本发明涉及一种提取高纯度橙黄酮的方法，具体涉及一种从猫须草中提取橙黄酮含量≥98%产品的方法。
背景技术：
猫须草（clerodendranthusspicathus(thunb.)c.y.wu）为唇形科，肾茶属植物，原名肾茶，又名猫须公、牙努秒等。猫须草为多年生草本植物，生于林下阴凉潮湿处，主要分布于印度尼西亚、马来西亚等东南亚地区，我国主产于广东、广西、云南、福建及台湾等。猫须草是一种药食两用的植物，性凉，味苦，气清香。
猫须草具有显著的药理疗效，现代药理研究证明，猫须草的药理功能主要体现在以下几个方面：利尿排石、凉血、消炎；改善肾脏功能；抗氧化；消炎抗菌；治疗糖尿病；降血压；抗肿瘤等。猫须草的化学成分主要为黄酮类、酚酸类及萜类等，其中，黄酮类以多甲基取代为主，为脂溶性成分，而水溶性性成分以酚酸居多。
橙黄酮（sinensetin）是猫须草黄酮类成分中的一种，化学名：5,6,7,3’,4’-五甲氧基黄酮，分子式：c20h20o7，分子量：372.27，分子结构式如下：
橙黄酮微溶于水，易溶于甲醇、乙醇及乙酸乙酯等有机溶剂。
cn101143160a公开了一种肾茶提取物及制备方法和用途，是将肾茶用乙醇回流提取，后经大孔吸附树脂分离纯化，获得含肾茶酚酸50～85%的提取物。该方法使用d-101树脂纯化，虽能获得高含量的肾茶酚酸，但优越树脂的选择性较差，最终获得的产品是肾茶酚酸和黄酮类的混合物，不能获得高纯产品。
cn103127214a公开了一种治疗糖尿病肾病的肾茶有效部位及其制备方法，是将肾茶使用30～80%的乙醇回流提取2次，然后大孔吸附树脂纯化，从而获得肾茶总黄酮50%以上提取物，该提取物主要由佩兰素、橙黄酮、3’-羟基-5,6,7,4’-四甲氧基黄酮等甲氧基黄酮类组成，得到产品可与现有可知的食品、药物赋形剂混合通过剂型制备工艺，制成具有治疗糖尿病肾病的药物、食品及保健品。该方法工艺简单，虽可获得肾茶总黄酮提取物，但只是一种粗品，并没有提到或解决从中提取高纯度橙黄酮的技术。
cn105687309a公开了一种猫须草药效成分的萃取方法，是先将猫须草原料烘干，破碎过筛，再使用超临界co2对原料进行萃取，萃取温度为40～60℃，萃取压力15～25mpa，萃取时间60～120min，夹带剂为乙醇，夹带剂加入量为萃取釜体积1/10～1/20。该萃取工艺主要对猫须草中的熊果酸、迷迭香酸和齐墩果酸的萃取效果较好，并没有公开对猫须草中橙黄酮的萃取效果，而且采用超临界co2技术对原料直接萃取，渗透率较低，有效成分的提取也较低。
cn104072464a公开了一种橙黄酮提取分离方法，是使用香藜为原料，加生物酶酶解8～10h，酶解原料，再用60～80%乙醇溶液微波或超声提取2～3次，提取液浓缩至浸膏，加适量水分散后用大孔吸附树脂分离纯化，树脂型号为nk-9、ads-21和hpd-417，先用水洗脱，再用50～70%乙醇洗脱，洗脱液浓缩后用溶液制备型液相色谱分离，流动相为30～40%乙腈。该方法采用先酶解，再使用60～80%乙醇提取方法，虽然一定程度上提高了橙黄酮的提取率，但由于橙黄酮在水中有一定的溶解性，酶解又在水溶液中进行，会增大橙黄酮的损耗。且大孔吸附树脂虽可以起到很好的分离效果，但由于其选择性较差，洗脱浓缩液不经过进一步纯化，直接使用制备型液相色谱分离，对制备色谱填料污染较大，增大后续纯化的难度，而且产品质量稳定性较差。
