一种RAD测序筛选中国大鲵雌性特异片段及遗传性别检测方法与流程

本发明属于中国大鲵分子标记和遗传性别鉴定技术领域，更具体涉及一种RAD测序筛选中国大鲵雌性特异片段及遗传性别检测方法,它适用于在大鲵繁育及性控育种中应用的遗传性别鉴定。

背景技术：

中国大鲵(Andrias davidianus)别名“娃娃鱼”，是全球现存最大的淡水两栖动物。上世纪八十年代， 野生大鲵被列为国家Ⅱ级重点保护有尾两栖类动物（叶昌媛 等，1993）。此外，中国大鲵也是一种食用与药用价值极高的经济动物，风味独特，具有滋阴补肾、补血行气的功效（张神虎, 2001），被誉为“水中人参”（侯进慧 等, 2004）。为保护和利用大鲵资源，国内科技工作者开始探索大鲵人工繁殖技术，通过近30余年的探索研究，大鲵人工繁殖已取得初步成功（刘鉴毅 等，1999）。近年来，随着大鲵人工繁育技术的不断成熟与完善，大鲵养殖业也应运而生，并逐渐向规模化、集约化发展，成为一项新兴养殖业。2006年我国人工养殖子二代大鲵合法商品化出售这一法令的颁布也进一步加快了大鲵养殖业的发展。为进一步促进产业发展与物种保护，自2015年6月1日起，农业部建立大鲵标识管理制度和可追溯体系，取消《经营利用许可证》与《运输许可证》，该法令的颁布为大鲵的经营与运输提供了更加便捷的方式。然而，要做好大鲵的人工繁育工作，亲本培育是所有环节中的重中之重，因此，如何区别大鲵亲本性别进行针对性培养显得尤为重要。此外，参繁亲本需要合理的性比搭配，并且注射催产剂时，雌雄亲本剂量与效应时间各不相同。大鲵进行性别鉴定是一个公认的难题，而对接近繁殖期大鲵性别鉴定主要有以下一些方法：大鲵头部来进行雌雄区别（欧东升 等 2007），行为学上对大鲵性别进行区分（梁刚 等，2010），还有些学者，通过观察大鲵泄殖孔的特征来鉴别性别，还有利用超声技术鉴定大鲵性别（雷宇杰，2016）。以上方法准确率不高或是实际操作中难度较大，价格昂贵。因此，如果能准确而又简单鉴定大鲵的性别将会对大鲵繁殖工作提供巨大帮助，进而提高大鲵产量，带来巨大的经济效益。

简化基因组测序技术（Restriction association site DNA, RAD-seq）是一种利用酶切技术、序列捕获芯片技术或其他实验手段降低物种基因组复杂程度，进而研究基因组各类遗传结构性变异的技术手段。利用简化基因组测序筛选性别特异标记已在多个物种研究中被采用。如Gamble 利用RAD测序筛选到黄黑平鲉（Sebastes chrysomelas）与肉色平鲉(Sebastes carnatus) 性别特异标记（Gamble， 2016）。Gamble与Zarkower采用RAD测序序列与基因组序列比对筛选到绿安乐蜥（Anolis carolinensis），牙买加灰蜥蜴（Anolis lineatopus）与棕安乐蜥(Anolis Sagrei)雄性特异特异分子标记（Gamble and Zarkower，2014）。Kafkas 等利用RAD测序，发现33757个候选性别特异SNP标记，选取其中38个进行验证，8个为性别特异标记，并推出阿月浑子（Pistacia vera L.）为ZZ/ZW性别决定型（Kafkas et al., 2015）。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供了一种鉴定大鲵遗传性别的方法，方法准确、易行、价格低廉且操作简便，通过RAD测序技术分别扫描大鲵雌雄基因组池，雌雄RAD数据进行比对，获得雌性特异候选RAD数据与雄性特异候选RAD数据,将这些RAD数据分别进行denovo组装，将获得的雌性特异候选片段作为参考基因组与雄性基因组数据比对，获得雌性特异候选片段308，随机选取部分进行雌雄验证，获得了雌性特异标记adF324和adF225，建立了一种大鲵遗传性别鉴定方法，解决了目前生产上对大鲵性别鉴定的难题，也为后续大鲵性别控制和单性苗种培育奠定基础。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

