利用EST‑SSR引物鉴定栀子品种的方法及应用与流程

本发明涉及分子生物学分子标记技术领域，特别是涉及一种利用est-ssr引物鉴定栀子品种的方法及应用。

背景技术：

栀子(gardeniajasminoidesellis)为茜草科(rubiaceae)栀子属(gardenia)常绿灌木，以果实入药，具泻火除烦、清热利尿、凉血解毒的功效。栀子是我国传统的大宗药材，已有2000多年的应用历史，主产江西、湖南，重庆、四川、湖北、浙江、安徽、福建、广西等省市也常见栽培。江西省黄栀子人工种植高峰时面积超过26667公顷，是当地重要的生态经济产业之一。由于生长环境的不同，加上长期的人工栽培和选育，使其习性、花、叶的形状及大小、果实的形状及大小等均发生一些变异，出现了很多优良的农家栽培品种和类型，可大致分为染用桅子、药用桅子和观赏桅子三大类型。目前人们仅凭外观形态来对栀子不同品种类型进行区分，药用栀子统称为山栀子，花单瓣，果实个头较小，果实单价较高；染用栀子统称为水栀子，花单瓣，果实个头较大，色素含量高，以作染料为主，不堪药用，果实单价较低；观赏栀子统称为栀子花，花重瓣，花大，不结果，作为园林观赏。以花、果等外观形态区分栀子品种受植株年龄限制，在栀子幼苗期很难有效可靠的进行区分，栀子花只开花不结果，水栀子市场价格不到山栀子市场价格的一半，如果等到种植的栀子开花结果后才发现不是想要的品种，势必造成极大的损失。

随着分子生物学技术的发展，采用dna分子标记在基因水平对栀子品种进行鉴定成为可能，相对于表型性状鉴定法，dna分子标记技术对栀子品种的鉴定更为准确有效，且突破了植株年龄的限制，为栀子品种幼苗期的鉴定提供了准确可靠的方法。目前尚未有关于est-ssr分子标记用于对栀子主栽品种进行区分鉴定的方法及应用报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，本发明的一方面提供一种利用est-ssr引物鉴定栀子品种的方法，能够对栀子品种进行快速、有效的鉴定。本方法采用的是普通引物进行扩增并用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，与荧光标记引物的毛细管电泳检测方法相比更经济实惠易于操作。

一种利用est-ssr引物鉴定栀子品种的方法，包括：

步骤一，提取供试品种样品的dna；

步骤二，利用est-ssr引物进行pcr扩增反应，所述est-ssr引物为14对，其序列如下：

步骤三，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；

步骤四，est-ssr谱带分析，构建分子标记指纹图谱。

本发明的有益效果为：该利用est-ssr引物鉴定栀子品种的方法，能够对栀子品种进行快速、有效的鉴定，且鉴定结果不易受植株年龄的影响，能准确区分幼苗期栀子品种，可对目前种植发展规模较大的色素用水栀子、药用山栀子品种进行快速、有效的区分鉴定。

上述利用est-ssr引物鉴定栀子品种的方法，其中，所述步骤一具体包括：

从变色硅胶保存的叶片中提取总基因组dna，具体操作步骤如下：

1)在10ml离心管中加入4mlctab提取液，在65℃水浴锅中预热30min，加入75ul巯基乙醇；

2)取干燥叶片0.5～1.5g，剪除叶片主脉并剪碎后将材料置于干净研钵中，加入适量液氮并迅速多次研磨成细粉末状，后用药匙迅速将粉末刮拢并转至盛有预热ctab提取液的10ml离心管中，用封口膜将离心管口封密以防止β-巯基乙醇挥发，然后将离心管放回水浴锅中保温30min～45min，其间不时轻晃几次，使样品粉末和提取液充分接触均匀，得混合液；

3)取出10ml所述混合液置于离心管，将其置于冰水混合物中迅速冷却至室温，立即加入等体积的4ml氯仿-异戊醇，所述氯仿-异戊醇的体积比为24:1，轻轻摇晃充分混合均匀使其成乳状液，然后保持4℃条件下12000rpm离心10min，轻轻将上清液吸取500ul于1.5ml离心管中，即刻放于-20℃冰箱中备用；