cn104193710a公开了一种橙黄酮的制备方法及其在抗白血病药物中的运用，是取香藜地上部分，用饱和1%氨水浸泡2～6h，晒干，用85～95%乙醇溶液为提取溶剂，加入闪式提取容器中提取，提取液过滤浓缩，经氧化铝柱层析纯化，氯仿-丙酮混合溶液洗脱，再经制备型液相色谱分离得到橙黄酮。该方法使用闪式提取器，具有提取时间短，提取率高等优点，但是存在生产连续性较差的缺陷，且使用85～95%的高浓度乙醇会提取出大量脂溶性杂质，比如叶绿素、挥发油等，回收完溶剂后，会产生大量沉淀，导致后续氧化铝层析分离纯化效果较差。
综上，现有技术主要是针对猫须草中的总酚酸类和总黄酮类的分离纯化，没有对猫须草中橙黄酮的纯化分离进行研究，而目前市场上的猫须草提取物都对橙黄酮有0.2～98%的含量要求，需求量较大，市场前景广阔，亟待寻找一种从猫须草中提取高纯度橙黄酮的方法。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种工艺简单、成本低，选择性好，所得产品纯度、回收率高，适用于工业化生产的从猫须草中提取高纯度橙黄酮的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种从猫须草中提取高纯度橙黄酮的方法，包括以下步骤：
（1）提取、浓缩、过滤：将猫须草破碎，过筛，置于提取溶剂中连续逆流提取，冷却，过滤，真空回收滤液中的溶剂，过滤，得浓缩液；
（2）氧化铝柱层析分离纯化：将步骤（1）所得浓缩液上氧化铝柱层析，先用水洗至水洗脱液无色，再先后用低度醇水溶液和高度醇水溶液进行洗脱，分别收集洗脱液并真空回收洗脱液中的醇，得酚酸类浸膏和黄酮类浸膏；
（3）超临界co2萃取：将步骤（2）所得黄酮类浸膏进行超临界co2萃取，得萃取浸膏；
（4）制备液相色谱分离纯化：将步骤（3）所得萃取浸膏用甲醇溶解，进样至制备液相设备中，然后用洗脱剂进行洗脱，并收集目标洗脱液，减压浓缩，真空干燥，得高纯度橙黄酮产品。
本发明方法所用原料为猫须草地上茎叶，橙黄酮的质量含量为0.05～0.15%。
优选地，步骤（1）中，所述过筛的目数为20～60目。
优选地，步骤（1）中，所述提取的温度为40～80℃，提取的时间为2～4h。
优选地，步骤（1）中，猫须草原料与提取溶剂的质量体积比（kg/l）为1:8～20（更优选1:10～15）。
优选地，步骤（1）中，所述提取溶剂为体积分数20～70%（更优选30～50%）的甲醇水溶液或体积分数30～60%（更优选40～55%）的乙醇水溶液。猫须草中主要含有酚酸类和黄酮类两大成分，其中的橙黄酮在水中具有一定溶解性，所以宜用醇提，但醇浓度不宜太高，因为猫须草原料为地上茎叶，大部分为叶子，若醇度太高了会导致大量脂溶性杂质成分比如叶绿素，被提取出来，回收完溶剂后，将产生大量沉淀物，对后续过滤及纯化不利，而使用体积分数20～70%的甲醇水溶液或体积分数30～60%的乙醇水溶液提取，则可在保证高提取率的条件下又可避免此问题。
优选地，步骤（1）中，所述连续逆流提取设备为串联连续逆流提取设备，可串联两套以上使用，提高生产效率；所述提取液用过板式换热器进行冷却。
优选地，步骤（1）中，所述逆流提取后的溶液，用100～400目滤网过滤。
优选地，步骤（1）中，所述真空回收的温度为40～70℃，压力为-0.10～-0.07mpa，回收至固含量为5～10%；所述真空回收的设备为单效浓缩器、双效浓缩器或三效浓缩器。
优选地，步骤（1）中，所述真空回收后的溶液，用陶瓷膜或超滤膜过滤。
优选地，所述陶瓷膜的孔径为0.2～1.0μm（更优选0.4～0.6μm），过滤的膜压为1～4mpa，温度为30～60℃（更优选35～45℃）。
优选地，所述超滤膜为高分子材料超滤膜，分子量为0.5～10万道尔顿（更优选2～6万道尔顿），过滤的膜压为1～3mpa，温度为10～30℃。
