本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种新型葡聚糖蔗糖酶及其在催化制备水溶性葡聚糖中的应用。
背景技术：
：葡聚糖(glucan)是一种以葡萄糖为单体的聚合物，在医药、精细化工、石油开采、食品、化妆品等领域有着广泛的应用，其中根据糖苷键的类型可分为α,葡聚糖和β-葡聚糖。α-葡聚糖中研究使用较多的为右旋糖酐(dextran)，右旋糖酐具有较高的分子量，主要由d-葡糖吡喃糖以α,1-6键连接，支链点有α,1-2、1-3、1-4糖苷键连接形成的。随着微生物种类和生长条件的不同，其结构也有差别。由于结构的不同，葡聚糖可分为水不溶性葡聚糖和水溶性葡聚糖。水溶性葡聚糖在保健品、化妆品、动物养殖、医药等领域都有重要的应用。葡聚糖蔗糖酶(glucansucrase，亦称蔗糖-6-葡萄糖基转移酶)(ec.2.4.15)是一种糖苷转移酶，属于糖苷水解酶第70家族。肠膜明串珠菌分泌的葡聚糖蔗糖酶属于诱导型酶，诱导物和底物都为蔗糖，且在一定范围内，酶的产量与蔗糖浓度成正比。葡聚糖的生产方法有两种：微生物直接发酵法和酶合成法。直接发酵生产葡聚糖时，发酵液成分复杂，导致产物分离困难、葡聚糖分子大小难以控制、细胞核蛋白类杂质多等缺点，而利用纯酶催化制备葡聚糖，可以克服这些不足，生产出高产品质量的葡聚糖。技术实现要素：本发明需要解决的技术问题是提供一种新型葡聚糖蔗糖酶，以解决现有技术中直接发酵生产葡聚糖时，发酵液成分复杂，导致产物分离困难的问题。本发明还要解决的技术问题是提供编码上述葡聚糖蔗糖酶的基因序列。本发明还要解决的技术问题是提供包含上述葡聚糖蔗糖酶基因的重组质粒、重组细胞系统或转基因重组菌。本发明还要解决的技术问题是提供一株表达葡聚糖蔗糖酶基因的基因工程菌。本发明还要解决的技术问题是提供上述表达葡聚糖蔗糖酶基因的基因工程菌在产葡聚糖蔗糖酶中的应用。本发明最后要解决的技术问题是提供葡聚糖蔗糖酶在催化制备葡聚糖中的应用。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种葡聚糖蔗糖酶，其氨基酸序列如seqidno.1所示。一种编码葡聚糖蔗糖酶的基因序列，其核苷酸序列如seqidno.2所示。包含seqidno.2所示核苷酸序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在本发明的保护范围之内。一种表达葡聚糖蔗糖酶的基因工程菌，该菌株中包含seqidno.2所示核苷酸序列。上述表达葡聚糖蔗糖酶的基因工程菌，该菌株的构建方法如下：(1)将seqidno.2所示核苷酸序列导入表达质粒，得到重组质粒；(2)将重组质粒转化宿主菌，得到表达葡聚糖蔗糖酶的基因工程菌。步骤(1)中，所述表达质粒为pet28a。步骤(2)中，所述宿主菌为e.colibl21(de3)。上述葡聚糖蔗糖酶在制备葡聚糖中的应用在本发明的保护范围之内。具体的方法是：以蔗糖为底物，葡聚糖蔗糖酶为催化剂，得到水溶性葡聚糖。其中，催化反应的ph为5.0～7.0，反应时间6～8小时，葡聚糖蔗糖酶添加量6～10u，蔗糖浓度为50～200g/l有益效果：本发明提供了一种以来至于肠膜明串珠菌leuconostocmesenteroidesg123的葡聚糖蔗糖酶合成水溶性葡聚糖的方法。本发明涉及到的葡聚糖蔗糖酶命名为dsrs。该酶在特定的催化条件下可高效催化制备水溶性葡聚糖，同时葡聚糖得率高达90％以上。本发明提供的新型葡聚糖蔗糖酶应用前景广阔，和以其制备的水溶性葡聚糖的可被引用于保健品、化妆品、动物养殖、医药等领域。附图说明图1e.colibl21(de3)-pet28a-dsrs重组菌株鉴定，(第一泳道为dnamarker，第二泳道为重组菌菌落pcr产物)具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1：产葡聚糖蔗糖酶重组大肠杆菌的构建步骤1：将肠膜明串株菌leuconostocmesenteroidesg123进行试管培养活化，试管装液量为5ml，接种量为1％，培养温度为30℃，培养时间为10-12h，得到菌株生长旺盛的菌液，10000rpm离心获取菌泥，利用革兰氏阳性菌的提基因组试剂盒提取肠膜明串株菌leuconostocmesenteroidesg123的基因组作为pcr模板。步骤2：产葡聚糖蔗糖酶基因dsrs的获取上游引物：5’-cgcggatccgaattcatgttagtaacagctggtattttttc-3’下游引物：5’-acggagctcgaattcttatatagtatttaaacgctgtctctctc-3’以leuconostocmesenteroidesg123的基因组dna为模板，以上述引入pcr扩增dsrs因片段，反应条件为：94℃，5min；(94℃45s，50℃45s，72℃300s，35个循环)，72℃，10min，扩增出dsrs基因，将pcr反应液进行纯化回收，备用。步骤3：将步骤2中构建好的质粒转入e.colibl21(de3)中。