丝素纳米银/PVA抗菌薄膜的制备方法及其产品和应用与流程

本发明属于生物材料领域，具体涉及丝素纳米银/pva抗菌薄膜的制备方法，还涉及由该方法制得的产品及其应用。

背景技术：

抗菌包装的主要目标是保护被包装物质免受细菌的侵染，提供安全环境。目前，抗菌包装系统的应用由于缺乏合适可用的抗菌物质以及制备方式，易导致环境污染等原因受到局限。由于消费者对产品微加工以及不含防腐剂的要求越来越高，抗菌包装系统的发展有助于食品工业和包装材料行业的发展。近来，人们对开发具有成膜能力和抗菌特性材料的兴趣与日俱增。

纳米包装是采用纳米抗菌材料与包装材料通过共混、表面涂抹等方式制备的抗菌薄膜，对产品起到防止细菌滋生的功效。通过对包装材料进行纳米合成、添加、改性使其具备抗菌性是研究较多的领域。纳米材料因其表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应在光学、电子学和生物学领域具有广泛的应用前景。纳米银作为一种广为人知的纳米材料，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌和病毒均具有良好的抑制活性，在生物医学如创伤修复等领域得到了广泛的应用。在抗菌包装材料领域也有较多的报道。

纳米银抗菌包装薄膜制备可分为两大类：一类是通过在包装膜表面涂膜或者吸附纳米银。这种方法一般步骤繁琐，条件苛刻，且易引入有毒有害试剂。纳米银在空气中也易于氧化和聚集，从而降低抗菌活性。这些缺点使得纳米银材料在实际运用中受到一定的限制。利用有机或者无机材料制备纳米银复合材料，虽然可以增加纳米银的稳定性，然而通常方法复杂，成本较高。另一类为在成膜过程中，抑菌物质直接合成在包装材料中，而生物合成的方式是最积极环保的一种方法。通过绿色合成制备纳米银复合材料，以便用于抗菌包装材料领域，越来越受到人们的关注。

丝素蛋白由蚕的前部丝腺细胞分泌，是组成茧丝的主要蛋白，约占茧丝的百分之七十左右。在纺织服装产业中，由于需求美观舒适的等原因，下等茧丝往往难以发挥其经济价值。丝素蛋白含有18种天然氨基酸，其中8种是人体必须的氨基酸，还有高含量的甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸以及酪氨酸。由于丝素蛋白良好的力学性能和生物相容性以及其具有独特的光、电学的性能使之在生物医药、光电器件、纳米材料、微流体和精细化工等领域也有着广泛的应用前景。但是丝素蛋白用于制备抗菌包装材料未见报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供丝素纳米银/pva抗菌薄膜的制备方法；本发明利用本发明的目的之二在于提供由该方法制得的产品；本发明的目的之三在于提供丝素纳米银/pva抗菌薄膜的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

本发明利用丝素蛋白独特结构以及含有大量酪氨酸，具备原位合成纳米银的能力，制备过程中首先将茧丝脱胶，利用溴化锂提取丝素蛋白，在光照条件下，室温反应得到丝素-纳米银溶液，将丝素-纳米银与pva溶液按照不同的比例共混得到丝素-纳米银/pva共混液，在反复冻融的条件下得到其凝胶，然后干燥得到丝素-纳米银/pva薄膜，具体方法如下：

丝素纳米银/pva抗菌薄膜的制备方法，包括如下步骤：将蚕丝脱胶后用溴化锂溶液溶解，然后透析去除溴化锂得丝素蛋白，然后向丝素蛋白中加入硝酸银溶液原位合成纳米银，得到丝素-纳米银，最后将丝素-纳米银与聚乙烯醇混合，反复冻融，干燥，得丝素纳米银-pva抗菌薄膜。

