一株抗马布特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株GZ03及其应用的制作方法

本发明一株抗马布特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株gz03及其应用，属于食品安全免疫学检测领域，涉及杂交瘤细胞株gz03及其产生的抗马布特罗单克隆抗体。

背景技术：

β-肾上腺受体兴奋剂是一类能够促进瘦肉生长的饲料添加剂，包括盐酸克伦特罗、溴布特罗、马布特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、盐酸多巴胺、硫酸特布他林、苯乙醇胺a、班布特罗、盐酸齐帕特罗、盐酸氯丙那林、西布特罗、酒石酸阿福特罗、富马酸福莫特罗等15种药物。其中盐酸克伦特罗最早被用作饲料添加剂，适用范围也最为广泛。马布特罗（mab）的化学结构与克伦特罗（cl）非常相似，很有可能成为克伦特罗的替代品。β-肾上腺受体兴奋剂这类药物在医学上具有松弛支气管平滑肌，降低血管通透性，发挥平喘的作用，也可以加强心肌收缩性，加快心律，提高心脏的兴奋性，若将这类药物加入到饲料中去，则能够显著提高猪、牛、羊等牲畜的瘦肉生长率，从而使体重也得以增加。且这类药物性质稳定、不易破坏，能通过进食摄取危害人体健康，导致明显的生理毒性，例如心悸、战栗、恶心呕吐、头晕目眩、神经过敏、血管舒张、心跳加速等，特别是对三高病人和甲亢患者有较为明显的危害，严重的甚至有可能导致死亡。欧盟、美国、中国等众多国家和地区均相应立法严令禁止使用β-激动剂作为动物饲料添加剂。我国农业部也先后颁布了176号、193号、235号、1519号等一系列公告，明确提出不得将以上15种β-肾上腺受体兴奋剂作为动物饲料及其饮用水的添加剂。

目前检测溴布特罗、克伦特罗和马布特罗的方法主要是气相色谱法（gc），液相色谱法（hplc），分光光度法、分子印迹法、毛细管电泳、气质联用法、电化学免疫传感器等方法，但是这些方法存在操作繁琐，耗时，费用比较贵等缺点，不能实现大量样品的快速检测。因此建立一种快速简便的检测方法具有重要意义。酶联免疫法（elisa）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。然而得到高特异性和高灵敏度的单克隆单体是免疫学检测的前提，其中人工抗原的合成是其中重要的一步。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种对马布特罗具有较好特异性和检测灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法。

本发明提供一种抗马布特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对马布特罗具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立马布特罗的免疫学检测方法。

本发明的技术方案：一株抗马布特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株gz03，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，保藏编号为cgmccno.13091。

抗马布特罗单克隆抗体，它由所述保藏编号为cgmccno.13091的抗马布特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株gz03分泌产生。

抗马布特罗单克隆抗体的应用，可用于食品中马布特罗的残留检测。

本发明提供的细胞株gz03的制备基本步骤为：

1）免疫原的合成：称取15.62mg马布特罗于小玻璃瓶中，加入135μl的1mhcl溶液，再加入1ml超纯水至完全溶解，4℃预冷30min；在溶液中加入13μl的30%nano2溶液，冰水浴反应1h，得到活化液；用cb缓冲液稀释三份等量klh蛋白10mg；将活化液按照体积比1︰2︰3分别缓慢滴加到各份载体蛋白klh中，偶联蛋白构建免疫原。边滴加活化液，边调节ph至9.0，直至反应液颜色变深黄色停止滴加活化液；4℃冰浴反应4h后，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；

2）包被原的合成：由于沙丁胺醇和马布特罗都具有叔丁胺基结构，所以本实验采用异源包被检测，称沙丁胺醇100mg（0.42mmol）溶于无水乙醇中；再加5.1mgdmap（4-二甲基氨基吡啶）和0.5ml无水吡啶，4℃冰浴反应，将63mg琥珀酸酐分成5等份，每隔0.5h加一份到反应液体系中，冰浴环境下边搅拌边反应5h；过滤反应液，将白色沉淀物质收集，用乙醇洗涤白色沉淀物，烘干，得到化合物a。称取9.4mg化合物a于棕色小瓶中，加入400μl的无水dmf和600μl的ph4.7、0.1mmes缓冲溶液溶解；将15.9mgedc和9.5mgnhs固体加入到溶解后的化合物a的反应瓶中，搅拌6～8h，得到活化液；称取牛血清蛋白bsa溶解于cb溶液中，将活化液加入到蛋白质溶液中，用1mnaoh溶液调节ph至9.0，室温反应过夜。整个过程避光进行。通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；