4)取出盛有500ul上清液的1.5ml离心管，加入100ul硅珠悬浮液，使用涡旋振荡器振荡大约15s，使之充分混匀，于室温静置10min后，再振荡约5s，尔后8000rpm离心15s，除去上清液即得硅珠-核酸复合物；

5)将盛有硅珠-核酸复合物的离心管用镊子规律叩打，结合涡旋振荡器使复合物打成液状，使之完全成分散状，再加入guscn漂洗液750ul，再用振荡器充分涡旋混匀，后8000rpm离心15s，弃上清液；

6)按步骤5)重复漂洗一次；

7)将盛有硅珠-核酸复合物的离心管用镊子规律叩打，使复合物打成液状，加入70％的乙醇1ml，再充分涡旋混匀，尔后8000rpm离心15s，弃掉上清液；

8)按步骤7)重复漂洗一次；

9)将复合物用镊子再次打成液状，加入无水乙醇1ml，充分涡旋混匀，之后8000rpm离心15s，弃掉上清液；接着将1.5ml离心管盖子打开，倒置在铺有吸水纸倾斜的纸板上，室温风干约1～2h；

10)盛有风干复合物的1.5ml离心管中加入150ulte缓冲液，用镊子规律叩打充分混匀后，于56℃水浴中保温10min，尔后12000rpm离心5min，用枪头吸取100ul上清液即为所需的dna粗提溶液，将做好标号的各样品dna粗提液配制成工作液，浓度约50ng/ul，4℃保存备用；

11)dna粗提液通过uv分光光度计测定产量及纯度；并采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用lamdahindⅲmarker作为标准分子量。

上述利用est-ssr引物鉴定栀子品种的方法，其中，所述步骤二具体包括：

将14对所述ssr引物用于pcr扩增反应，所有的pcr扩增反应程序由pcr扩增仪执行，并经优化筛选出适宜栀子的est-ssr标记反应体系和程序；

其反应体系为：10ul中含1.5ul浓度为50ng/ul的模板dna，1ul10×buffer，0.6ul浓度为25mm的mgcl2，0.8ul浓度为10mm的dntps，0.3ul浓度为10um的f-primer，0.3ul浓度为10um的r-primer，0.1ul浓度为5u/ul的taq酶，5.4ulddh2o；

其反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，共15个循环；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共15个循环；72℃延伸10min；10℃保持；pcr扩增反应结束后，加入上样缓冲液6ul，充分混匀，置于4℃冰箱中备用。

上述利用est-ssr引物鉴定栀子品种的方法，其中，所述步骤三具体包括：

采用8％聚丙烯酰胺凝胶，在垂直电泳槽中进行电泳分离，50bpmarker作为标准分子量标记片段大小，电泳产物经银染后对各位点进行数据判读，其中，银染步骤为：将加好缓冲液的pcr产物用枪头于点样孔上样0.9ul，150v恒压电泳1.5～2h后，拆卸电泳槽，将短板剥离，带胶长板用于固定染色；固定10min，其中固定液为10％乙醇，0.5％纯乙酸，ddh2o漂洗2次，每次1min；再用0.15％agno3染色8～15min，ddh2o漂洗2次，每次2min；然后将带胶玻璃板放入显影液中显影至扩增条带清晰为止，固定、漂洗、显影均在摇床上进行，将玻璃板用自来水清洗两次，置于胶片观察灯上，最后用数码照相拍照记录。

上述利用est-ssr引物鉴定栀子品种的方法，其中，所述步骤四具体包括：

用14对所述est-ssr引物分别对不同栀子品种进行est-ssr扩增，得到不同栀子品种的14个est-ssr扩增产物；电泳检测不同栀子品种14个est-ssr扩增产物，若不同栀子品种中某两个栀子品种的14个est-ssr扩增产物中至少5个扩增带型不同，则该两个栀子品种为不同品种；若不同栀子品种中某两个栀子品种的14个est-ssr扩增产物中小于5个扩增带型不同，则该两个栀子品种为相同品种。