优选地，步骤（2）中，所述低度醇水溶液的体积分数为20～30%，所述高度醇水溶液的体积分数为60～80%。先用水洗脱可以去除水溶性杂质，氧化铝柱层析可以有效分离粗提物中的酚酸类和黄酮类物质，由于酚酸类物质极性较大，而黄酮类物质极性较小，所以可以先用体积分数20～30%的极性较大的溶剂洗脱酚酸类物质，后用体积分数60～80%极性较小的溶剂洗脱黄酮类物质以达到分离效果，而现有大孔吸附树脂由于选择性较差的问题，很难实现酚酸类和黄酮类物质分离，得到的是混合物。高度醇水溶液洗脱后的洗脱液，经真空回收洗脱液中的醇，即得黄酮类浸膏。
优选地，步骤（2）中，所述低度醇水溶液或高度醇水溶液中的醇为甲醇或乙醇。
优选地，步骤（2）中，所述洗脱的流速为0.5～2.0bv/h。
优选地，步骤（2）中，所述真空回收的温度为40～70℃，压力为-0.10～-0.07mpa，回收至固含量为60～80%。
优选地，步骤（2）中，所述氧化铝为酸性氧化铝或中性氧化铝（更优选中性氧化铝），目数为80～300目（更优选100～200目）。
优选地，步骤（2）中，所述氧化铝装柱的径高比为1:4～12。
优选地，步骤（2）中，使用前，先将氧化铝在110～600℃（更优选400～580℃）的高温条件下，活化4～24h（更优选10～20h）后，再用体积分数85～99%的乙醇清洗至流出液无色透明，且除乙醇味外无其它气味为止，最后用水洗至无乙醇味。
优选地，步骤（3）中，所述超临界co2萃取的压力为30～40mpa，萃取的温度为30～45℃，萃取≥2次，每次萃取的时间为2～4h。所得黄酮类浸膏含有较深颜色且橙黄酮纯度较低，如果直接用制备型高效液相色谱分离，对填料污染较大，处理批次会大大减少，所得产品的质量稳定性较差，尤其是颜色及纯度指标，会导致产品颜色较深，纯度和收率偏低。黄酮类浸膏中的颜色物质主要为残留的水溶性较好的酚酸类物质，使用超临界co2萃取既可以有效分离酚酸类物质也可以提高橙黄酮的纯度，因此，在使用制备型液相色谱分离前使用超临界co2萃取则可以有效解决上述问题。
优选地，步骤（3）中，所述黄酮类浸膏与萃取co2流体的质量体积比（kg/l）为1:8～30（更优选1:10～20），超临界co2萃取所用夹带剂的用量为萃取co2流体体积的20～60%，所述夹带剂为体积分数80～95%的甲醇或乙醇（更优选乙醇）。
优选地，步骤（4）中，所述萃取浸膏用甲醇溶解后的质量浓度为40～80%（更优选45～60%）。
优选地，步骤（4）中，所述制备液相色谱的填料为c-18键合硅胶，装柱径高比为1:4～10。所述制备液相色谱为中低压色谱柱。
优选地，步骤（4）中，所述洗脱剂为乙腈-水或甲醇-水，所述乙腈-水的体积比为40～70:60～30，甲醇-水的体积比为30～90:70～10（更优选50～80:50～20）。
优选地，步骤（4）中，洗脱的次数≥1次，洗脱的流速为0.25～1.00bv/h。
优选地，步骤（4）中，所述减压浓缩的温度为40～80℃，压力为-0.10～-0.08mpa，浓缩至固含量为40～60%。
优选地，步骤（4）中，所述真空干燥的温度为60～80℃，压力为-0.10～-0.07mpa，干燥至含水率≤3%。
本发明方法用水优选纯水。
本发明方法的有益效果如下：
（1）本发明方法通过采用氧化铝柱层析、超临界co2萃取及高效制备液色谱技术进行有机的技术，使得产品纯化效果明显，从猫须草中提取的橙黄酮产品呈纯白色，纯度≥98.5%，收率≥91%；
（2）本发明方法使用的是连续逆流提取设备，并且串联两套连续逆流设备，既保证了工业化生产的连续性，同时在保证提取收率的前提下，提取溶剂用量由原来提取罐相当于原料用量的30～40倍降低到10～20倍，能耗、成本低；