具体方法如下：将装有200μl制作好的e.coli感受态细胞冰盒上解冻5-10min；加入20μl冷却的一步克隆反应液：手指轻弹，混匀，冰上放置30min；42℃，水浴90s，冰浴2min；加入900μl新鲜lb培养基，复苏细胞，37℃，200rpm，培养1h。取100μl涂布在抗性平板上，37℃培养箱中培养10-12h，挑取菌落，使用步骤2中的引物进行pcr验证，能扩增出目的基因片段的菌落即为pet28a-dsrs质粒成功表达的菌株。如图1所示，dsrspcr产物大小约为4500bp与预期一致，说明构建菌株正确。实施例2：构建菌株发酵制备葡聚糖制糖酶dsrs种子培养基(g/l)：酵母粉5，蛋白胨10，nacl10，ph7.0，121℃灭菌15min。发酵培养基(g/l)：酵母粉24，蛋白胨12，kh2po42,.31，k2hpo416.43，葡萄糖10，121℃灭菌15min。生产方法：取平板上单菌落接种于装液量为5ml的试管中，30℃、200rpm培养12h。制备一级种子液，将一级种子液接种于装有100ml发酵培养液的500ml三角瓶中，200rpm，30℃培养0～4h后加入0.1～1.0mmiptg诱导dsrs目的蛋白的表达，继续培养至24h，停止发酵后，将培养液于10000r/min离心10min，弃上清，用ph为6.2的磷酸缓冲液混悬沉淀，冻融后获得粗酶液。如表1所示，不同iptg诱导条件下，dsrs最高酶活可达7.6u(粗酶液)。对粗酶液进行分离纯化，然后进行酶活测定，dsrs最高酶活可达30u。表1不同iptg浓度诱导重组菌株对dsrs酶活的影响iptg浓度dsrs酶活(粗酶液)dsrs酶活(纯化后)0.1mm0.8u/g-dcw3.4u/g-dcw0.3mm2.7u/g-dcw11.3u/g-dcw0.5mm4.9u/g-dcw20.6u/g-dcw0.7mm4.1u/g-dcw15.8u/g-dcw1.0mm1.2u/g-dcw5.1u/g-dcw酶的分离纯化：步骤一：粗酶液中加入硫酸铵至80％饱和度，4℃静置过夜。10000r/min离心15min，将沉淀溶解于ph8.0的50mmol/ltris-hcl缓冲液，hitrapdesalting脱盐柱脱盐。步骤二：离子交换层析:将脱盐后的酶液加到用50mmol/lph8.0的tris-hcl充分平衡的deae阴离子交换柱上(deae柱料为ge公司产品)，然后用tris-hcl缓冲液平衡，之后用0－1.0mol/lnacl(50mmol/ltris-hclph8.0)进行梯度洗脱，流速为2ml/min，合并含有甘露聚糖酶活力的组分。步骤三：凝胶过滤:将上述所得活力组分用超滤离心管浓缩至500μl。然后将样品加到50mmol/lph8.0的tris-hcl预平衡的superdex20010/300gl柱(ge公司产品)进行分子筛层析，用相同的缓冲液洗脱，流速为0.5ml/min。酶活测定方法：步骤一：葡聚糖蔗糖酶的活力表示为在ph5.4，30℃的条件下，1min中内反应生成1μmol果糖所需的酶量为一个酶活单位u。酶活反应体系：30℃，20mm乙酸钠缓冲液(ph5.4)，0.05g/lcacl2,1g/lnano3，100g/l蔗糖。具体方法为(1)取7支比色管编号0-7，分别加入浓度为1mg/ml的果糖标准液0ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml，1.2ml，补足蒸馏水至2.0ml，加入1.5mldns试剂，配成不同果糖浓度的反应液，将比色管摇匀后在沸水浴中加热5min，取出，冷却至室温，蒸馏水定容至20ml，颠倒混匀，用0号管调零，540nm下测定吸光值，以吸光值为横坐标，果糖含量(μmol)为纵坐标制定标准曲线。(2)取500μl待测酶液与2.5ml反应体系混合，混匀后放入30℃水浴中反应20min，采用dns测定反应体系中0min和20min的还原糖(即为葡聚糖蔗糖酶催化反应生成的果糖)含量。(3)取葡聚糖蔗糖酶反应体系的样品500μl，加蒸馏水至2.0ml，加入1.5mldns，沸水浴5min，取出冷却至室温，蒸馏水定容至20ml，颠倒混匀，测定540nm下测定吸光值，对照标曲计算得到相应还原糖的含量(μmol)。(4)葡聚糖蔗糖酶活力(u,μmol/min)＝(20min反应体系中还原糖总量-0min反应体系中还原糖总量)/(20min*反应体系中加入的酶液体积)。实施例3：葡聚糖蔗糖酶催化蔗糖生产可溶性葡聚糖步骤一：采用不同浓度的蔗糖制备葡聚糖，使反应体系中蔗糖终浓度分别为50g/l，100g/l，150g/l，200g/l，30℃，反应时间为6～12h，优选8h；在反应体系中加入磷酸缓冲液，控制反应体系ph为5.0～7.0，优选6.0；反应温度为30℃～40℃，优选30℃；酶添加量为1～10u，优选10u。表2利用蔗糖催化在优选条件下制备葡聚糖蔗糖浓度葡聚糖产量葡聚糖得率*50g/l23.7g/l95％100g/l47.5g/l95％150g/l71.9g/l96％200g/l94.2g/l94％*得率按照生产每g葡聚糖消耗的蔗糖中的葡萄糖量计算得出。该新型酶具有高葡聚糖催化得率的特性，在50～200g/l蔗糖条件下，葡聚糖得率均大于90％。