一种重组的长牡蛎CgC1qDC‑3蛋白的应用的制作方法

本发明属于海洋动物功能基因和免疫活性蛋白领域，具体涉及一种重组的长牡蛎cgc1qdc-3蛋白的应用。

背景技术：

含有与补体c1q分子类似的c1q球状结构域的蛋白，统称为c1qdc蛋白(c1qdomaincontainingprotein)，c1qdc蛋白在免疫应答过程中发挥重要作用。在脊椎动物中，c1qdc蛋白主要通过参与补体系统经典途径的激活而发挥免疫作用。在无脊椎动物中，c1qdc蛋白的功能趋于多样化。目前发现无脊椎动物c1qdc具有凝集微生物的活性，存在凝集素进化的痕迹；部分c1qdc能与热聚合的人igg分子相互作用，为补体经典途径的进化提供了有力证据。但是目前的研究显示，c1qdc蛋白在无脊椎动物中主要作为模式识别受体(patternrecognitionreceptors，prrs)，能识别多种的病原体相关分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns，pamps)，调理病原菌引发吞噬作用，从而达到清除病原体的目的。

目前发现c1qdc蛋白广泛存在于哺乳动物、低等脊椎动物和无脊椎动物，广谱性或特异性识别pamps，介导下游的病原菌和凋亡细胞的清除、促进细胞吞噬、细胞趋化、细胞黏附、炎症及氧化应激等重要的免疫反应过程。但是对c1qdc蛋白的pamps结合特异性、结合强度及不同c1qdc蛋白的功能差异的研究相对匮乏。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种重组的长牡蛎cgc1qdc-3蛋白的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种重组的长牡蛎cgc1qdc-3蛋白的应用，重组cgc1qdc-3蛋白在制备高亲和力特异识别脂多糖lps的药物中的应用。

所述重组的长牡蛎cgc1qdc-3蛋白的获得：

1)以长牡蛎cdna为模板，采用p1和p2为引物进行pcr扩增，待用；

2)pcr扩增产物与pmd19-t载体连接，而后将连接产物与原核表达载体经ecori，bamhi双酶切后经过t4连接酶连接；

3)将上述构建载体转入菌株中进行诱导培养，而后纯化、透析、冻干，即得到重组cgc1qdc-3蛋白；

所述引物p1和p2分别为：

p1：5’-cgcggatccattccaataaacaccatctcc-3’；

p2：5’-ccggaattcttaggatagtttgaagccggag-3’。

所述步骤2)原核表达载体为pet-30a(+)；菌株为大肠杆菌transetta(de3)。

所述步骤3)经诱导培养后采用镍柱纯化获得可溶性重组蛋白，而后透析除盐、冻干。

所述采用镍柱纯化过程：采用镍琼脂糖凝胶ff装柱将经破碎后诱导培养物上柱，在以2mlmin^-1流速用tbs缓冲液(10mmtris-hcl，150mmnacl，ph7.4)平衡清洗2-5个床体积，再以流速为2mlmin^-1流速用含10mm的咪唑的tbs缓冲液(10mmtris-hcl，150mmnacl，ph7.4)进行漂洗，收集洗脱峰流出液，最后以流速为1mlmin^-1流速用含250mm的咪唑的tbs缓冲液(10mmtris-hcl，150mmnacl，ph7.4)进行洗脱，收集洗脱峰流出纯化蛋白。

所述重组蛋白氨基酸序列如seqidn0.1所示。

本发明所具有的优点：本发明以长牡蛎为研究对象，利用分子生物学、免疫学等手段，获得长牡蛎c1qdc重组蛋白，所得重组蛋白可作为prrs特异性识别lps,且结合力较强，在监控革兰氏阴性菌入侵的过程中发挥重要作用。对长牡蛎c1qdc分子生物学功能的研究，本发明c1qdc重组蛋白的pamps结合活性、结合特异性与其病原识别功能的联系，其可以特异的识别病原相关分子模式脂多糖lps，对lps结合亲和力较强(平衡解离常数kd＝8.74×10^-7m)；并且其进一步的揭示无脊椎动物c1qdc分子在免疫系统中识别及清除病原的规律，最终为其应用于病害防控、药物研发提供理论指导。