其技术构思是：A、中国大鲵雌性特异片段的筛选；B、中国大鲵遗传性别鉴定的PCR方法。

一种RAD测序筛选中国大鲵雌性特异片段及遗传性别检测方法，其步骤是：

A、中国大鲵雌性特异片段的筛选：

1）RAD测序技术扫描大鲵雌雄基因组池与数据分析：通过基因组DNA提取，酶切，建库，测序等获得大鲵雌雄基因组RAD数据，对雌雄基因组RAD数据进行分析，获得雌雄特异候选RAD数据，将数据进行组装后获得大鲵雌雄基因组特异片段。大鲵雌性特异片段与大鲵雄性基因组数据比对，获得雌性特异候选片段；

2）候选雌性特异片段的验证：挑选部分雌性特异候选片段并设计引物，以5雌5雄个体DNA为模板进行PCR扩增。将能扩增出预期大小片段，且只有雌性个体有特异条带，雄性个体无条带为特异标记；

3）雌性特异片段的序列分析：将特异片段克隆到PMD-18T载体（该载体为常规T克隆载体）中，连接、转化后用常规方法（分子生物学教科书）检测阳性克隆，送样测序。将获得5个个体阳性克隆测序结果进行序列比对，同源性达到96%以上，Genebank数据库比对结果显示，未找到同源序列；

B、中国大鲵遗传性别鉴定的PCR方法：

根据之前克隆验证的测序特异片段：adF324和adF225，分别设计引物adF324a，adF324s，adF225a与adF225s，分别提取大鲵雌性个体24尾，雄性个体24尾基因组DNA并作为模板，进行PCR扩增。能扩增出特异条带为遗传雌性个体，扩增不出特异条带为遗传雄性个体。

通过以上措施，获得了两个大鲵雌性特异标记adF324和adF225，能通过分子生物学方法鉴定大鲵遗传性别，建立了大鲵遗传性别鉴定技术，解决了大鲵性别鉴定的难题，并为大鲵性别鉴定提供了一种简单可行的技术方法，也为性控育种开辟了新的技术途径，对单性育种具有重要意义和应用价值。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：本发明首次筛选获得了中国大鲵雌性特异片段，进行了序列分析，设计了雌性特异引物进行鉴定，对大鲵雌性个体24尾，雄性个体24尾进行PCR扩增验证准确率达100%。首次建立了大鲵遗传性别鉴定技术。该技术具有准确、快速、简单、灵敏等优点，为大鲵性别鉴定提供一种简单可行的技术方法，也为性控育种开辟了新的技术途径，对单性育种具有重要意义和应用价值。

附图说明

图1为一种中国大鲵雌性特异adF324片段遗传性别鉴定结果示意图，

图中1-12，25-36为雌性个体都能扩增出231bp特异条带，13-24，37-48表示雄性个体且扩增不出条带，M表示maeker 2000。

图2为一种中国大鲵雌性特异adF225片段遗传性别鉴定结果示意图，

图中1-12，25-36为雌性个体都能扩增出162bp特异条带，13-24，37-48表示雄性个体且扩增不出条带，M表示maeker 2000。

图3为一种大鲵雌性特异片段adF324的核苷酸序列，

“下划线的字符”表示该序列与引物adF324a与adF324s的结合位置。

图4为一种大鲵雌性特异片段adF225的核苷酸序列，

“下划线的字符”表示该序列与引物adF225a与adF225s的结合位置。

具体实施方式

本发明采用基因组测序技术与比较组学筛选出中国大鲵候选雌性特异片段，然后通过PCR筛选验证获得中国大鲵雌性特异片段，建立了中国大鲵遗传性别鉴定技术，解决了大鲵性别鉴定的难题，对大鲵繁殖工作提供巨大帮助，也为后续大鲵单性育种奠定重要基础。

