一种乳制品中耐热菌的检测方法与流程

本发明属于检测乳制品品质的技术领域，具体为一种乳制品中耐热菌的检测方法。

背景技术：

乳制品中经过巴氏消毒扔能存活的菌为耐热菌，牛乳产品在热灭菌过程中，大多数细菌都会被灭杀，但仍会有耐热菌的存在，尤其是能够形成芽孢的耐热性细菌，会对灭菌牛乳的品质造成很大危害，也可引起人的食物中毒，当人体摄入含有大量活菌的食品时即可能引起呕吐、腹泻、肠绞痛等为主要症状的食物中毒，一般在食品中含有10⁵～10⁸个/g活菌时就可能引起食物中毒。

所以，耐热菌污染是目前困扰着乳品企业的一大难题。分析乳品中耐热菌的种类有助于分析污染源，为乳制品生产中耐热菌的控制提供理论基础和指导。而现有技术采用微生物鉴定方法中生理生化方法来对乳制品中的耐热菌检测，该种方法的缺陷为试剂种类繁杂，时间较长，费用较高。故在乳制品行业中，打破耐热菌对乳制品品质影响的瓶颈，寻找出更为快速、可商业化推广的检测耐热菌的方法成为了行业内丞待解决的问题。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供了一种乳制品中耐热菌的检测方法，其实现的目的为，检测方法步骤少，显著提高检测的速度和准确率。

为了实现上述目的，本发明公开的技术方案为：本发明提供的一种乳制品中耐热菌的检测方法，包括如下步骤，(1)将乳制品加热，分离出耐热菌；

(2)培养计数步骤(1)分离出的耐热菌；

(3)选取步骤(2)中形态典型的菌落划线分离培养；

(4)分别对培养出的耐热菌提取DNA，对提取出的DNA采用PCR测序检测出耐热菌。

本发明采用的方法，检测步骤少，检测方法简便、检测时间缩短，采用对耐热菌DNA测序，使检测结果精确度更高。

进一步的，所述步骤(1)中对乳制品加热的温度为80-100℃、加热时间为5-20min。多数乳制品中的细菌在80℃都会被灭杀掉，剩下的即为耐热菌。

进一步的，所述步骤(2)中采用LB固体培养基培养耐热菌，培养的温度为37℃、时间为48h。该调节给耐热菌提供良好的生长环境，供后续检测。

进一步的，所述步骤(3)中分离培养时所用的培养基为LB固体培养基，培养的温度为37℃、时间为48h。

进一步的，所述步骤(4)中对耐热菌DNA测序的方法为，将提取的耐热菌DNA作为模板，通过PCR步移方法获得16SrRNA上游序列，再采用PCR测序。

本发明所采用的PCR步移方法，例如公开号为CN103397028A的专利中介绍的方法，用一条半随机通用引物与一条16S RNA中的特异引物配对，通过一轮PCR扩增出部分16S RNA序列以及16S RNA的上游序列。最后测序比对鉴定，采用此种方法分辨率较高，能区分相近种属的细菌，而常规的细菌测序方法包括：16S RNA测序技术，有时难以区分相近细菌的种属。

16S rRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中。16S rRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列足够长(包含约50个功能域)。随着PCR技术的出现及核酸研究技术的不断完善，16S rRNA基因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工具。数据库的不断完善，应用该技术可以实现对病原菌进行快速、微量、准确简便地分类鉴定和检测。该技术主要有三个步骤：首先是基因组DNA的获得，其次是16S rRNA基因片段的获得，最后是进行16S rRNA基因序列的分析。

采用上述的具体方法PCR测序，精确度进一步提高，且使操作方法更为简便、省时省力。

进一步的，所述步骤(4)中PCR程序为95℃预变性5min，35个循环：95℃30s，55℃30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸5min。在该条件下，可分别扩增出耐热菌的特异性产物，用以准确的检测出多种耐热菌。

进一步的，所述步骤(4)中对提取出的DNA采用PCR测序，检测耐热菌的方法为，对PCR产物割胶纯化、测序，将所测得的序列在NCBI基因数据库中做BLAST，对检测出的耐热菌鉴定。可进一步确定分离出来的菌落名称、类别，对分离出的耐热菌做出进一步的确定。

本发明的积极进步效果在于：可以准确鉴定乳制品中的耐热菌种类与数量，检测方法步骤简洁，操作方便，缩短检测时间，并且采用DNA测序方法，提高了菌种鉴定的速度与分辨率。

附图说明

图1为实施例二从乳制品中分离培养得到的四种耐热菌；

图2为实施例二耐热菌基因DNA电泳图，其中，M：DNA Marker DL 10000；N：阴性对照，a、b、c、d为四种不同的耐热菌；

图3为实施例二耐热菌基因PCR电泳图，其中，M：DNA Marker DL 10000；N：阴性对照，a、b、c、d为四种不同的耐热菌；

图4为实施例三中发酵乳中的耐热菌；

图5为实施例三中耐热菌PCR电泳图，其中，M：DNA Marker DL 10000；a为发酵乳中耐热菌扩增产物。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。

实施例一：本发明提供的一种乳制品中耐热菌的检测方法，包括如下步骤，(1)将乳制品加热，分离出耐热菌；

(2)培养计数步骤(1)分离出的耐热菌；

(3)选取步骤(2)中形态典型的菌落划线分离培养；

(4)分别对培养出的耐热菌提取DNA，对提取出的DNA采用PCR测序，检测出耐热菌。

上述方法步骤中对乳制品的加热温度、耐热菌的培养以及PCR测序均可采用任何一种现有技术，只要保证培养出耐热菌，能对耐热菌DNA测序即可，DNA是区分菌类最精准的手段，故本发明方法准确度高。

