一种核酸提取方法及其提取试剂与流程

技术领域：

本发明涉及一种生物检测方法及其试剂，特别涉及一种核酸提取方法及其提取试剂。

背景技术：

现有的核酸提取试剂与方法主要有酚－氯仿抽提法、碱裂解法、ctab抽提法、磁珠法、二氧化硅基质法等，利用这些方法在提取核时，大多需要温浴、抽提、转管、清洗、离心等步骤，需要转门的仪器设备，同时需时约40分钟－2小时，另外容易造成样本间污染。

为了解决核酸提取步骤繁琐、耗时长、样本间易交叉污染的问题，为现场或仪器设备不全的实验室提供简单快速的核酸提取试剂与方法，本发明提供一种核酸提取方法及其提取试剂，本发明的方法可以实现核酸提取在5分钟内完成，达到节约时间的目的；另外只需要一管式核酸提取，不转管。达到避免交叉污染的目的。

技术实现要素：

本发明提供一种核酸提取方法，所述方法包括以下步骤：

样本与提取试剂按比例混匀，于85-95℃裂解3-5min，裂解期间弹匀1-2次；待颗粒沉降后，上清即为释放的核酸；其中所述提取试剂包括：tris，edta，3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、np－40，tween-20,chelex-100，水；其中tris的浓度为5-10mm；edta的浓度为5-10mm；3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸的体积百分含量浓度为0.005％-0.02％；np－40的百分含量浓度为0.01％－0.2％；tween-20体积百分含量浓度为0.01-0.2％；chelex-100的体积含量为1－20％；所述提取试剂ph为6－9。

根据本发明的方法，对于鼻咽拭子、肛拭子、痰液、唾液、血清、血浆、全血、尿液类样本，直接取样与提取试剂按比例混匀，于90℃裂解4min，裂解期间弹匀1次。

根据本发明的方法，对于干血斑、精斑样本，先用1×te溶解后混匀，与提取试剂按比例混匀，90℃裂解4min，裂解期间弹匀1次。

根据本发明的方法，对于粪便样本：建议水样便采取200μl，成形便采取黄豆大小的粪量，加入500μl生理盐水，5000rpm离心2min，转移30－50μl上清至另一干净、无核酸酶的ep管中。13000rpm离心1-2min，弃上清，沉淀中加入50μl核酸提取液，漩涡震荡20s，90℃裂解4min，裂解期间弹匀1次。待颗粒沉降后，上清即为释放的核酸，可以进行后续的pcr扩增。

其中，样本与提取试剂的体积比为50:10-50

本发明进一步提供一种提取试剂，包括以下组分：tris，edta，3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、np－40，tween-20,chelex-100，水(优选depc水)。其中tris的浓度为5-10mm；edta的浓度为5-10mm；3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸的体积百分含量浓度为0.005％-0.02％；np－40的百分含量浓度为0.01％－0.2％；tween-20体积百分含量浓度为0.01-0.2％；chelex-100的体积含量为1－20％；所述提取试剂ph为6－9。

本发明提取试剂的配制方法如下：

先用水溶解tris与edta，tris的浓度为5-10mm；edta的浓度为5-10mm；调ph到6－9，tris与edta溶液中加入3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸，使体积百分含量浓度为0.005％-0.02％；加入np－40，使百分含量浓度为0.01％－0.2％；加入tween-20，使体积百分含量浓度为0.01-0.2％；加入chelex-100，使体积含量为1－20％，混合均匀即得。

本发明进一步提供一种试剂盒，包括以下试剂：tris，edta，3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、np－40，tween-20,chelex-100，水(优选depc水)。其中tris的浓度为5-10mm；edta的浓度为5-10mm；3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸的体积百分含量浓度为0.005％-0.02％；np－40的百分含量浓度为0.01％－0.2％；tween-20体积百分含量浓度为0.01-0.2％；chelex-100的体积含量为1－20％；所述提取试剂ph为6－9。

本发明所述的试剂盒，包括：盒体、盒体内的试剂，试剂槽，说明书，所述试剂放置在试剂槽中。

本发明的试剂盒，各试剂分别包装，优选使用包装管，每个包装管中装入试剂的量以够一个样本使用量为基本量，可以扩大到10个，100个，1000个样本的使用量。

本发明通过几种表面活性剂的组合，开发了一种核酸快速提取试剂，快速核酸提取试剂适用于鼻咽拭子、肛拭子、痰液、唾液、粪便、尿、真菌、细菌、病毒培养液、全血、干血斑、血清、血浆、精斑、环境样本等多种样本类型。各种样本与提取试剂进行不同比例的混合，通过加热，使细胞膜破裂，蛋白质变性，杂质与变性蛋白被吸附，核酸释放，实现了核酸的快速提取，提取的核酸可以直接进行后续的pcr扩增。减少了实验操作的步骤与难度，从而降低了核酸提取的时间成本与试剂成本，减少了样本间的污染机会。同时，本方法对实验条件方面无特殊的要求，适合现场与设备稍差的实验室。

本发明的试剂配方是经过筛选获得的，筛选过程如下：

表1，组分的选择：

注：(+表示有，－表示无)

本发明试剂组合在以上4组中选择，所有的试剂都是由depc水溶解或定容，由浓盐酸或1mnaoh调溶液的ph，选择结果显示，第四组荧光信号值最高，ct值最小。

表2，组分浓度的选择：

如表2所示8个浓度组合，通过提取手足口咽拭子，并进行病原扩增，发现组合7、8效果相当，比1-6组合灵敏度高，ct值小，荧光信号值高。经过以上筛选结果，得到本发明试剂组合7或8并将其用于核酸提取，其优点在于：