3）小鼠的免疫：马布特罗完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫balb/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免之间间隔一个月，加强免之间间隔21天。最后一次用马布特罗完全抗原（不含佐剂）冲击免疫；通过间接elisa检测血清效价和抑制；

4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（peg1500）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过hat培养基培养，利用间接elisa检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争elisa法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株gz03；

5）杂交瘤细胞株gz03性质的鉴定：通过elisa法测定灵敏度和特异性。

本发明的有益效果：（1）本发明获得的抗马布特罗单克隆抗体细胞株gz03，对马布特罗有较好的检测灵敏度和特异性（ic50值为0.41ng/ml），可以用于食品中马布特罗的残留检测；（2）一种新的半抗原合成的思路，在用异原包被进行检测，得到灵敏度很好的单克隆抗体细胞株。

生物材料样品保藏：单克隆细胞株gz03，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.13091，保藏日期2016年10月31日。

附图说明

图1.马布特罗免疫原合成紫外鉴定图。

图2.gz03分泌的单克隆抗体的抑制标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将马布特罗完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，hat选择性培养基培养，通过间接elisa和间接竞争elisa筛选细胞上清，最终得到了对马布特罗有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

实施例1：杂交瘤细胞株gz03的制备

1、完全抗原的合成

称取7.81mg马布特罗于小玻璃瓶中，加入68μl的1mhcl溶液，再加入1ml超纯水至完全溶解，4℃预冷30min；在溶液中加入13μl的30%nano2溶液，冰水浴反应1h，得到活化液；用cb缓冲液稀释klh蛋白10mg；将活化液缓慢滴加到载体蛋白klh中，边滴加活化液，边调节ph至9.0，直至反应液颜色变深黄色停止滴加活化液；4℃冰浴反应4h后，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子，并通过紫外吸收扫描方法鉴定。

2、动物免疫

选择健康的6～8周龄的balb/c小鼠进行免疫。取马布特罗完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫balb/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免之间间隔一个月，加强免之间间隔21天。三免后7天采血，使用间接竞争elisa方法测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在四免后18天冲击免疫，不使用佐剂，腹腔注射。

3、细胞融合

在冲击免疫3天后，按照常规peg（聚乙二醇，分子量为1500）方法进行细胞融合，具体步骤如下：（1）无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；（2）收集sp2/0细胞，悬浮于rpmi-1640基础培养液中，进行细胞计数；（3）将脾细胞和sp2/0细胞按照计数比1︰10的比例混合，离心后用50%peg融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入rpmi-1640基础培养液，离心后悬浮于含20%胎牛血清、2%的50×hat的rpmi-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5%co2的培养箱中培养。

4、细胞筛选与细胞株建立在细胞融合的第3天对融合细胞进行rpmi-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20%胎牛血清、1%的100×ht的rpmi-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接elisa筛选出阳性细胞孔，第二步选用马布特罗为标准品，用间接竞争elisa对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对马布特罗标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株gz03。

5、单克隆抗体的制备与鉴定

取8～10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞gz03，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。

使用间接竞争elisa，测定单克隆抗体马布特罗的ic50为：0.41ng/ml，说明对马布特罗有很好的灵敏度，可用于马布特罗免疫分析检测。

6、抗体应用

将杂交瘤细胞株gz03通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于马布特罗的elisa添加回收试验，具体步骤如下：

（1）包被：将包被原sal-bsa用0.05mph9.6碳酸盐缓冲液从2µg/ml开始倍比稀释，100μl/孔，37℃反应2h；

（2）洗涤：将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；

（3）封闭：拍干后，加入200μl/孔封闭液，37℃反应2h，洗涤后烘干备用；

（4）加样：在烘干后的板中加入pbs溶液和标准品溶液，50μl/孔，将抗血清从1︰1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，50μl/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1︰3000稀释的hrp-羊抗鼠igg，100μl/孔，37℃反应30min；

（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μl的tmb显色液，37℃避光反应15min；

（6）终止和测定：每孔加入50μl2mh2so4终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的od450值；

（7）结果判读：以od450值大于或等于阴性对照孔的2.1倍（即p/n≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的elisa效价。

溶液的配置：

碳酸盐缓冲液（cbs）：称取na2co31.59g，nahco32.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800ml混匀，调ph值至9.6，加双蒸水定容至1000ml，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液（pbs）：8.00gnacl，0.2gkcl，0.2gkh2po4，2.9gna2hpo4·12h2o，溶于800ml纯水中，用naoh或hcl调ph到7.2～7.4，定容至1000ml；

pbst：含0.05%吐温-20的pbs；

tmb显色液：a液：na2hpo4·12h2o18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000ml；b液：60mgtmb溶于100ml乙二醇中；a、b液按体积比1︰5混合即为tmb显色液，现用现混。

综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。