芽孢杆菌菌株，该菌株为贝莱斯芽孢杆菌sn-14。

该菌株已送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)sn-14，保藏编号：cctccm2017135，保藏日期：2017年3月20日，地址：中国武汉市武汉大学。

所述的贝莱斯芽孢杆菌sn-14，其细胞形态为杆状，革兰氏染色呈阳性，产芽孢，芽孢椭圆形，中生或近中生。

一种贝莱斯芽孢杆菌sn-14，其筛选过程如下：

(1)利用初筛培养基分离豆豉里面的芽孢杆菌，经形态学鉴定，初步确定为芽孢杆菌。

初筛培养基：3-10g/l酪素，1-5g/l葡萄糖，1-5g/l酵母膏，1-5g/lk2hpo4，0.5-2.5g/lkh2po4，0.1-0.5g/lmgso4，ph7.0～7.2。

(2)再次利用固体发酵复筛，进行感官鉴评和测定纤溶活力，选择感官鉴评优和纤溶活力高的菌株。

复筛培养基：固体培养基为黄豆洗净，与水以m：v＝1:3-5常温下浸泡10-12h，沥干于121℃灭菌20min。

(3)最后应用纳豆激酶的pcr扩增，高效快速筛选到一株纳豆激酶生产菌株sn-14，并对该菌株进行了生理生化鉴定和16srrna的分子鉴定。该菌株已送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)sn-14，保藏编号：cctccm2017135。

(4)一种贝莱斯芽孢杆菌菌株在制备纳豆中的应用，其应用步骤为：将筛选得到的芽孢菌菌株转接到lb斜面培养基上37℃活化18-28h，用接种环挑选2-5环的菌苔接种到液体种子培养基中，于37℃，180r/min的条件下培养16-18h处于对数生长期，然后以4％的接种量接种到灭菌的黄豆培养基上，在37℃培养36-48h，后熟24h即可。测得纳豆激酶的活力达到6583.2-8215.7iu/g(湿黄豆)。

所述的液体种子培养基：10-15g/l葡糖糖，5-10g/l酵母提取物，10-15g/l牛肉膏，5-10g/lnacl，ph7.4～7.6。

本发明的有益效果：

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明的贝莱斯芽孢杆菌sn-14来源于贵州本土豆豉，菌株的安全性高；

(2)本发明的贝莱斯芽孢杆菌sn-14，获得的纳豆产品口感优良；

(3)本发明贝莱斯芽孢杆菌sn-14产纳豆激酶的活力较高，是研究和开发纳豆激酶产品的首要条件。因此该枯草芽孢杆菌在改善食品口感，提高发酵活性，并丰富纳豆保健品的功效上有很好的应用前景。

附图说明

图1为一种贝莱斯芽孢杆菌sn-14在初筛培养基上的菌落形态示意图；

图2为一种贝莱斯芽孢杆菌sn-14在lb培养基上的菌落形态示意图；

图3为一种贝莱斯芽孢杆菌sn-14在琼脂糖-纤维蛋白原上的活力示意图；

图4为一种贝莱斯芽孢杆菌sn-14在固体发酵上的产物示意图；

图5为一种贝莱斯芽孢杆菌sn-14在油镜下观察的菌种形态图；

图6为mega5.05用邻近法基于16srrna基因序列构建的系统进化树；

显示分离株属于bacillusvelezensis属。bootstrap为1000，表示经过1000次数值分析；

图下标尺表示每100个碱基序列中有一个碱基替换；

图7为尿激酶活力的对数值与溶解圈面积呈线性关系示意图。

具体实施方式

实施例1：

一种贝莱斯芽孢杆菌sn-14，其筛选过程如下：

(1)初筛

从贵州省的遵义豆豉、贵阳豆豉、大方臭豆腐、铜仁豆豉、毕节臭豆腐、安顺豆豉和青岩豆腐等地的9种样品各取2g置于100ml的已灭菌的具塞三角瓶中，加无菌生理盐水稀释10倍，振荡30s后，于37℃，180r/min的条件下培养24h。将菌悬液置于80～85℃的水浴锅中加热10min，冷却后的菌悬液分别做梯度稀释，各取0.1ml涂布于酪蛋白平板上，37℃倒置培养24h，挑取水解圈与菌落直径比值(c/h的值)较大的菌落进行革兰氏染色及镜检，参照常见细菌系统手册中关于芽孢杆菌属的形态描述进行镜检初筛，并接种到lb平板上进行划线分离纯化，将获得的单一菌株接种到lb斜面培养上，37℃培养24h，于4℃冰箱保存备用。经初筛培养基初筛，筛选出70株疑是产纳豆激酶高活性的菌株。