上述利用est-ssr引物鉴定栀子品种的方法，其中，所述步骤四具体包括：

用14对所述est-ssr引物对分别对不同栀子品种进行est-ssr扩增，得到不同栀子品种的14个est-ssr扩增产物；电泳检测所述不同栀子品种14个est-ssr扩增产物，将所述不同栀子品种的14个est-ssr扩增产物分别以“1”表示条带有，且“0”表示条带无，构建14个分子标记指纹图谱，每个分子标记指纹图谱对应1个est-ssr扩增产物和1个引物对；若不同栀子品种中某两个栀子品种的14个分子指纹图谱中至少5个不同，则该两个栀子品种为不同品种；若不同栀子品种中某两个栀子品种的14个分子指纹图谱中小于5个不同，则该两个栀子品种为相同品种。

本发明的另一方面还提供一种上述方法的应用，通过14对所述est-ssr引物pcr扩增后进行est-ssr谱带分析，对供试栀子品种与已知栀子品种进行品种鉴定。

本发明的另一方面还提供一种上述方法的应用，通过14对所述est-ssr引物pcr扩增后进行est-ssr谱带分析，构建栀子品种指纹图谱。

附图说明

图1是est-ssr引物egj019对栀子品种前1-16份样品的pcr扩增电泳检测结构图；

图2是est-ssr引物egj019对栀子品种后17-39份样品的pcr扩增电泳检测结构图；

图3是est-ssr引物egj026对栀子品种前1-16份样品的pcr扩增电泳检测结构图；

图4是est-ssr引物egj026对栀子品种后17-39份样品的pcr扩增电泳检测结构图；

图5是est-ssr引物egj134对栀子品种前1-16份样品的pcr扩增电泳检测结构图；

图6是est-ssr引物egj134对栀子品种后17-39份样品的pcr扩增电泳检测结构图；

图7是39份栀子样品间的亲缘关系树状图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的若干实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本实施例中，首先选取栀子品种材料39份，栀子品种取样材料具体如表1，每个品种1～5份样本，取样方法、样品保存方法均采用现有技术，在此不予赘述。

表1栀子品种取样材料

步骤一，提取供试品种样品的dna：

本实施例中，采用改进的ctab裂解-硅珠吸附法从变色硅胶保存的叶片中提取总基因组dna，具体操作步骤如下：

1)在10ml离心管中加入4mlctab提取液(ctab浓度为0.1g/l，pvp浓度为0.5g/l，nacl1.4mol/l，edta20mmol/l(ph8.0)，tris-hcl100mmol/l(ph8.0))，在65℃水浴锅中预热30min，加入75ul巯基乙醇；

2)取干燥叶片2～4片(约0.5～1.5g)，剩余叶片材料放回自封袋中备用，剪除叶片主脉并剪碎后将材料置于干净研钵中，加入适量液氮并迅速多次研磨成细粉末状，后用药匙迅速将粉末刮拢并转至盛有预热ctab提取液的10ml离心管中，用封口膜将离心管口封密以防止β-巯基乙醇挥发，然后将离心管放回水浴锅中保温30min～45min，其间不时轻晃几次，使样品粉末和提取液充分接触均匀，得混合液；

3)取出10ml所述混合液置于离心管，将其置于冰水混合物中迅速冷却至室温，立即加入等体积的4ml氯仿-异戊醇(24:1，v/v)，轻轻摇晃充分混合均匀使其成乳状液，然后保持4℃条件下12000rpm离心10min，轻轻将上清液吸取500ul于1.5ml离心管中，即刻放于-20℃冰箱中备用；

4)取出盛有500ul上清液的1.5ml离心管，加入100ul硅珠(sio2)悬浮液，使用涡旋振荡器振荡大约15s，使之充分混匀，于室温静置10min后，再振荡约5s，尔后8000rpm离心15s，除去上清液即得硅珠-核酸复合物；