步骤二：向步骤2的反应液中加入冷乙醇，加入冷乙醇的体积为反应液的2～3倍，冰上静置30～60min，9000rpm离心10～20min得沉淀物，弃上清，50～55℃下干燥至恒重(w1)得葡聚糖。步骤三：将所得的葡聚糖，加水于40℃溶解12h，将溶解液9000rpm离心10min后发现无沉淀物，收集上清，加入2～3倍体积的冷乙醇，冰上静置30～60min，9000rpm离心10～20min，取沉淀物，50～55℃下干燥至恒重(w2)，经比较，w2和步骤二中的w1值基本一致。由此可得，步骤三中所产生的葡聚糖为水溶性葡聚糖。对干燥后的葡聚糖进行分子量测定，得到其分子量为3000。sequencelisting<110>南京工业大学<120>一种新型葡聚糖蔗糖酶及其在催化制备水溶性葡聚糖中的应用<130>sg20170425<160>4<170>patentinversion3.<210>1<211>1505<212>prt<213>葡聚糖蔗糖酶氨基酸序列<400>1metleuvalthralaglyilepheseralavalilepheglyvalser151015ilealaasnvalseralaaspserileasnasnthrserilealaval202530alaglnserlysasnilealavalalathrthrthralathrmetasp354045lysvalthraspthrthralathrthrasplysvalthraspthrthr505560alathrthrasplysvalthraspthrthralathrthrasplysval65707580thraspthrthralathrthrasplysvalthraspthralaalathr859095thrasplysvalalaaspthrthralathrthrasplysvalthrasp100105110thrthralathrthrglylysvalthraspthrthralathrthrasp115120125lysvalalaaspthrthralathrthrasplysvalalaaspthrthr130135140alathrthrasplysvalthraspthralaalathrthrasplysala145150155160thraspthralaalathrthrasplysvalalaaspthrthralathr165170175thrasplysalaalaasnthrthrvalthrproserglulysserlys180185190serilelysglnileaspglylysthrtyrpheileglyaspaspgly195200205glnprolyslysasnphethralailevalaspglyglnvalleutyr210215220pheasplysaspthrglythrleuthrserasnserserglntyrthr225230235240aspglyleuvalasnileglyasngluhisasnalaalatyrserleu245250255serseraspserphethrglnvalaspglytyrleuthralaasnser260265270trptyrargprolysaspileleulysasnglythrthrtrpthrala275280285serthralaasnasppheargproleuleumetsertrptrpproasp290295300lysaspthrglnvalsertyrleulystyrmetglnservalglyleu305310315320leuseraspaspvalvalleuserasnlysaspsermetasnserleu325330335thralametalaleuthrvalglnlysasnilegluglulysilegly340345350leuleuglythrthrasptrpleulysthraspmetaspglnmetval355360365aspserglnserasntrpasnilesersergluserlysglythrasp370375380hisleuglnglyglyalaleuleutyrvalasnseraspleuthrpro385390395400asnalaasnserasptyrargleuleuasnargthrprothrasngln405410415lysglyglnilethrthraspglyasnglnglyglytyrglumetleu420425430leualaasnaspvalaspasnserasnproilevalglnalaglugln435440445leuasntrpleutyrtyrmetmetasnileglyserilevalglnasn450455460aspprothralaasnpheaspglytyrargvalaspalavalaspasn465470475480valasnalaaspleuleuglnilealaglyasptyrphelysalaala485490495tyrglythrasplysseraspalaasnalaasnasnhisileserile500505510leugluasptrpaspasnasnaspproalatyrvallysserglngly515520525asnasnglnserthrmetaspphepromethisleualaleulystyr530535540serleuasnmetproserseralaargserglyleugluproaspile545550555560valthrserleuvalasnargsergluaspserthrgluasngluala565570575glnproasntyrserpheileargalahisaspsergluvalglnthr580585590valilealaglnileilelysasplysileasnproserseraspasp595600605glyleuthrvalserthraspgluilealalysalaphegluiletyr610615620asnalaaspgluleulysalaasplysglutyrthralatyrasnile625630635640prosersertyralaleumetleuthrasnlysaspthrileproarg645650655valtyrtyrglyaspleuphethraspaspglyglntyrmetserala660665670lysserprotyrtyraspalaleuthrserleuleuglnserargval675680685lystyrvalserglyglyglnsermetasnmetalatyrleuhisasn690695700asnglnglyleuleuthrservalargtyrglylysglyalametthr705710715720alathraspthrglythrsergluthrargthrglnglyileglyleu725730735ilevalserasnlysthraspleuasnleuasnasnaspgluglnile740745750valleuasnmetglyalavalhislysasnglnalatyrargalaleu755760765metleuserthrlysaspglyleulysiletyrasnseraspaspasp770775780alaproleualatyrthraspaspglnglyargleuthrphelysser785790795800aspmetvalpheglyvalseraspalaglnvalserglytyrleuala805810815alatrpvalprovalglyalathraspaspglnaspalaargasngln820825830serserthrilealaserthraspglyasnthrtyrhisserasnala835840845alaleuaspserglnvaliletyrgluglypheserasnpheglnala850855860metprothrglnthrasnglutyrthrasnvallysilealaglnasn865870875880alaglnleuphelysasnleuglyilethrserphegluleualapro885890895glntyrargserserthraspasnserpheleuaspalavalvalgln900905910asnglytyralaphethraspargtyraspileglytyrasnthrpro915920925thrlystyrglythrvalaspglnleuleuaspalaleuargalaleu930935940hisalaglnaspileglnalaileasnasptrpvalproaspglnile945950955960tyrasnleuproserglugluilevalthralaserargthrasngly965970975serglylysileasngluthrservalileasnasnthrleutyrasp980985990serhisthrvalglyglyglyglutyrglnalaphetyrglyglyala99510001005pheleuasplysleulysglnasppheprogluleuphegluthr101010151020lysglnileserthrglyglualametasnproaspvallysile102510301035thrglutrpseralalystyrpheasnglyserasnileglngly104010451050argglyalatrptyrvalleulysasptrpalathrasnglntyr105510601065pheasnvalserserglyserlyspheleuprolysglnleuleu107010751080glyglulysthrserthrglyphethrasnvalaspasnglylys108510901095thrgluphetyrserthrserglytyrglnalalysasnthrphe110011051110ileglnaspasnaspasntrptyrtyrpheaspasnaspglytyr111511201125metvalvalglyglyglngluileasnglylyslystyrtyrphe113011351140leuproasnglyvalgluleuglnaspalatyrleuseraspgly114511501155thrasnvaltyrtyrtyrserserthrglyargglnilethrasn116011651170glntyrtyrargaspseraspserlystrphistyrphepheser117511801185aspglyhismetalavalglyleuthrthrilethralaaspasn119011951200glythralaasnglnglntyrpheaspvalasnglyileglnleu120512101215lysglyvalalavallysaspthraspglyasnvalargtyrphe122012251230aspglyasnthrglyasnleuvalvalserasntrpglylysthr123512401245alaaspglysertrpleutyrleuasnasplysglyilealaval125012551260thrglyglnglnasnileasnglyglnasnvaltyrpheasnglu126512701275aspglyvalglnvallysglyglualailethraspthrasngly128012851290asnvalhistyrtyraspargserthrglyasnmetvalthrasn129513001305sertrpalagluleuproaspsersertrpmettyrleuaspval131013151320asnglyvalalaalaileglyalaglnlysileasnglyleuglu132513301335phetyrpheaspasnasnglylysglnvallysasnasplysval134013451350ileasnaspaspglythrileasntyrtyrthrglymetsergly135513601365glulysleulysasnasppheglygluleuproaspglysertrp137013751380mettyrleuaspasnglnglyasnalavalileglyasplyslys138513901395ileasnglyglnasnleutyrphelysileaspglyglnglnval140014051410lysglygluthrtyrileaspglyvalglylysmetargphetyr141514201425glnalaalaserglyglumetvalthrasnglnphegluglnval143014351440alaaspglylystrpalatyrpheglyalaaspglyvalalaval144514501455thrglygluglntyrileaspglyglnaspleuphepheasppro146014651470thrglytyrglnvallysglyasplysargthrileaspserval147514801485leutyrserpheasplysaspserglygluargglnargleuasn149014951500thrile1505<210>2<211>4518<212>dna<213>葡聚糖蔗糖酶基因序列<400>2atgttagtaacagctggtattttttctgctgtgatatttggcgtttccatagctaacgta60agcgctgatagtattaacaatactagtattgcggtggcgcaatcaaaaaatatagcagtg120gccacaacgacagctacaatggacaaagtaactgatacgacagctacaacggacaaagta180actgatacgacagctacgacagataaagtaactgatacgacagctacaacggacaaagta240actgatacgacagctacgacagataaagtaactgacacggcagctacgacggacaaagtg300gctgacacgacagctacaacggacaaagtaactgatacgacagctacaacgggcaaagta360actgacacgacagctacgacggacaaagtggctgacacgacagctacgacagataaagtg420gctgacacgacagctacaacggacaaagtaactgacacggcagctacaacggataaagca480actgacacggcagctacaacggacaaagtagctgatacaacagctacgacagataaagca540gcgaacacaacagttacaccttcagaaaaatcaaaaagtattaagcaaatcgatggtaaa600