本发明中，所述丝素-纳米银的质量分数为1～5％，所述聚乙烯醇的质量分数为1～5％。

本发明中，所述丝素-纳米银与聚乙烯醇的体积比为1:1～4:1。

本发明中，所述反复冻融的次数为3～4次。

本发明中，所述蚕丝脱胶的方法为将蚕茧剪碎后置于na2co3溶液中，沸水煮浴至茧丝表面丝胶脱落，干燥得脱胶蚕丝。

本发明中，所述na2co3溶液的质量分数为0.5％。

本发明中，所述溴化锂的浓度为9.3mol/l，所述硝酸银加入量按加入后硝酸银终浓度为4mg/ml。

本发明中，所述原位合成纳米银的条件为在光照下反应24h。

本发明中，所述干燥为在37～65℃下干燥12小时或自然干燥至丝素-纳米银/pva薄膜形成。

2、由所述制备方法制得的丝素纳米银/pva抗菌薄膜。

3、所述丝素纳米银/pva抗菌薄膜在制备抗菌包装材料中的应用。

有益效果在于：本发明提供了丝素纳米银/pva抗菌薄膜的制备方法，制备方法简单，绿色环保，制得的丝素-纳米银/pva具有较好的力学性能和疏水性能、良好的抗菌性和稳定性，有望用于抗菌包装材料等相关抗菌材料领域。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1检测丝素蛋白的提取情况：a为uv-vis检测丝素蛋白中肽键和芳香族氨基酸的吸收；b为荧光检测丝素蛋白中酪氨酸内源荧光吸收；

图2纳米稳定性检测：a为丝素-纳米银的酸碱稳定性检测；b为丝素-纳米银的高温稳定性检测；c为丝素-纳米银的热稳定性检测；d为丝素-纳米银的冷冻稳定性检测；

图3丝素-纳米银和丝素-纳米银/pva检测，a丝素-纳米银uv-vis检测、b丝素纳米银/pva的frsem检测、c丝素纳米银/pva检测，d丝素-纳米银/pva的eds检测。

图4丝素-纳米银/pva薄膜检测；a为丝素-纳米银/pva薄膜tga检测，b为丝素-纳米银/pva薄膜ft-ir检测。

图5丝素-纳米银/pva薄膜力学性能检测；a为丝素纳米银/pva薄膜的拉伸强度；b为丝素纳米银/pva薄膜的伸长率；

图6为丝素纳米银/pva薄膜接触角检测。

图7丝素纳米银/pva薄膜的抑菌曲线测试：a为抑制大肠杆菌，b为抑制金黄色葡萄球菌。

图8丝素纳米银/pva薄膜的抑菌圈测试：a为抑制大肠杆菌、b为抑制金黄色葡萄球菌。

图9丝素-纳米银/pva薄膜在不同酸碱环境下的稳定性：a为酸性环境下的稳定性(ph＝4)，b为中性环境下的稳定性(ph＝7.4)，c为碱性环境下的稳定性(ph＝10)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1

丝素纳米银/pva抗菌薄膜的制备方法，包括如下步骤：

(1)蚕丝脱胶：取10g蚕茧剪成小碎片，按浴比为1:30置于na2co3(0.5％)溶液中，沸水煮浴30min使茧丝表面的丝胶脱落，将脱胶后的茧丝自然干燥得到脱胶蚕丝；

(2)丝素溶液制备：将步骤(1)制得的脱胶蚕丝加入溴化锂溶液(9.3mol/l)中使丝素完全溶解，然后将溶解的丝素溶液倒入透析袋中，透析48h除去溴化锂，得到的丝素蛋白；

(3)丝素-纳米银溶液的制备：将步骤(2)制得的丝素蛋白配制成浓度为2％(wt)的溶液，然后加入硝酸银溶液至硝酸银浓度为4mg/ml，在光照下反应24h，得到丝素-纳米银溶液；

(4)丝胶纳米银/pva薄膜的制备：将制备好的丝素-纳米银溶液(2％)与pva溶液(2％)按体积比为4：1均匀混合得到混合溶液，将混合溶液反复冻融2次后得到丝素-纳米银/pva凝胶，最后在65℃烘箱中放置12h后得到丝素-纳米银/pva薄膜。