附图说明

图1为本发明实施例提供的表达和纯化的长牡蛎cgc1qdc-3重组蛋白电泳图，其中，m：蛋白marker；lane1：加入iptg诱导的表达产物；lane2：未加iptg诱导的表达产物；lane3：纯化的重组蛋白。

图2为本发明实施例提供的spr分析重组蛋白对多种pamps的结合活性图，其中，control，对照；lps，脂多糖；pgn，肽聚糖；glucan，葡聚糖；lta，脂磷壁酸；man，甘露糖；polyi:c，聚肌苷酸-聚胞苷酸。

图3为本发明实施例提供的spr测定重组蛋白对lps的动力学结合曲线图，其中，ru，反应单位。(cgc1qdc-3重组蛋白对lps结合的平衡解离常数为kd＝8.74×10^-7m。)

具体实施方式

下面的实施例中将对本发明作进一步说明，但本发明不限于此。

实施例1长牡蛎cgc1qdc-3重组蛋白的构建：

1.重组载体的构建：本发明中采用的重组载体为novagen公司的pet-30a(+)原核表达载体。通过pcr技术，模板为长牡蛎cdna，使用3’和5’末端分别添加了ecori，bamhi特定酶切位点的基因特异性引物p1(5’-cgcggatccattccaataaacaccatctcc-3’)和p2(5’-ccggaattcttaggatagtttgaagccggag-3’)扩增长牡蛎cgc1qdc-3蛋白基因编码区。反应条件为：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟。将pcr产物纯化回收，与pmd19-t载体连接。转化后，挑取单克隆利用载体引物进行菌落pcr筛选并测序，验证测序正确后用质粒提取试剂盒提取阳性克隆质粒(大连宝生物工程有限公司)，待用；使用ecori，bamhi双酶切阳性克隆质粒，用胶回收纯化试剂盒(大连宝生物工程有限公司)对酶切产物纯化回收；纯化片段与经ecori，bamhi双酶切的表达载体pet-30a(+)连接，完成载体的构建。

所述引物p1和p2分别为：

p1：5’-cgcggatccattccaataaacaccatctcc-3’；

p2：5’-ccggaattcttaggatagtttgaagccggag-3’。

2.重组蛋白的表达：以transseta(de3)为重组表达菌株，将上述构建的重组载体转化到表达宿主菌，挑取单克隆，提取质粒，测序验证读码框正确。挑取阳性单克隆，接种于6mllb液体培养基中，37℃在摇床中剧烈震荡培养12-16小时，然后以1：100的比例接种于400mllb液体培养基中，37℃培养至od600＝0.4-0.8。加入iptg，使终浓度达到1mm/ml，16℃，120rpm继续过夜培养20h。4℃，8000rpm，离心10min，收集菌体，于-80℃冻存备用。取1ml菌液离心，弃去上清后，加入80μltbs缓冲液和20μl5×蛋白上样缓冲液(常规通用试剂)，100℃沸水煮沸10分钟，sds-page检测诱导表达产物。

3.重组蛋白的纯化与浓缩：将上述所得诱导蛋白采用镍琼脂糖凝胶ff纯化获得了可溶重组蛋白，透析到tbs缓冲液除盐和咪唑，即获得seqidno.1所示的重组蛋白。

所述蛋白纯化方法具体操作步骤如下：

镍琼脂糖凝胶ff色谱分离带his标签的重组蛋白：

(1)镍琼脂糖凝胶ff装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml；

(2)用tbs缓冲液(10mmtris-hcl，150mmnacl，ph7.4)；平衡2-5个床体积，流速为2mlmin^-1；

(3)将20ml含细菌破碎物的tbs缓冲液(10mmtris-hcl，150mmnacl，ph7.4)上清液经0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1mlmin^-1；