acatatttcattggtgatgatggtcagcccaagaaaaattttacagccattgtggacggt660caagtattatatttcgacaaagataccggtactttgacatcaaatagtagtcaatatacc720gatggtttggtcaatataggaaatgagcataatgcggcttattcattgtcttcggacagt780tttacacaagttgatggctatctaacggctaacagttggtatcgacctaaagatatattg840aaaaatggtacaacatggacagcttcaacagcaaatgattttcgaccattgttgatgtct900tggtggccggataaagatacccaagtttcatacttaaaatatatgcaatctgttggatta960ttatcagatgacgttgtactatcaaacaaggatagtatgaatagtttgacagctatggca1020ctgactgttcaaaaaaatattgaagagaaaataggcctattaggtaccactgactggctt1080aagactgatatggaccaaatggttgactcacaatcaaattggaacattagtagtgagtct1140aaaggaacagatcatttgcaaggtggtgcgctcctatatgtgaatagtgatttgacacca1200aatgctaattctgattatcgtttattaaatcgaacgccaacgaaccaaaaaggtcaaatt1260acaacagacggtaatcaaggtggctatgagatgctgttggccaacgatgttgataattct1320aaccctattgttcaagctgaacaattgaattggttgtactacatgatgaatatcggtagt1380atcgtccaaaatgatccaacggcaaattttgatggttacagagttgatgctgttgacaac1440gtgaatgctgatttgttgcaaattgctggcgattactttaaggcagcgtatggaacggat1500aaaagtgatgctaatgcaaacaatcacatttctatcttagaagactgggataataatgat1560ccggcgtatgtaaaatcacagggaaataaccaatcaaccatggattttccaatgcatttg1620gcgttaaagtattcattaaatatgccaagtagtgctcgtagcgggttggaaccagatatt1680gtaacaagtctagtaaatcgctcagaagattcaacagaaaatgaagcacaaccgaactat1740tcatttattcgggcacatgatagtgaagtacaaaccgttattgcgcaaattattaaagat1800aaaattaatcctagttctgatgatggattgactgtttcaacggatgaaattgccaaagca1860ttcgaaatatataatgccgacgaattaaaagctgataaagagtacactgcatataatata1920ccctcatcatatgcattgatgttaactaacaaagatacaattcctcgtgtgtattatggt1980gatttgtttacggatgatggacaatatatgtctgctaagtcaccatattatgatgcactt2040acctcattgcttcagtcgcgagtaaaatatgtttcaggtggtcaatcaatgaatatggct2100tacctgcataataatcaaggccttttgacatctgtccgctatgggaaaggtgccatgaca2160gctactgatactggtaccagtgaaactcgtacacaaggtattgggttaattgtcagtaac2220aaaactgatttaaatctgaataatgatgagcaaattgtgcttaacatgggcgctgtacac2280aaaaatcaagcttaccgtgcattaatgttaagtactaaagatggattgaaaatttataat2340agtgatgacgatgcaccgctggcatatacagatgaccagggtcgtttgacttttaaatct2400gacatggtttttggtgtgagtgatgctcaggtttctggttatttagcagcttgggtgcca2460gttggcgcaacagatgatcaagatgctaggaatcaaagcagtacgatagcttcaacagat2520ggtaatacctatcattcaaacgctgctttggattctcaggttatttatgaaggtttttca2580aactttcaagcgatgccaactcagactaatgaatataccaatgttaaaattgctcaaaat2640gcgcaactattcaaaaatctcggtataactagttttgaattagcacctcaatatcggtca2700agcactgataatagtttcttagatgcagttgttcaaaatggttatgccttcacggatcga2760tacgacattggttataatacgcctacaaaatacggtacagttgatcaactattagacgct2820ttaagagcattacatgctcaagacattcaggctatcaatgattgggtcccagaccaaatt2880tataatttgcctagcgaagaaatcgtgactgctagtcgaacaaatgggtcaggaaagata2940aacgaaacttcggttattaacaatacgttatatgattctcatactgtcggtggcggagag3000tatcaggcattttatggtggtgctttcttagataagttaaaacaagattttcctgagtta3060tttgaaacaaaacaaatttcaaccggtgaagcaatgaaccctgatgtcaaaatcacagaa3120tggtcagctaagtattttaatggctcaaacattcaagggcgtggtgcatggtatgttctc3180aaggattgggcgacaaatcaatactttaatgtttcaagtggtagcaaatttttacctaaa3240caattattaggtgaaaaaacaagcacagggtttaccaacgttgataatggtaagactgag3300ttttactctacaagtggttaccaagctaagaatacctttattcaagataatgacaattgg3360tattattttgataatgatggttacatggttgttggtggtcaagaaattaatggtaaaaaa3420tattacttcctgccaaatggtgtagagttacaagatgcttatttgtcggatggtactaat3480gtatattattacagtagtacaggtcgtcaaattactaatcaatattatcgagattcagat3540agcaaatggcattacttcttctcagatgggcatatggccgttggtttaacaacaattact3600gcagataacggcacggctaatcaacaatattttgacgttaatggtatacaacttaagggt3660gttgctgttaaagacactgatggaaatgttcgttattttgatggtaacacaggaaacttg3720gttgtcagtaactggggtaaaacggctgatggttcatggttatacctaaatgataaaggg3780atagcagtaacgggacagcaaaatattaatggccaaaatgtctattttaacgaagatggt3840gttcaagtgaagggcgaagccattacggatactaatggcaatgtacattactatgatcgt3900agtactggaaatatggtgactaattcatgggcagagttaccggacagctcgtggatgtat3960ctagatgttaatggcgttgctgctattggtgctcaaaaaattaatggtctggaattttat4020ttcgataataacggtaaacaagttaagaacgacaaagtcattaatgatgatggaacaata4080aactattacacaggtatgagcggtgaaaaactaaaaaatgattttggtgaattgccagac4140ggatcatggatgtacttggataatcaaggtaatgctgtaataggcgacaaaaaaattaat4200ggtcagaatctatacttcaagatagacggacaacaggttaagggtgaaacctatatagat4260ggagttggcaagatgcgtttctatcaagctgccagcggtgaaatggtgacgaatcaattc4320gaacaagttgctgatggcaaatgggcttactttggtgctgatggtgtggctgtcactgga4380gagcaatatattgatggtcaggatcttttctttgacccaactggttatcaagtgaagggt4440gacaaacgcacaattgacagcgttctctatagctttgataaagacagtggagagagacag4500cgtttaaatactatataa4518<210>3<211>41<212>dna<213>artificialsequence<220><223>上游引物<400>3cgcggatccgaattcatgttagtaacagctggtattttttc41<210>4<211>44<212>dna<213>artificialsequence<220><223>下游引物<400>4acggagctcgaattcttatatagtatttaaacgctgtctctctc44当前第1页12