1、极大的节约了操作者的时间成本：既往的核酸提取基本都需要温浴、清洗、转管等步骤，耗时约40分钟－2小时，本发明只需4分钟就能完成核酸提取。

2、节约成本：既往的核酸提取需磁粒子或硅基质膜柱子或化学试剂，需要大型的离心机等设备，成本相对较高，本发明只需一些缓冲液及表面活性剂，单人份成本较低，另外只需一个水浴锅或金属浴就可以。

3、避免样本污染：核酸提取过程不需要转管等步骤，避免样本交叉污染。

附图说明

图1用本发明提取的手足口病毒咽拭子rna扩增的结果

图2用国产磁珠法提取的手足口病毒咽拭子rna扩增的结果

图3用进口硅基质膜法提取的手足口病毒咽拭子rna扩增的结果

图4用本发明提取的血清dna扩增的结果

图5用国产磁珠法提取的血清dna扩增的结果

图6用进口硅基质膜法提取血清的dna扩增的结果

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

核酸快速提取试剂配制：

先用depc水溶解tris与edta，tris的浓度为5-10mm；edta的浓度为5-10mm；调ph到6－9，tris与edta溶液中加入，在3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸，体积百分含量浓度为0.005％-0.02％；加入np－40，百分含量浓度为0.01％－0.2％；加入tween-20，体积百分含量浓度为0.01-0.2％；加入chelex-100，体积含量为1－20％。

实施例2：

手足口病毒咽拭子核酸提取与荧光定量pcr扩增

核酸提取的步骤：取12例咽拭子样本分别用国产的磁珠方法(cz)、进口的硅基质膜(gj)及本发明的提取试剂(kt)进行提取，

本发明快速(kt)试剂提取核酸步骤：

1)取30μl拭子样本加入到50μl提取液中，90℃裂解4min，裂解期间弹匀1次。取出室温放置至颗粒沉降，上清为得到的核酸。

国产磁珠(cz)法试剂提取核酸步骤：

1)取200μl病毒液至1.5ml离心管(自备)中。

2)向离心管中加入15μl磁珠悬浮液g。

3)向离心管中加入20μlproteinasek。

4)向样本中加入300μlcarrierrna工作液，盖上管盖，振荡混匀10sec。

5)室温孵育10min，期间每3min上下颠倒混匀10sec，使磁珠和核酸充分结合。简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。

6)将离心管放置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附时小心去除液体。

7)将离心管从磁力架上取下，加入500μl漂洗液pwc，振荡混匀1min。

8)将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，小心吸去液体。

9)将离心管从磁力架上取下，加入500μl漂洗液pwe，振荡混匀1min。

10)将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，小心吸去液体。

11)重复步骤9和10一次。12.离心管于磁力架上，56℃晾干5-10min。

13)将离心管从磁力架上取下，加入100μlrnase-freeddh2o，56℃振荡混匀5min。14)将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附后，小心将核酸溶液转移至一个新离心管(自备)中，并于适当条件保存。

进口的硅基质膜(gj)提取核酸方法：

1)向离心管中加入200μl咽拭子。同时加入20μlproteinasek。

2)加入200μlcarrierrna工作液

3)在56℃孵育15min。简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。

4)加入250μl无水乙醇，此时可能会出现絮状沉淀。盖上管盖并涡旋振荡15sec，彻底混匀。在室温(15-25℃)放置5min。

5)简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。

6)仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至rnase-free吸附柱cr2(吸附柱放在收集管中)，盖上管盖，8,000rpm(～6,000×g)离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

7)小心打开吸附柱盖子，加入500μl溶液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，盖上管盖，8,000rpm(～6,000×g)离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管。

8)小心打开吸附柱盖子，加入600μl溶液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，盖上管盖，静置2min，8,000rpm(～6,000×g)离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管。

9)重复步骤8。

10)小心打开吸附柱盖子，加入500μl无水乙醇，盖上管盖，8,000rpm(～6,000×g)离心1min，弃废液。

11)将吸附柱放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心3min，使吸附膜完全变干，弃废液。

12)将吸附柱放入一个rnase-free离心管(1.5ml)中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干。

13)向吸附膜的中间部位悬空滴加20-150μlrnase-freeddh2o，盖上盖子，室温放置5min。12,000rpm(～13,400×g)离心1min。荧光定量pcr扩增：

采用北京金豪制药股份有限公司生产的“肠道病毒通用型病毒rna检测试剂盒(荧光pcr法)”试剂盒进行扩增，具体扩增步骤按说明书进行。其扩增结果ct值见表1，扩增的图片见图1－3。

表1上述三种提取试剂荧光pcr扩增结果

实施例3:

血清核酸提取及hbv荧光定量pcr扩增

核酸提取的步骤：取10例血清样本分别用国产的磁珠方法(cz)、进口的硅基质膜(gj)及本发明的提取试剂(kt)进行提取。

本发明快速(kt)试剂提取核酸步骤：

1)取10μl血清样本加入到50μl提取液中，90℃裂解4min，裂解期间弹匀1次。取出室温放置至颗粒沉降，上清为得到的核酸。

进口的硅基质膜(gj)及本发明的提取试剂(kt)进行提取按实施例2的步骤进行。

hbv核酸扩增用北京金豪制药股份有限公司生产的“乙肝病毒核酸检测试剂盒(荧光pcr法)”试剂盒进行扩增。具体扩增步骤按说明书进行。其扩增结果ct值见表2，扩增的图片见图4－6。