（3）本发明方法采用了氧化铝柱层析、超临界co2萃取和制备型高效液相色谱相结合的技术，相比现有氧化铝柱层析或大孔树脂吸附与制备型高效液相色谱分离结合的技术，具有较明显的优势：由于大孔树脂吸附具有选择性差的缺陷，较难分离酚酸类和黄酮类物质，而本发明方法利用酚酸类和黄酮类极性由大到小的特性，使用氧化铝柱层析可以实现很好的分离效果；但是，由于氧化铝柱层析所获得的也仅仅只是黄酮类粗品，含有一定色素杂质，若黄酮类浸膏经氧化铝柱层析或大孔树脂吸附后，直接用制备型高效液相色谱分离，对填料污染较大，处理批次会大大减少，所得产品的质量稳定性较差，尤其是颜色及纯度指标，会导致颜色较深，纯度和收率偏低，本发明方法通过进一步结合超临界co2萃取，利用超临界流体co2的超强的渗透能力，使得橙黄酮的萃取效率更高，纯化效果更好，收率更高，既可以有效分离酚酸类物质，又可提高橙黄酮的纯度，相比有机溶剂萃取技术，超临界co2萃取技术操作简洁，自动化程度高，溶剂损耗低，生产周期短，从而极大的降低了生产成本；
（4）本发明方法工艺简单、成本低，选择性好，适于工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例所使用的猫须草为市售；本发明实施例所使用的原料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
参考例1
氧化铝的预处理：先将市售100～200目的中性氧化铝在550℃的高温条件下，活化18h后，再用体积分数95%的乙醇清洗至流出液无色透明，且除乙醇味外无其它气味为止，最后用水洗至无乙醇味。
实施例1
（1）提取、浓缩、过滤：将100kg猫须草（橙黄酮的质量含量为0.0615%）破碎，过20目筛，置于1000l体积分数30%的甲醇水溶液中，用2套串联的连续逆流提取设备，在50℃下，连续逆流提取2h，用过板式换热器冷却，先用200目滤网过滤，再用单效浓缩器，在60℃，真空度-0.09mpa下，真空回收滤液中的甲醇至浓缩液固含量为5%，然后用孔径0.5μm的陶瓷膜，在膜压3mpa，35℃下过滤，得浓缩液；
（2）氧化铝柱层析分离纯化：将步骤（1）所得浓缩液上氧化铝柱层析（使用参考例1活化后的中性氧化铝为填料，装柱径高比为1:4），先用纯水洗至水洗脱液无色，然后先用体积分数20%的乙醇水溶液以0.5bv/h的流速洗脱，再用体积分数70%的乙醇水溶液以1.0bv/h的流速洗脱，分别收集洗脱液，并在60℃，压力-0.09mpa下，分别真空回收洗脱液中的乙醇至浓缩液固含量为80%，得酚酸类浸膏和黄酮类浸膏；
（3）超临界co2萃取：将步骤（2）所得黄酮类浸膏在30mpa，30℃下，超临界co2萃取4次，每次萃取的时间为2h，得3.8kg萃取浸膏；所用萃取co2流体的体积为40l，夹带剂为体积分数80%的乙醇，用量为20l；
（4）制备液相色谱分离纯化：将步骤（3）所得3.8kg萃取浸膏用5l甲醇溶解（萃取浸膏的质量浓度为49.0%），进样至中低压色谱柱的制备液相设备（填料为c-18键合硅胶，装柱径高比为1:4）中，再用体积比40:60的乙腈-水，以流速0.25bv/h洗脱2次，并收集目标洗脱液，然后在70℃，-0.09mpa下，减压浓缩至固含量为40%，最后在80℃，-0.095mpa下，真空干燥至含水率≤3%，得56.83g高纯度橙黄酮产品。
本实施例所得高纯度橙黄酮产品外观呈纯白色，经hplc检测，橙黄酮的纯度为98.5%，收率为91.05%。
实施例2