初筛培养基为5g/l酪素，1g/l葡萄糖，1g/l酵母膏，1g/lk2hpo4，0.5g/lkh2po4，0.1g/lmgso4，ph7.0～7.2。

(2)复筛

通过黄豆固体发酵复筛和纤溶活性的分析，筛选出15株活性较高的菌株。

复筛培养基：固体培养基为黄豆洗净，与水以m：v＝1:3常温下浸泡10-12h，沥干于121℃灭菌20min。

(3)纳豆激酶的pcr扩增法

将菌株sn-14活化，转接于lb液体培养基中，180r/min、37℃震荡培养18h后，用细菌dna试剂盒(中国北京天根生化科技有限公司)提取菌株的基因组。扩增使用的上游引物为27f(agagtttgatcctggtcagaacgaacgct)，下游引物为1492(tacggctaccttgttacgacttcacccc)。

25μl反应体系：

反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，退火温度从65℃降至55℃，每个循环降低0.5℃，退火时间为3s，72℃延伸1min，35个循环；恒定退火温度下进行94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min。

克隆测序及序列分析

扩增所得的基因片段经过分离纯化后，连接puc19载体，转化escherichiacolidh5α进行克隆测序，测序引物为通用测序引物m13f和m13r。对测序结果进行blast相似性分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)并提交至genebank数据库。通过bioedit软件进行基因序列的翻译，并进行氨基酸序列同源性比对。

整合纳豆激酶基因扩增筛选法，筛选出一株产纳豆激酶的高活性菌株sn-14，见图5。

(4)16srrna分子鉴定

通过mega5.05软件进行系统进化树的构建，结果得到了如图5所示的系统发育树状图。系统发育学分析结果表明，该系统树以vibriocortegadensis(hf955037)作为一个单独的外群种，其中sn-14菌株与bacillusvelezensis属菌株在同一分支，结合前面的形态学和生理生化鉴定结果，鉴定sn-14为贝莱斯芽孢杆菌属。该菌株已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctccm2017134，地址：中国武汉武汉大学。

贝莱斯芽孢杆菌sn-14的形态特征：sn-14在lb平板培养基上的菌落特征如表1所示。挑取单菌落革兰氏染色后镜检，镜下细胞形态为杆状，革兰氏染色呈阳性，产芽孢，芽孢椭圆形，中生或近中生。

表1sn-14的菌落特征

sn-14的生理生化特征：见表2、表3

表2sn-14的生理生化试验—酶活、碳源氧化

+：阳性反应；-：阴性反应

表3菌株sn-14生理生化特性—利用碳源产酸

+：阳性反应；-：阴性反应；w：弱阳性反应

实施例2：

纤溶活力(纳豆激酶活力)的测定：采用琼脂糖—纤维蛋白原平板法，琼脂糖平板的制作步骤如下：

首先将1％的琼脂糖溶于0.05mol/l的tris-hcl(ph7.8)缓冲溶液中，加热至完全溶解后，取出10ml置于大试管中，待其冷却至50℃左右，迅速倒入10ml1.5mg/l牛血纤维蛋白原溶液，不断震荡，使其完全混合均匀，注入直径9cm的培养皿中，再迅速加入300μl20iu/ml的凝血酶溶液，不断晃动平皿使三者混合均匀，防止气泡的产生，静置1h后，用直径为2mm的无菌胶头吸管在平板上打孔。

尿激酶标准曲线的制作:将本尿激酶标准品(1240iu/瓶)配制为508、635、794、992和1240iu/ml(按照80％的梯度稀释量进行)，各取10μl点样于新配制的纤维蛋白原平板上，放置10min，37℃培养16h后取出，测定溶解圈的直径，计算各溶解圈面积。以溶解圈的面积为横坐标，以尿激酶单位酶活的对数值为纵坐标作标准曲线。计算各溶解圈面积，

样品的测定:

粗酶液的制备：称取2g纳豆溶于4ml无菌的生理盐水中，4℃下浸提24h后过滤，取滤液12000r/min，离心10min，取上清液10μl分别点样在纤维蛋白原平板上，培养16h，测定溶圈的直径，计算出溶圈的面积，通过尿激酶标准曲线，计算出酶活。通过此方法测定纳豆激酶的简便易行，可行度高，可同时测定多个样品，节约实验成本。

实施例3：

一种贝莱斯芽孢杆菌sn-14在制备纳豆的中的应用，其步骤如下：

将贝莱斯芽孢杆菌sn-14菌株转接到lb斜面培养基上37℃活化24h，用接种环挑选2-3环的菌苔接种到液体种子培养基中(装液量50ml/250ml)，于37℃，180r/min的条件下培养16h至对数生长期，然后按4％(v/w)的接种量接种到灭菌的黄豆培养上，在37℃培养36h，每12h搅拌一次。发酵的纳豆颜色为土黄色，豆粒酥软，拨动黄豆有长长拉丝的现象，带有淡淡的香味物质，纳豆激酶激酶的活力为6583.2iu/g(湿黄豆)。

所述的液体种子培养基：10g/l葡糖糖，5g/l酵母提取物，10g/l牛肉膏，5g/lnacl，ph7.4～7.6。