(4)用tbs缓冲液(10mmtris-hcl，150mmnacl，ph7.4)再洗2-5个床体积，流速为2mlmin^-1；

(5)用含10mm的咪唑的tbs缓冲液(10mmtris-hcl，150mmnacl，ph7.4)进行漂洗，流速为2mlmin^-1，收集洗脱峰流出液；

(6)用含250mm的咪唑的tbs缓冲液(10mmtris-hcl，150mmnacl，ph7.4)进行洗脱，流速为1mlmin^-1，收集洗脱峰流出液，用sds-page检测流出液所含蛋白。表达和纯化结果如图1：m：蛋白marker；lane1：加入iptg诱导的表达产物；lane2：未加iptg诱导的表达产物；lane3；纯化的重组蛋白；

(7)用30％异丙醇流洗5个柱床体积，再用20％的乙醇保存柱子。

seqidno.1

ipintiskhktlvydrvetnagkgydarsgqftapesglyvfhtsttaqdkshstievvkngevkdmswadamehidravastmtilsltkgdivsvrvgityggnllesdqytrmsfsgfkls

(a)序列特征：

●长度：124个氨基酸

●类型：蛋白

●链型：单链

(b)分子类型：双链dna

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：长牡蛎

(f)特异性名称：无

结构特征：为一个只含单巨球头状c1q结构域的蛋白。

实施例2cgc1qdc-3重组蛋白pamps结合活性分析：

用表面等离子共振技术(biacoret200sprinstrument，gehealthcare)检测实施例1所得cgc1qdc-3重组蛋白对病原相关分子模式pamps的结合。

hbs-ep缓冲液(gehealthcare)(ph＝7.5)作为实验运行的工作液(含10mmhepes、150mmnacl、3mmedta和0.005％(v/v)表面活性剂p20)，10mm的甘氨酸-盐酸盐(ph＝1.5)作为洗涤液。首先，根据aminecouplingkit(gehealthcare)的指示将抗his标签抗体共价固定在cm5芯片表面。pamps包括lps，lta，glu，polyi：c和man，用工作液配备为400μg/ml。根据实验程序配备定量的配体cgc1qdc-3重组蛋白和样品pamps加入对应的孔槽，本实施例用到cgc1qdc-3重组蛋白(100μg/ml)体积284μl，lps，lta，glu，polyi：c和man体积均58μl，58μl工作液(对照)，420μl洗涤液加入相应的仪器孔槽。捕获配体cgc1qdc-3重组蛋白时，液流系统流速为10μl/min，反应时间为90s；pamps上样时，液流系统流速为10μl/min，反应时间为120s；洗涤时，液流系统流速为30μl/min，反应时间为35s(参见图2)。

结合反应结果如图2所示，结果显示cgc1qdc-3重组蛋白特异性结合lps，其反应单位超过180ru，而不结合其他pamps(lta，glu，polyi：c和man)。

实施例3cgc1qdc-3重组蛋白对lps的结合力分析：

在biacoret200spr仪上开启动力学检测程序测定上述获得cgc1qdc-3重组蛋白对lps结合的动力学曲线。cgc1qdc-3重组蛋白(100μg/ml)383μl，浓度为0，6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml的lps各88μl，实施例2工作液88μl，洗涤液537μl加入对应孔槽，运行实验程序，得到cgc1qdc-3重组蛋白对lps结合的动力学曲线如图3所示。利用分析软件biacoresoftware的1:1langmuirbinding模型对动力学曲线拟合，得出cgc1qdc-3重组蛋白对lps结合的平衡解离常数为kd＝8.74×10^-7m，结合力较强。

sequencelisting

<110>中国科学院海洋研究所

<120>一种重组的长牡蛎cgc1qdc-3蛋白的应用

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<160>1

<170>patentinversion3.1

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<212>prt

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151015

valgluthrasnalaglylysglytyraspalaargserglyglnphe

202530

thralaprogluserglyleutyrvalphehisthrserthrthrala

354045

glnasplysserhisserthrilegluvalvallysasnglygluval

505560

lysaspmetsertrpalaaspalametgluhisileaspargalaval

65707580

alaserthrmetthrileleuserleuthrlysglyaspilevalser

859095

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100105110

tyrthrargmetserpheserglyphelysleuser

115120