5)将盛有硅珠-核酸复合物的离心管用镊子规律叩打，结合涡旋振荡器使复合物打成液状，使之完全成分散状，再加入guscn漂洗液750ul，再用振荡器充分涡旋混匀，后8000rpm离心15s，弃上清液；

6)按步骤5)重复漂洗一次；

7)将盛有硅珠-核酸复合物的离心管用镊子规律叩打，使复合物打成液状，加入70％的乙醇1ml，再充分涡旋混匀，尔后8000rpm离心15s，弃掉上清液；

8)按步骤7)重复漂洗一次；

9)将复合物用镊子再次打成液状，加入无水乙醇1ml，充分涡旋混匀，尔后8000rpm离心15s，弃掉上清液；接着将1.5ml离心管盖子打开，倒置在铺有吸水纸倾斜的纸板上，室温风干约1～2h；

10)盛有风干复合物的1.5ml离心管中加入150ulte缓冲液，用镊子规律叩打充分混匀后，于56℃水浴中保温10min，尔后12000rpm离心5min。用枪头吸取100ul上清液即为所需的dna粗提溶液。将做好标号的各样品dna粗提液配制成工作液，浓度约50ng/μl，4℃保存备用；

11)dna粗提液通过uv分光光度计(nd-1000，thermoelectroncorporation)测定产量及纯度；并采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，lamdahindⅲmarker(mbifermentas，shenzhen，guangdong，china)作为标准分子量。

步骤二，利用est-ssr引物进行pcr扩增反应，所述est-ssr引物为14对，其序列如下：

表214对est-ssr引物

所有的pcr扩增反应程序由eppendorf5331梯度pcr扩增仪(eppendorf,hamburg,germany)执行，并经优化筛选出适宜栀子的est-ssr标记反应体系和程序。其反应体系为：10ul中含1.5ul模板dna(50ng/ul)，1ul10×buffer(mg²⁺free)，0.6ulmgcl2(25mm)，0.8uldntps(10mm)，0.3ulf-primer(10um)，0.3ulr-primer(10um)，0.1ultaq酶(5u/ul)(takarabioinc.,otsu,shiga,japan)，5.4ulddh2o。反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，63℃退火30s(每循环降低1℃)，72℃延伸30s，共15个循环；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共15个循环；72℃延伸10min；10℃保持。pcr扩增反应结束后，加入上样缓冲液(0.25％溴酚兰，15％聚蔗糖)6ul，充分混匀，置于4℃冰箱中备用。

步骤三，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析：

采用8％聚丙烯酰胺凝胶(50ml灌胶液中含10ml40％胶(丙烯酰胺:甲叉丙烯酰胺＝39:1(w/w)，尿素21g，6.25ml10×tbe，350μlaps，50μltemed)，在垂直电泳槽中进行电泳分离，50bpmarker(tiangen，beijing，china)作为标准分子量标记片段大小，电泳产物经银染后对各位点进行数据判读。银染步骤为：将加好缓冲液的pcr产物用枪头于点样孔上样0.9μl，150v恒压电泳1.5～2h后，拆卸电泳槽，将短板剥离，带胶长板用于固定染色；固定10min(固定液10％乙醇，0.5％纯乙酸(v/v))，ddh2o漂洗2次，每次1min；再用0.15％agno3(w/v)染色8～15min，ddh2o漂洗2次，每次2min；然后将带胶玻璃板放入显影液中(配100ml需加1.5gnaoh，1ml0.756％的四硼酸钠，0.75ml甲醛)显影至扩增条带清晰为止。固定、漂洗、显影均在摇床上进行。将玻璃板用自来水清洗两次，置于胶片观察灯上，最后用数码照相拍照记录。引物egj19、egj26、egj134对栀子39份品种样品的pcr扩增电泳检测结果见图1至图6。