实施例二：本发明提供的一种乳制品中耐热菌的检测方法，包括如下步骤，(1)将乳制品加热，分离出耐热菌：加热的温度为80℃、加热时间为5min；

(2)培养计数步骤(1)分离出的耐热菌：采用LB固体培养基培养耐热菌，培养的温度为37℃、时间为48h；

(3)选取步骤(2)中形态典型的菌落，划线分离培养；如图1所示培养出的四种菌落。

(4)分别对培养出的耐热菌提取DNA，对提取出的DNA采用PCR测序，检测出耐热菌：将提取的耐热菌DNA作为模板，通过PCR步移方法获得16SrRNA上游序列，PCR程序为95℃预变性5min，35个循环：95℃30s，55℃30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸5min，对PCR产物割胶纯化、测序，将所测得的序列在NCBI基因数据库中做BLAST，对检测出的耐热菌鉴定。如图2耐热菌基因组DNA电泳图所示，图3耐热菌基因PCR结果电泳图所示，M：DNA Marker DL 10000；N：阴性对照。箭头所示的条带被割胶纯化并测序。最后，BLAST分析，耐热菌分别为枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌。

所述LB固体培养基，倒制时培养基温度不宜过高，否则冷却后平板会产生大量冷凝水。

LB(Luria-Bertani)固体培养基

在950ml ddH2O中加入

胰化蛋白胨(tryptone)10g；

酵母提取物(yesat extract)5g；

NaCl 10g。

用1M的NaOH调节pH值到7.0，定容至1L。

然后加入15g琼脂粉。

121℃，20min高压灭菌，待冷却至50-60℃时，倒制平板。

倒制时培养基温度不宜过高，否则冷却后平板会产生大量冷凝水。

所述提取DNA的方法采用技术即可，所述PCR产物割胶纯化均采用的是现有技术。

实施例三：本发明提供的一种乳制品中耐热菌的检测方法，包括如下步骤，(1)以过期的发酵乳当作样品，将样品加热，分离出耐热菌：加热的温度为100℃、加热时间为20min；

(2)培养计数步骤(1)分离出的耐热菌：采用LB固体培养基培养耐热菌，培养的温度为37℃、时间为48h；过期发酵乳中的耐热菌如图4所示，箭头圈起来的是耐热菌放大图。

(3)选取步骤(2)中形态典型的菌落，划线分离培养；分离后分别采用LB固体培养基培养耐热菌，培养的温度为37℃、时间为48h。

(4)分别对培养出的耐热菌提取DNA，对提取出的DNA采用PCR测序，检测出耐热菌：将提取的耐热菌DNA作为模板，通过PCR步移方法获得16SrRNA上游序列，PCR程序为95℃预变性5min，35个循环：95℃30s，55℃30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸5min，对PCR产物割胶纯化、测序，将所测得的序列在NCBI基因数据库中做BLAST，对检测出的耐热菌鉴定。如图5耐热菌基因PCR结果电泳图所示，M：DNA Marker DL 10000；a为发酵乳中耐热菌扩增产物。箭头所示的条带被割胶纯化并测序。

所述LB固体培养基，倒制时培养基温度不宜过高，否则冷却后平板会产生大量冷凝水。

LB(Luria-Bertani)固体培养基

在950ml ddH2O中加入

胰化蛋白胨(tryptone)10g；

酵母提取物(yesat extract)5g；

NaCl 10g。

用1M的NaOH调节pH值到7.0，定容至1L。

然后加入15g琼脂粉。

121℃，20min高压灭菌，待冷却至50-60℃时，倒制平板。

倒制时培养基温度不宜过高，否则冷却后平板会产生大量冷凝水。

所述提取DNA的方法采用技术即可，所述PCR产物割胶纯化均采用的是现有技术。

实施例四：本发明提供的一种乳制品中耐热菌的检测方法，包括如下步骤，(1)将乳制品加热，分离出耐热菌：加热的温度为90℃、加热时间为15min；

(2)培养计数步骤(1)分离出的耐热菌：采用LB固体培养基培养耐热菌，培养的温度为37℃、时间为48h；

(3)选取步骤(2)中形态典型的菌落，划线分离培养；分离后分别采用LB固体培养基培养耐热菌，培养的温度为37℃、时间为48h。

(4)分别对培养出的耐热菌提取DNA，对提取出的DNA采用PCR测序，检测出耐热菌：将提取的耐热菌DNA作为模板，通过PCR步移方法获得16SrRNA上游序列，PCR程序为95℃预变性5min，35个循环：95℃30s，55℃30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸5min，对PCR产物割胶纯化、测序，将所测得的序列在NCBI基因数据库中做BLAST，对检测出的耐热菌鉴定。

所述LB固体培养基，倒制时培养基温度不宜过高，否则冷却后平板会产生大量冷凝水。

LB(Luria-Bertani)固体培养基

在950ml ddH2O中加入

胰化蛋白胨(tryptone)10g；

酵母提取物(yesat extract)5g；

NaCl 10g。

用1M的NaOH调节pH值到7.0，定容至1L。

然后加入15g琼脂粉。

121℃，20min高压灭菌，待冷却至50-60℃时，倒制平板。

倒制时培养基温度不宜过高，否则冷却后平板会产生大量冷凝水。

所述提取DNA的方法采用技术即可，所述PCR产物割胶纯化均采用的是现有技术。

本发明所采用的PCR步移方法，例如公开号为CN103397028A的专利中介绍的方法，用一条半随机通用引物与一条16S RNA中的特异引物配对，通过一轮PCR扩增出部分16S RNA序列以及16S RNA的上游序列。最后测序比对鉴定，采用此种方法分辨率较高，能区分相近种属的细菌，而常规的细菌测序方法包括：16S RNA测序技术，有时难以区分相近细菌的种属。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。