下面通过“一种RAD测序筛选中国大鲵雌性特异片段及遗传性别检测方法”具体实施，结合附图进行仔细说明。

实施例1：

一、中国大鲵雌性特异片段的筛选，包括：1.RAD测序技术扫描大鲵雌雄基因组池与数据分析；2.候选雌性特异片段的验证；3.雌性特异片段的序列分析。

一种RAD测序筛选中国大鲵雌性特异片段及遗传性别检测方法，其步骤是：

A、RAD测序技术扫描大鲵雌雄基因组池与数据分析：利用组织切片技术结合显微镜观察对大鲵表型性别进行鉴定，选取4雌4雄利用酚氯仿法提取基因组DNA，分别进行酶切，建库，测序。对测序获得的数据进行生物信息学分析获得大鲵候选雌雄特异数据，将数据进行组装，进一步获得雌雄特异片段。再将雌性片段与大鲵雄性基因组数据比对获得雌性特异片段308个；

B、候选雌性特异片段的验证：将获得的候选雌性特异片段随机挑选部分根据各自序列设计引物，利用酚氯仿法分别提取5雌5雄基因组DNA并以此为模板进行PCR扩增，1.5%（质量体积比）琼脂糖电泳结果表明雌性个体都有且仅雌性特异性条带，雄性个体都无特异性条带，该标记为大鲵雌性特异标记；

C、雌性特异片段的序列分析：将扩增的特异条带分别克隆到PMD-18T载体，利用常规检测方法检测阳性个体，在ABI3730测序仪（ABI，美国）上进行，将获得的序列进行序列比对，同源性96%以上。将获得的序列在Genebank数据库进行Blastn比对，未发现同源序列。

二、中国大鲵遗传性别鉴定的PCR方法：

根据特异片段adF324和adF225设计引物adF324a，adF324s，adF225a与adF225s，

特异片段adF324的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，adF324的引物序列如下：

adF324a:CTATCGCACTAGGCTACTGGTCAT；

adF324s:ATGCCTCAAAGCAAGGTAGAAAG；

特异片段adF225的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，adF225的引物序列如下：

adF225a：CCATGCCCTGTACATTTGCG；

adF225s：CCGTGAACATGGAGGGGTTT。

利用酚氯仿法提取雌性个体24尾，雄性个体24尾基因组DNA，并对DNA进行琼脂糖电泳检测完整性与纯度，利用NanoDrop 检测DNA 浓度。以雌雄基因组DNA 为模板，进行PCR扩增，反应条件与程序分别如下：PCR反应体系为DNA 50ng；2XPCR mix 12.5μL；上下游引物均为0.4μM，灭菌水补充至25μL；

反应条件如下：

94℃变性5min；随后 94℃变性30s, 59.5℃退火30s, 72℃延伸40s，扩增35个循环，然后72℃延伸5min。能扩增出特异条带为遗传雌性个体，扩增不出特异条带为遗传雄性个体。结果显示两个雌性特异片段在24个雌性个体中都能扩增出雌性特异条带，24个雄性个体都不能扩增出雌性特异条带（图1，图2）。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院长江水产研究所

<120> 一种RAD测序筛选中国大鲵雌性特异片段及遗传性别检测方法

<130> 一种RAD测序筛选中国大鲵雌性特异片段及遗传性别检测方法

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acctttcctg ctaggatcca acctcctccg acagatcact aacctcctga ggtggatctc 180

tcacttcatg tagagaacaa tagccttcct tgaatgacca gtagcctagt gcgatagctc 240

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<213> 中国大鲵

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