步骤四，est-ssr谱带分析：

est-ssr属于共显性标记，同一引物对不同模板的扩增产物如果在电泳迁移率一致，即被认为是同一位点，即具有同源性。对所得的图片采用多人判读比对方式对胶图数据进行判读，按条带长度大小从大到小用a、b、c、d、e…进行编号，即最上面的等位基因条带为a，读带结果如ab、bc等，若某一个样本只有一条带，读带结果则为aa、bb等等。同时统计各位点条带的片段大小，方便数据数值转换，条带分析完毕之后把所有的结果根据软件格式要求输入相应软件进行实验的数据处理与统计分析。

用14对所述est-ssr引物分别对不同栀子品种进行est-ssr扩增，得到不同栀子品种的14个est-ssr扩增产物；电泳检测不同栀子品种14个est-ssr扩增产物，若不同栀子品种中某两个栀子品种的14个est-ssr扩增产物中至少5个扩增带型不同，则该两个栀子品种为不同品种；若不同栀子品种中某两个栀子品种的14个est-ssr扩增产物中小于5个扩增带型不同，则该两个栀子品种为相同品种。

此外，还可以采用以下分析方法：

用14对所述est-ssr引物对分别对不同栀子品种进行est-ssr扩增，得到不同栀子品种的14个est-ssr扩增产物；电泳检测所述不同栀子品种14个est-ssr扩增产物，将所述不同栀子品种的14个est-ssr扩增产物分别以“1”表示条带有，且“0”表示条带无，构建14个分子标记指纹图谱，每个分子标记指纹图谱对应1个est-ssr扩增产物和1个引物对；若不同栀子品种中某两个栀子品种的14个分子指纹图谱中至少5个不同，则该两个栀子品种为不同品种；若不同栀子品种中某两个栀子品种的14个分子指纹图谱中小于5个不同，则该两个栀子品种为相同品种。

本实施例中，14对所述est-ssr引物均在供试栀子品种样品中得到了较好的多态扩增。10个栀子品种和1个栀子栽培原种共39份材料，以遗传距离矩阵为分析对象，利用ntsys-pc2.1软件按不加权成组配对法(upgma)进行聚类分析，请参阅图7，建立了10个栀子品种和1个栀子栽培原种共39份材料间的亲缘关系树状。从聚类结果来看，除栽培栀子即山栀子5个样本、金福水栀3个样本及大花栀子未完全聚集在一起，尤其是金福水栀3个样本聚类较为分散，其他8个品种各样本均聚集在一起。其中宽棱水栀显示和其他品种亲缘关系最远，荷花栀子显示和太湖山栀、白蟾亲缘关系较近，球果栀子显示和山栀子亲缘关系较近，小白蟾显示和水栀子亲缘关系较近，大花栀子、雀舌栀子聚类显示则较为独立。

本发明的实施例提供了上述方法的应用，通过14对所述est-ssr引物pcr扩增后进行est-ssr谱带分析，对供试栀子品种与已知栀子品种进行品种鉴定。

此外，本发明的实施例还提供了上述方法的应用，具体为通过14对所述est-ssr引物pcr扩增后进行est-ssr谱带分析，构建栀子est-ssr指纹图谱。

根据多态引物扩增的电泳结果，采用在相同迁移率位置上有带记为“1”，无带记为“0”的读带方法，以14个est-ssr标记构建栀子10个品种的指纹图谱，具体可参见表3，由3可见，引物egj15和egj19多态性最为丰富，它们组合一起基本可以把10个栀子品种区分开，其他引物通过3个或3个以上组合一起也可以完成对栀子所有品种的区分。

表310个栀子品种14个est-ssr标记的指纹图谱

本发明提供的利用est-ssr引物鉴定栀子品种的方法，能够对栀子品种进行快速、有效的鉴定，且鉴定结果不易受植株年龄的影响，能准确区分幼苗期栀子品种，可对目前种植发展规模较大的色素用水栀子、药用山栀子品种进行快速、有效的区分鉴定。可使种植企业、农户避免遭受种植错误品种的重大损失，且基于上述方法建立的栀子est-ssr指纹图谱对栀子品种间区别具有重要意义。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。