实施例2

丝素纳米银/pva抗菌薄膜的制备方法，包括如下步骤：

(1)蚕丝脱胶的制备：取10g蚕茧剪成小碎片，按浴比为1:30置于na2co3(0.5％)溶液中，沸水煮浴30min使茧丝表面的丝胶脱落，将脱胶后的茧丝自然干燥得到脱胶蚕丝；

(2)丝素溶液制备：将步骤(1)制得的脱胶蚕丝加入溴化锂溶液(9.3mol/l)中使丝素完全溶解，然后将溶解的丝素溶液倒入透析袋中，透析48h除去溴化锂，得到的丝素蛋白；

(3)丝素-纳米银溶液的制备：将步骤(2)制得的丝素蛋白配制成浓度为2％(wt)的溶液，然后加入硝酸银溶液至硝酸银浓度为4mg/ml，在光照下反应24h，得到丝素-纳米银溶液；

(4)丝胶纳米银/pva薄膜的制备：将制备好的丝素-纳米银溶液(2％)与pva溶液(2％)按体积比为4:2均匀混合得到混合溶液，将混合溶液反复冻融4次后得到丝素-纳米银/pva凝胶，最后在37℃烘箱中放置12h后得到丝素-纳米银/pva薄膜。

实施例3

丝素纳米银/pva抗菌薄膜的制备方法，包括如下步骤：

(1)蚕丝脱胶的制备：取10g蚕茧剪成小碎片，按浴比为1:30置于na2co3(0.5％)溶液中，沸水煮浴30min使茧丝表面的丝胶脱落，将脱胶后的茧丝自然干燥得到脱胶蚕丝；

(2)丝素溶液制备：将步骤(1)制得的脱胶蚕丝加入溴化锂溶液(9.3mol/l)中使丝素完全溶解，然后将溶解的丝素溶液倒入透析袋中，透析48h除去溴化锂，得到的丝素蛋白；

(3)丝素-纳米银溶液的制备：将步骤(2)制得的丝素蛋白配制成浓度为2％(wt)的溶液，然后加入硝酸银溶液至硝酸银浓度为4mg/ml，在光照下反应24h，得到丝素-纳米银溶液；

(4)丝胶纳米银/pva薄膜的制备：将制备好的丝素-纳米银溶液(2％)与pva溶液(2％)按体积比为4：4均匀混合得到混合溶液，将混合溶液反复冻融4次后得到丝素-纳米银/pva凝胶，最后室温中放置干燥至得到丝素-纳米银/pva薄膜。

上述实施例中，丝素-纳米银和聚乙烯醇的质量分数在1～5％范围内均可实现发明目的。

图1为检测丝素蛋白的提取情况，a为uv-vis检测丝素蛋白中肽键和芳香族氨基酸的吸收；b为荧光检测丝素蛋白中酪氨酸内源荧光吸收，结果表明丝素蛋白提取成功。

图2为纳米稳定性检测，a为丝素-纳米银分别在ph5.0、ph7.4和ph10.0条件下的稳定性，结果表明丝素-纳米银在酸性和碱性条件下均稳定；b为丝素-纳米银在50℃、75℃和100℃高温条件下的稳定性，结果表明丝素-纳米银在高温中稳定性好；c为丝素-纳米银在37℃、50℃和65℃的长达到15天的稳定性，结果表明丝素-纳米银具有长时间的热稳定性，d为丝素-纳米银在-196℃、-80℃和-20℃冷冻下的稳定性，结果表明丝素-纳米银冷冻稳定性好。

图3为丝素-纳米银检测结果，a为丝素-纳米银uv-vis检测结果，b为丝素-纳米银/pva的frsem检测，c为丝素-纳米银/pva检测，d为丝素-纳米银/pva的eds检测，结果表明纳米银成功在丝素蛋白表面合成。

图4为丝素-纳米银/pva检测结果，a为丝素纳米银/pva薄膜tga检测结果表明纳米银的生成以及合成纳米银丝素/pva薄膜的热稳定性有所提高，b为丝素纳米银/pva薄膜ft-ir检测。结果表明pva与丝素纳米银混合均匀。

图5为丝素-纳米银/pva薄膜力学性能检测，a为丝素纳米银/pva薄膜的拉伸强度、b为丝素-纳米银/pva薄膜的伸长率；结果表明pva加入丝素纳米银能提高丝素纳米银的拉伸强度和伸长率，并且随着pva添加量增加，拉伸强度和伸长率增加。

图6为丝素纳米银/pva薄膜接触角检测；结果表明，pva与丝素纳米银共混后水触角增加，表明丝素纳米银/pva薄膜具有较好的疏水性性。

丝素纳米银/pva薄膜抗菌检测实验：

1.生长曲线实验

本发明通过对自然生长的细菌和加入丝素/pva薄膜、丝素纳米银/pva薄膜的细菌生长曲线进行对比，从而确定丝素纳米银/pva薄膜的抗菌效果，具体方法为：

(1)分别取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的单菌落接种于灭菌的100mllb液体培养基(ph7.4)中，在转速为220rpm、温度为37℃条件下培养12小时；

(2)分别取步骤(1)活化的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌悬液100μl加入到8mllb培养基中，每种菌液准备5组，其中一组为空白组，其余4组分别加入丝素/pva薄膜、丝素纳米银/pva薄膜(4：1)、丝素纳米银/pva薄膜(4：2)、丝素纳米银/pva薄膜(4：4)，然后在温度为37℃条件下培养，并在0h、2h、4h、6h、8h、12h、18h、24h时取菌悬液0.5ml，于4℃冰箱保藏；

(3)待培养24小时的菌悬液取样后将不同时间取出的菌悬液从4℃冰箱中取出，室温(18-25℃)下放置20-40min后利用紫外分光光度计检测其在600nm处的光吸收值，根据测得的吸收值分别绘制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长曲线，结果如图7所示。分析丝素/pva薄膜、丝素纳米银/pva薄膜对细菌生长的影响，结果显示，添加丝素纳米银/pva薄膜的丝胶薄膜后，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长均受到了明显抑制，表明本发明制备的丝素纳米银/pva薄膜具有优异的抗菌性能。

1.抑菌圈实验

为进一步确定丝素纳米银/pva薄膜的抗菌作用，利用抑菌圈的方法测试了丝素-纳米银/pva薄膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果。具体方法如下：

(1)分别取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的单菌落接种于灭菌的100mllb液体培养基(ph7.4)中，在转速为220rpm、温度为37℃条件下培养10小时；

将步骤(1)活化的菌悬液稀释100倍后取200-300μl加入lb固体培养基表面，并在转速为220rpm的摇床中培养1-2小时，使稀释液均匀分布在琼脂培养基表面；

(2)取直径为1cm的丝胶凝胶、丝素纳米银/pva薄膜，平铺在稀释液分布均匀的lb培养基表面；然后在37℃条件下培养12h，结果如图8所示。结果显示，在放置有丝胶凝胶的lb培养基中，接种大肠杆菌的培养基和接种金黄色葡萄球菌的培养基上没有形成明显的抑菌圈，表明丝胶/pva薄膜本身对大肠杆菌的生长没有抑制作用，而在包含丝素纳米银/pva薄膜lb培养基中，都观察到形成了一定的抑菌圈，表明丝素纳米银/pva薄膜具有抑菌能力。

图9为丝素纳米银/pva薄膜在不同酸碱环境下的稳定性：(a)为酸性环境下的稳定性(ph＝4)、(b)为中性环境下的稳定性(ph＝7.4)、(c)为碱性环境下的稳定性(ph＝10)。结果表明，丝素纳米银/pva薄膜在不同酸碱环境下稳定性好。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。