（1）提取、浓缩、过滤：将100kg猫须草（橙黄酮的质量含量为0.0736%）破碎，过40目筛，置于1500l体积分数50%的乙醇水溶液中，用2套串联的连续逆流提取设备，在60℃下，连续逆流提取3h，用过板式换热器冷却，先用300目滤网过滤，再用三效浓缩器，在70℃，真空度-0.09mpa下，真空回收滤液中的乙醇至浓缩液固含量为7%，然后用0.5μm孔径的陶瓷膜，在膜压4mpa，40℃下过滤，得浓缩液；
（2）氧化铝柱层析分离纯化：将步骤（1）所得浓缩液上氧化铝柱层析（使用参考例1活化后的中性氧化铝为填料，装柱径高比为1:6），先用纯水洗至水洗脱液无色，然后先用体积分数30%的乙醇水溶液以0.5bv/h的流速洗脱，再用体积分数60%的乙醇水溶液以0.5bv/h的流速洗脱，分别收集洗脱液，并在70℃，压力-0.09mpa下，分别真空回收洗脱液中的乙醇至浓缩液固含量为75%，得酚酸类浸膏和黄酮类浸膏；
（3）超临界co2萃取：将步骤（2）所得黄酮类浸膏在35mpa，40℃下，超临界co2萃取2次，每次萃取的时间为3h，得4.3kg萃取浸膏；所用萃取co2流体的体积为50l，夹带剂为体积分数90%的乙醇，用量为10l；
（4）制备液相色谱分离纯化：将步骤（3）所得4.3kg萃取浸膏用6l甲醇溶解（萃取浸膏的质量浓度为47.5%），进样至中低压色谱柱的制备液相设备（填料为c-18键合硅胶，装柱径高比为1:6）中，再用体积比60:40的乙腈-水，以流速0.5bv/h洗脱2次，并收集目标洗脱液，然后在70℃，-0.09mpa下，减压浓缩至固含量为50%，最后在80℃，-0.095mpa下，真空干燥至含水率≤3%，得70.36g高纯度橙黄酮产品。
本实施例所得高纯度橙黄酮产品外观呈纯白色，经hplc检测，橙黄酮的纯度为99.1%，收率为94.76%。
实施例3
（1）提取、浓缩、过滤：将100kg猫须草（橙黄酮的质量含量为0.0697%）破碎，过60目筛，置于1000l体积分数50%的甲醇水溶液中，用2套串联的连续逆流提取设备，在40℃下，连续逆流提取4h，用过板式换热器冷却，先用400目滤网过滤，再用三效浓缩器，在70℃，真空度-0.09mpa下，真空回收滤液中的甲醇至浓缩液固含量为10%，然后用5万道尔顿的高分子材料超滤膜，在膜压2mpa，20℃下过滤，得浓缩液；
（2）氧化铝柱层析分离纯化：将步骤（1）所得浓缩液上氧化铝柱层析（使用参考例1活化后的中性氧化铝为填料，装柱径高比为1:8），先用纯水洗至水洗脱液无色，然后先用体积分数20%的乙醇水溶液以1.0bv/h的流速洗脱，再用体积分数70%的乙醇水溶液以0.5bv/h的流速洗脱，分别收集洗脱液，并在60℃，压力-0.09mpa下，分别真空回收洗脱液中的乙醇至浓缩液固含量为80%，得酚酸类浸膏和黄酮类浸膏；
（3）超临界co2萃取：将步骤（2）所得黄酮类浸膏在40mpa，45℃下，超临界co2萃取2次，每次萃取的时间为2h，得5.2kg萃取浸膏；所用萃取co2流体的体积为100l，夹带剂为体积分数95%的乙醇，用量为20l；
（4）制备液相色谱分离纯化：将步骤（3）所得5.2kg萃取浸膏用4.8l甲醇溶解（萃取浸膏的质量浓度为57.8%），进样至中低压色谱柱的制备液相设备（填料为c-18键合硅胶，装柱径高比为1:8）中，再用体积比70:30的甲醇-水，以流速0.25bv/h洗脱2次，并收集目标洗脱液，然后在70℃，-0.09mpa下，减压浓缩至固含量为55%，最后在70℃，-0.095mpa下，真空干燥至含水率≤3%，得65.34g高纯度橙黄酮产品。
本实施例所得高纯度橙黄酮产品外观呈纯白色，经hplc检测，橙黄酮的纯度为98.8%，收率为92.56%。